豬Toll樣受體研究進(jìn)展

李 鵬 王雅春

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 北京 100193；2.福建順鑫鑫源食品有限公司 福建南平 354004）

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是生物進(jìn)化過程中較為保守的I型跨膜蛋白，也是目前在哺乳動(dòng)物中研究最多的模式識(shí)別受體，可識(shí)別細(xì)菌或病毒 的多種抗原成分，如鞭毛蛋白、脂多糖、病毒RNA等[1-3]。

TLRs作為重要的模式識(shí)別受體，一直受到研究者們的重視，隨著對豬TLRs研究的深入，很多病原的致病機(jī)制、益生菌保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)得到了合理的解釋。另外，豬的TLRs基因中普遍存在非同義單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP），并且主要集中在胞外編碼區(qū)，這在疫苗設(shè)計(jì)上的應(yīng)用也具有重要意義[4]。

1 豬TLRs組織和細(xì)胞分布

目前，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了13種TLRs，其中10種在豬細(xì)胞上得到了克?。═LR1-10）。根據(jù)TLRs在豬體內(nèi)細(xì)胞上的分布及其接頭分子的種類，豬TLRs可分為兩大類：第一類表達(dá)于細(xì)胞表面，主要識(shí)別微生物或其特定成分，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR10[4]；第二類分布在細(xì)胞器膜表面，主要識(shí)別核酸及其衍生物，包括TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9[5-6]。

在不同組織或細(xì)胞上TLRs的表達(dá)水平具有明顯差異[7-8]，免疫相關(guān)的組織或細(xì)胞上的表達(dá)水平相對較高，如脾臟、腸系膜淋巴結(jié)以及與外界環(huán)境接觸的腸和氣管等粘膜組織[9]。在豬生殖系統(tǒng)中不同器官TLRs的表達(dá)水平也明顯不同，如TLR3和TLR5在豬睪丸、附睪、卵巢和輸卵管中表達(dá)水平較高，而TLR9的表達(dá)水平較低，在胚胎中TLR1表達(dá)水平較高[10]。另外，TLRs在細(xì)胞上的表達(dá)水平還與豬的品種、生長日齡及飼料種類有關(guān)，如大多數(shù)TLRs在藏豬細(xì)胞上的表達(dá)量顯著多于約克夏豬，且隨著豬日齡的增長其表達(dá)量也隨之增加[11]；成年豬腸系膜淋巴結(jié)TLR1和TLR6、胃TLR3的表達(dá)量顯著高于新生仔豬；在12周齡的豬體內(nèi)，約克夏豬和藏豬脾臟、血液、胸腺的TLR5及其脾臟的TLR6、TLR7，約克夏豬脾臟的TLR3、TLR4，藏豬扁桃體的TLR9均具有較高的表達(dá)水平[11]；蘆薈多糖可以提高豬肝臟和脾中TLR2和TLR4的表達(dá)水平，這有助于提高斷奶仔豬的免疫功能[12]。這些TLRs表達(dá)差異可能與豬的抗病能力密切相關(guān)。

2 豬TLRs的進(jìn)化分析

通過物種間進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物TLRs可大致分為6組，且豬與人的TLRs進(jìn)化關(guān)系比較接近，見圖 1。 TLR1、TLR2 和 TLR6（也包含 TLR10，但其配體尚不明確）為一組，主要識(shí)別革蘭氏陽性菌的復(fù)合物，TLR1、TLR6和 TLR10與TLR2來源于同一分支[13]，而 TLR1、TLR6（可能包含 TLR10）與 TLR2形成二聚體發(fā)揮作用[14-15]。與其它TLRs相比，TLR3、TLR4、TLR5在進(jìn)化上比較特殊，分別各為一組，TLR4主要識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖成分，TLR3、TLR5分別識(shí)別不同病毒或細(xì)菌的抗原組分[16]。TLR7、TLR8和TLR9分為一組，主要分布在宿主細(xì)胞的細(xì)胞器膜上，在病毒成分的識(shí)別上發(fā)揮主要作用。鼠TLR11、TLR12和TLR13在人和偶蹄獸動(dòng)物中還沒有發(fā)現(xiàn)，其中TLR11主要識(shí)別非病原菌，TLR12和TLR13還沒找到相應(yīng)的配體[17]。

3 豬TLRs各家族成員研究現(xiàn)狀

圖1 哺乳動(dòng)物TLRs進(jìn)化樹

入侵的細(xì)菌、病毒等微生物或其特定成分被TLRs識(shí)別后，TLRs下游信號(hào)通路將被激活，進(jìn)而上調(diào)促炎細(xì)胞因子或干擾素的表達(dá)[4]（見圖2）。髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）是TLR信號(hào)通路中一個(gè)重要的接頭分子，根據(jù)TLR信號(hào)通路對MyD88的依賴性，TLRs信號(hào)通路分為兩種：MyD88-dependent和 MyD88-independent signaling pathways，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[13]。

3.1 TLR1、TLR2和TLR6 它們在進(jìn)化關(guān)系上比較接近，且TLR2與TLR1或TLR6形成異質(zhì)二聚體發(fā)揮功能，參與識(shí)別多種抗原分子，如革蘭氏陽性菌的肽聚糖和脂磷壁酸、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖、錐形蟲的糖基磷脂酰肌醇以及酵母或其它真菌的酵母多糖[18]。有研究表明受體和配體的相互作用能有效促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞識(shí)別抗原的能力，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的吞噬及下游信號(hào)通路過程，豬TLR2就發(fā)揮這種受體功能，可高效促進(jìn)豬抗原遞呈細(xì)胞識(shí)別并吞噬詹氏乳酸桿菌[19]?？贵w封閉豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs）TLR2 和 TLR6可顯著降低豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）誘導(dǎo)的TNF-α的表達(dá)水平，說明豬 TLR2和TLR6在宿主識(shí)別和抵御M.hyopneumoniae感染中起重要作用。真菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）可破壞腸上皮細(xì)胞的屏障保護(hù)功能，可能還與腸道炎癥有關(guān)，而豬腸上皮細(xì)胞的TLR2相關(guān)信號(hào)通路可抑制DON對腸道粘膜屏障的破壞[20]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）CRL1505可以通過TLR2信號(hào)通路提高Th1型免疫反應(yīng)，上調(diào)豬腸上皮細(xì)胞IL-6和TNF-α的表達(dá)[21]。

3.2 TLR4 TLR4在豬各種組織中廣泛存在，主要識(shí)別革蘭氏陽性菌的LPS或脂質(zhì)A，可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子的分泌，在抵抗革蘭氏陽性菌的感染上發(fā)揮重要作用，然而LSP過度上調(diào)促炎因子的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。用LPS刺激豬小腸上皮細(xì)胞可顯著上調(diào)TLR4和炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，說明在豬體內(nèi)TLR4及其相關(guān)信號(hào)通路參與了LPS引起的炎癥反應(yīng)[22]。嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）是一種非常重要的益生菌，可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，有效抑制腸道不良微生物的繁殖，研究發(fā)現(xiàn)L.acidophilus可通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路降低豬外周血淋巴細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平緩解LPS引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而增加豬日進(jìn)食量和日增重[23]。另外，豬TLR4可能還在抗病毒感染中起作用，如圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可上調(diào)TLR4的表達(dá)水平，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，上調(diào)相關(guān)抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)[24]。

3.3 TLR5 TLR5特異地識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白，被激活后可誘導(dǎo)下游復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，通過NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)促炎細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)。通過單核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)民豬（Min pig）TLR5含有4個(gè)非同義單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點(diǎn)，分別為 c.176C＞T（p.R59M）、c.902C＞T（p.S301F）、c.959T＞A（p.F320Y）和 c.1796C＞T（p.T599M，reference sequence:GenBank No.AB208697），其中 SNP c.1796C＞T（p.T599M）位于TLR5胞外區(qū)的一個(gè)N端糖基化位點(diǎn)編碼區(qū)域，豬TLR5 SNPs可能與細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白的能力密切相關(guān)[25]。

圖2 TLRs誘導(dǎo)的不同信號(hào)通路示意圖

3.4 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9TLR3、TLR7、TLR8和TLR9分布在細(xì)胞器膜表面，主要通過上調(diào)抗病毒細(xì)胞因子I型干擾素（IFN-α/β）的表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用。TLR3可識(shí)別病毒雙鏈RNA，在PAMs中TLR3在識(shí)別病毒RNA上起著重要作用；TLR7和TLR8識(shí)別單鏈RNA；TLR9識(shí)別非甲基化CpG DNA，這種核酸基序一般存在于細(xì)菌的基因組DNA中，也存在于病毒基因組中，如單純皰疹病毒2型[26]。病毒核酸被相應(yīng)的TLRs識(shí)別后，下游的轉(zhuǎn)錄因子（包括IRF1、IRF3和IRF7）被激活，從而上調(diào)IFN-α/β的表達(dá)水平。如 H3N2豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）可 顯 著 提 高 PAMs 中TLR3、TLR7 的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào) IFN-α 的表達(dá)[27]；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）可顯著上調(diào)TLR3、TLR7和TLR8的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo) IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 的分泌[28]。氧化劑和抗氧化劑可有效干預(yù)PRRSV對TLR3/NF-κB信號(hào)通路的激活，提示該信號(hào)通路的激活可能是通過細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制調(diào)節(jié)的[29]。然而目前很多研究表明PRRSV感染可下調(diào)宿主細(xì)胞IFN-α/β的表達(dá)，其分子機(jī)制也得到初步研究：PRRSV可阻止雙鏈RNA或仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IRF3磷酸化及核轉(zhuǎn)位過程[30]，與PCV2聯(lián)合感染可抑制TLR3、 TLR7 和 TLR9 的表達(dá)[31]，進(jìn)而抑制 IFN-α/β的表達(dá)。在腎臟的冷藏過程中，caspase-3小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）灌注腎動(dòng)脈可有效保存腎臟的活性，然而將此方法用于處理豬自體移植腎臟時(shí)，腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，不能起到很好的保存效果，通過western blotting和quantitative PCR檢測發(fā)現(xiàn)，caspase-3 siRNA可上調(diào)豬自體移植腎臟TLR3、TLR7及其接頭分子TRIF和MyD88的表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)促炎細(xì)胞因子 IL-1、IL-6、TNF-α 和 IFN-α/β 的表達(dá)[32]。

4 總結(jié)與展望

TLRs是宿主識(shí)別入侵病原微生物的重要模式識(shí)別受體，同時(shí)也與自身免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)及自身免疫病密切相關(guān)。因此，需要更加深入地了解TLRs在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用，以TLRs為靶標(biāo)探索解決機(jī)體免疫失衡的方法。目前在藥物或病理研究方面，活體動(dòng)物模型主要以小鼠為主[33]，但是鼠和人的TLRs在功能上還存在較大的差異，比如用脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）處理小鼠和人的星狀膠質(zhì)細(xì)胞，其TLR4發(fā)揮著不同的功能[34]，這說明小鼠動(dòng)物模型在人TLRs研究方面不能提供充分的數(shù)據(jù)。然而有證據(jù)顯示豬的TLRs在功能上與人更接近[35]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在人的某些傳染病和自然免疫病方面，豬可以作為較好的動(dòng)物模型。因此，對豬TLRs深入系統(tǒng)地研究可為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展和人類疾病研究提供重要參考。