非洲豬瘟疫苗研究趨勢(shì)

陳江華 陳文智 梁旺旺 豐志華

（福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建省天然免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350117）

非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬唯一成員，是唯一的蟲(chóng)媒雙鏈DNA病毒[1-2]，鈍緣蜱屬的節(jié)肢類(lèi)動(dòng)物為ASFV自然宿主和傳播媒介[3-4]。自然宿主感染該病毒后無(wú)并發(fā)癥，隨后發(fā)展為持續(xù)性感染[5]，家豬自然條件下感染ASFV后經(jīng)過(guò)3～5 d的潛伏期，開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，10～14 d內(nèi)死亡，死亡率可達(dá)100%[6-7]。ASFV成熟病毒顆粒具有多層結(jié)構(gòu)，直徑約200 nm，其衣殼為二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，基因組大小為170～193 kb，有150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框，可編碼54種結(jié)構(gòu)蛋白、100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，基因組差異主要源于多基因家族（MGFs）成員的拷貝數(shù)不同[8-11]。按其mRNA的累積動(dòng)力學(xué)分析，ASFV基因可分為立早期基因、早期基因、中期基因及晚期基因；中期基因的存在說(shuō)明其基因表達(dá)受到嚴(yán)密調(diào)控[12-13]。ASFV編碼的多種蛋白可抑制干擾素的表達(dá)，參與病毒免疫逃逸過(guò)程，但大多數(shù)蛋白功能未知[14]。目前認(rèn)為ASFV主要通過(guò)巨胞飲及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用侵染宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，但介導(dǎo)病毒與細(xì)胞相結(jié)合的受體還未發(fā)現(xiàn)[15-16]。

1921年ASF首次在肯尼亞報(bào)道[17]，疫情于2007年傳入俄羅斯等地區(qū)，隨后傳入烏克蘭（2012年）、白俄羅斯（2013 年）、立陶宛（2014 年）、羅馬尼亞（2017年）、匈牙利及中國(guó)（2018）[7,18]。ASFV 可分為 24 種基因型、8種血清型[18-19]，撒哈拉以南非洲地區(qū)存在所有基因型，只有基因型Ⅰ和基因型Ⅱ傳播到非洲以外地區(qū)[20]。ASFV基因型Ⅰ在1957年和1960年傳播到伊比利亞半島，后來(lái)侵入其他一些歐洲國(guó)家、加勒比地區(qū)和巴西，并仍留在撒丁島?；蛐廷蛟?007年從東非傳播到高加索地區(qū)，然后迅速傳播并在整個(gè)俄羅斯聯(lián)邦和東歐的一些國(guó)家蔓延[20]。不同毒株之間毒力存在著差異，中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)與分離的ASFV為基因型Ⅱ型、血清型8型[18-21]。Ⅱ型ASFV具有高毒力并誘導(dǎo)產(chǎn)生急性ASF病癥，致死率接近100%[7,22-23]。目前，ASF有全球蔓延之勢(shì)，針對(duì)ASF沒(méi)有商品化疫苗，對(duì)于疫情只能被動(dòng)防控（撲殺），不能主動(dòng)預(yù)防，其對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)是災(zāi)難性的，給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，研發(fā)用于預(yù)防ASF的疫苗迫在眉睫。近年來(lái)隨著基因編輯技術(shù)與DNA測(cè)序及合成技術(shù)的發(fā)展，加快了非洲豬瘟疫苗研發(fā)的進(jìn)程，研發(fā)針對(duì)預(yù)防非洲豬瘟的疫苗有滅活苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒載體疫苗等?，F(xiàn)對(duì)ASF疫苗研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對(duì)ASF疫苗的研發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗及弱毒活疫苗

早期研究主要聚焦于滅活疫苗的研制，F(xiàn)ORMAN等[24]用戊二醛與洗滌劑分別處理ASFV侵染后的豬肺泡巨噬細(xì)胞并用于免疫，攻毒后發(fā)現(xiàn)戊二醛處理組有更快的血清學(xué)反應(yīng)及病毒血癥有所減輕，洗滌劑處理組未觀察到明顯的血清學(xué)反應(yīng)且針對(duì)同源病毒的攻擊也不具有保護(hù)作用。STONE等[25]用乙酰氮丙啶和縮水甘油醛處理制備的ASF滅活疫苗免疫后可產(chǎn)生抗體，但不能抵御ASFV的攻擊。新型佐劑也未能增強(qiáng)滅活疫苗的保護(hù)效果，BLOME等[26]分別用佐劑PolygenTM與配伍滅活的ASFV亞美尼亞08株免疫小豬，免疫后小豬可產(chǎn)生特異性抗體，但用同源毒株攻擊，發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗免疫后并不能提供保護(hù)作用，且免疫組攻毒后更早出現(xiàn)臨床癥狀。目前，滅活苗的研制都以失敗告終，關(guān)于ASF滅活疫苗的研究也較少報(bào)道。

大多數(shù)病毒經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可致弱，ASFV也不例外。MANSO等[27]將細(xì)胞傳代致弱的病毒接種家豬后并未引起家豬死亡，且可抵御強(qiáng)毒攻擊。隨后進(jìn)行免疫接種，但接種后約有23%的豬出現(xiàn)了臨床癥狀以及部分豬出現(xiàn)死亡。TITOV等[28]用經(jīng)細(xì)胞傳代致弱獲得的KK262株免疫小豬后再用同源毒株K49株（基因型Ⅰ，血清型2）攻擊，發(fā)現(xiàn)免疫后小豬并不能抵御野生型K49株的攻擊?？梢?jiàn)，經(jīng)細(xì)胞傳代致弱的ASFV毒力不穩(wěn)定，接種后易反強(qiáng)或免疫原性差，強(qiáng)毒攻擊后最終導(dǎo)致慢性感染及死亡。但相關(guān)研究表明弱毒活疫苗仍可抵御強(qiáng)毒攻擊，如OURT88/3 株[29-30]。KING 等[30]用 OURT88/3 株免疫小豬后再用強(qiáng)毒株OURT88/1加強(qiáng)免疫，最后用強(qiáng)毒株烏干達(dá)1965分離株（基因型X）及Benin 97/1（基因型Ⅰ）攻擊，發(fā)現(xiàn)OURT88/3株免疫后可抵御強(qiáng)毒株OURT88/1、烏干達(dá)1965分離株及Benin 97/1的攻擊。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)OURT88/3株與強(qiáng)毒株對(duì)比缺失了約10 kb的基因序列，該序列的丟失導(dǎo)致多基因家族（MGF360、MGF505、MGF530）大多數(shù)基因 缺失，這些基因與ASFV免疫逃逸相關(guān)，該片段缺失加強(qiáng)了Ⅰ型干擾素的反應(yīng)強(qiáng)度[31-33]。O'DONNELL等[34-35]將多基因家族MGF360與MGF505的MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R以及 MGF505-3R刪除后獲得ASFV-G ΔMGF株，用該毒株免疫小豬后以強(qiáng)毒株ASFV-G攻擊顯示ASFV-GΔMGF株具有良好的保護(hù)能力；但在ASFV-G-△MGF基礎(chǔ)上再刪除9GL后獲得的ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF疫苗株不具保護(hù)作用。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是弱毒活疫苗研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)，其應(yīng)用加快了ASFV弱毒疫苗的研發(fā)進(jìn)程，BORCA等通過(guò)該技術(shù)構(gòu)建了ASFV弱毒株（ASFV-G/Δ8-DR），但未進(jìn)行免疫攻擊試驗(yàn)。其他弱毒株有 ASFV-G-Δ9GL/ΔUK、Benin ΔDP148R、Pret4 Δ9GL、NHV/P68、OURT88/3 ΔDP2 及 Ba71 ΔCD2v、ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK 等[34-51]，不同弱毒株之間其保護(hù)能力也各不相同，除了與所缺失基因不同外還與基因型相關(guān)（見(jiàn)表1）。目前，弱毒活疫苗仍是研究熱點(diǎn)與重點(diǎn)，國(guó)內(nèi)已構(gòu)建MGF360-MGF505R缺失弱毒株及MGF360-MGF505R與CD2v基因缺失弱毒株（原始毒株P(guān)ig/HLJ/18[21]）但未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。

2 亞單位疫苗及核酸疫苗

非洲豬瘟病毒 p12、p30、p54、p72、CD2v 等結(jié)構(gòu)蛋白為亞單位疫苗以及核酸疫苗研究的熱點(diǎn)[52-58]（見(jiàn)表2），這些亞單位疫苗及核酸疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但大多數(shù)疫苗并不能提供很好的保護(hù)，且有些疫苗保護(hù)效果還有待驗(yàn)證。LACASTA等[56]將p30、p54及血凝素胞外結(jié)構(gòu)域與泛素融合表達(dá)構(gòu)建的核酸疫苗免疫小豬后，保護(hù)率為33%。隨后LACASTA等構(gòu)建表達(dá)除p30、p54及血凝素在內(nèi)的ASFV所有ORF的質(zhì)粒（4 029個(gè)）并用于免疫攻擊試驗(yàn)，保護(hù)率為60%且觀察到25%（2/8）的小豬在任何階段無(wú)排毒現(xiàn)象，但這是否由疫苗免疫導(dǎo)致還有待驗(yàn)證。有研究表明，攻毒后存活小豬不排毒并不是疫苗免疫導(dǎo)致，而是ASFV不能在幸存豬中長(zhǎng)期潛伏及排毒[23]。SUN-YOUNG等[57]用表達(dá)CD2v、p72、p32、±p17 的質(zhì)粒以及重組蛋白 p15、p35、p54、±p17免疫小豬后可產(chǎn)生特異性抗體，但以強(qiáng)毒株亞美尼亞2007株進(jìn)行攻擊后發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組免疫組小豬在攻毒后出現(xiàn)更早的臨床癥狀、病毒血癥及死亡，表明核酸疫苗及亞單位疫苗免疫后產(chǎn)生的特異性抗體并不能中和病毒且增強(qiáng)了ASFV的感染，提示在核酸疫苗及亞單位疫苗研究中選擇更多的抗原免疫并不一定能取得更好的效果，選擇合適的抗原組合是關(guān)鍵。由于ASFV結(jié)構(gòu)蛋白眾多，單靠幾種結(jié)構(gòu)蛋白免疫機(jī)體難以提供較為全面的保護(hù)。因此，表達(dá)ASFV蛋白所制備的亞單位疫苗或者可表達(dá)幾種蛋白組合的核酸疫苗及重組疫苗的研究有待進(jìn)一步探索。

表1 ASFV弱毒活疫苗

3 病毒載體疫苗及復(fù)制缺陷型疫苗

腺病毒與痘病毒常被作為載體將外源基因遞送到機(jī)體表達(dá)相關(guān)蛋白，使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)用于抵抗病毒的入侵[59-62]。LOKHANDWALA等[61,63]將ASFV的多種基因經(jīng)腺病毒載體導(dǎo)入機(jī)體表達(dá) （見(jiàn)表3），以 “雞尾酒”式免疫可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，因此，其猜測(cè)通過(guò)腺病毒將ASFV相關(guān)基因遞送到機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)能有效抵抗ASFV的侵染。但其作為疫苗的有效性還需進(jìn)行免疫攻擊試驗(yàn)加以驗(yàn)證。 LOPERAMADRID 等[62]以重組 B646L（P72）、EP153R和EP402R（CD2v）的痘苗病毒為載體免疫小豬，并不能誘導(dǎo)抗體應(yīng)答但能誘發(fā)IFNγ的表達(dá)。研究表明，細(xì)胞免疫應(yīng)答在ASFV免疫保護(hù)中扮演重要角色，CD8+T細(xì)胞的耗竭消除了OURT88/3株免疫后提供的保護(hù)作用[64]。NETHERTON C L等[65]篩選出能被T細(xì)胞識(shí)別并可激活細(xì)胞免疫的抗原蛋白 由 B646L、MGF110-5L、CP204L、CP530R、I73R、I215L、A151R、C129R、E146L 等基因 （來(lái)自 ASFV OURT88/3株）編碼，隨后將這些基因插入到腺病毒載體與牛痘病毒載體中進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)免疫后可激活細(xì)胞免疫及體液免疫，但用強(qiáng)毒株OURT88/1攻擊后并未顯示這些病毒載體疫苗具有保護(hù)作用，僅降低部分免疫豬病毒血癥。CHEN X等[66]將ASFV p72基因通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)插入到新城疫病毒基因組中構(gòu)建了rNDV/p72重組毒株，用該毒株免疫小鼠后可產(chǎn)生特異性抗體并引起T細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-4的分泌，其認(rèn)為該毒株可作為預(yù)防ASFV的候選疫苗株，但未進(jìn)行免疫攻擊試驗(yàn)，其保護(hù)效果還有待確定?？梢?jiàn)病毒載體疫苗激活免疫應(yīng)答的能力因其攜帶的基因不同而存在差異，且大多數(shù)疫苗保護(hù)效果還有待驗(yàn)證。

表2 ASFV亞單位疫苗及核酸疫苗

表3 病毒載體疫苗

復(fù)制缺陷型疫苗目前還無(wú)相關(guān)報(bào)道，其不具復(fù)制能力但最大程度保留了完整病毒顆粒所具有的免疫原性，相比弱毒活疫苗其免疫動(dòng)物后不會(huì)產(chǎn)生排毒以及毒力反強(qiáng)等免疫副作用，是一種理想的疫苗。雖然復(fù)制缺陷型疫苗還未見(jiàn)報(bào)道，但已有相關(guān)的基因缺失毒株（BA71）被申請(qǐng)專(zhuān)利，如 PP220、pp62和pB438L基因缺失毒株[67]。

4 ASF疫苗研發(fā)瓶頸

ASF疫苗研發(fā)瓶頸主要體現(xiàn)在以下幾方面：（1）ASFV基因型眾多，所研發(fā)的疫苗交叉保護(hù)能力差，只能針對(duì)同源或者幾種非同源病毒具有保護(hù)作用。（2）大多數(shù)ASFV在常見(jiàn)的細(xì)胞系如ST、Vero中不能增殖，只有少數(shù)幾種毒株如Ba71 V或Georgia 07等可在Vero細(xì)胞中增殖，其他毒株只能通過(guò)豬單核-巨噬細(xì)胞或者網(wǎng)狀-內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行增殖且產(chǎn)量低[68-70]。 （3）ASFV 基因組龐大，多數(shù)基因功能未知，且編碼的許多蛋白具有免疫抑制作用，可協(xié)助病毒的免疫逃逸以利于病毒的復(fù)制與擴(kuò)散[20,71]。（4）疫苗免疫后可產(chǎn)生特異性抗體但并不能抵抗病毒入侵，即產(chǎn)生的抗體并非中和抗體。（5）ASFV可在單核巨噬細(xì)胞中大量增殖，而單核巨噬細(xì)胞在抗原呈遞、誘導(dǎo)T細(xì)胞活化及激活啟動(dòng)免疫應(yīng)答等方面具有重要作用，ASFV對(duì)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞無(wú)疑會(huì)削弱豬的免疫力，促進(jìn)病毒感染。

5 總結(jié)與展望

目前，針對(duì)ASF沒(méi)有疫苗預(yù)防，疫情仍然時(shí)有暴發(fā)。根據(jù)目前疫苗研究現(xiàn)狀可知，滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗免疫后保護(hù)能力極差甚至無(wú)保護(hù)作用。病毒載體疫苗需多次免疫或以“雞尾酒”式免疫或可取得一定免疫效果，且多數(shù)病毒載體疫苗保護(hù)效果有待驗(yàn)證。弱毒活疫苗保護(hù)效果參差不齊，自然致弱毒株毒力不穩(wěn)定、易反強(qiáng)，人為致弱毒株保護(hù)效果因不同基因缺失其保護(hù)效果也不同，但總體優(yōu)于滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗。復(fù)制缺陷型疫苗的研發(fā)還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，其免疫保護(hù)效果未知，但其安全性好，不存在毒力反強(qiáng)現(xiàn)象，研發(fā)該類(lèi)疫苗也是研發(fā)ASF疫苗的一個(gè)突破方向。對(duì)于弱毒活疫苗的構(gòu)建，應(yīng)當(dāng)針對(duì)與免疫抑制相關(guān)基因如MGF360 成員、MGF505 成員、DP96R、CD2v、DP148R、9GL 等基因的刪除，但 9GL、MGFs、TK、NL等基因不宜同時(shí)剔除，以免降低疫苗免疫原性導(dǎo)致免疫后不能提供保護(hù)。

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展，可針對(duì)ASFV特定基因進(jìn)行刪除，構(gòu)建弱毒株及復(fù)制缺陷型毒株或定點(diǎn)敲除某個(gè)基因構(gòu)建重組疫苗株，該技術(shù)將加快ASF弱毒活疫苗、復(fù)制缺陷型疫苗及重組疫苗的研發(fā)。隨著基因合成技術(shù)的發(fā)展，可構(gòu)建全基因組敲除文庫(kù)，應(yīng)用全基因組敲除文庫(kù)可篩選出ASFV宿主依賴(lài)因子及互作蛋白，針對(duì)這些因子及蛋白可設(shè)計(jì)相應(yīng)多肽類(lèi)、小分子化合物類(lèi)以及篩選出天然抗病毒藥物等。cGAS-STING通路的發(fā)現(xiàn)，揭示了cGAMP作為第二信使可與其接頭蛋白STING結(jié)合并激活下游信號(hào)，可激活Ⅰ型干擾素的表達(dá)[72-74]，由于ASFV多個(gè)蛋白如MGF360/505家族、DP96R與EP153R等可抑制宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產(chǎn)生，調(diào)控細(xì)胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號(hào)通路[20]，若將cGAMP作為新型疫苗佐劑可逆轉(zhuǎn)ASFV對(duì)干擾素表達(dá)的抑制，從而可加強(qiáng)機(jī)體的抗病毒反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗免疫效果。鑒于目前ASF疫苗研發(fā)的進(jìn)展，不難發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗保護(hù)能力優(yōu)于滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗，弱毒活疫苗極有可能成為第一個(gè)用于預(yù)防非洲豬瘟疫情的疫苗類(lèi)型。