體外人工感染的刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)的電鏡觀察

沈 晨, 周旻曦, 周素明, 王國(guó)良

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

體外人工感染的刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)的電鏡觀察

沈 晨, 周旻曦, 周素明, 王國(guó)良

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

通過(guò)透射和掃描電鏡等研究刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段發(fā)育特征。從患病的大黃魚(yú)上采集各個(gè)時(shí)期的包囊，體外感染傳代培養(yǎng)收集幼蟲(chóng)，制成電鏡樣品，研究幼蟲(chóng)的超微結(jié)構(gòu)。對(duì)不同時(shí)間段的脫包后幼蟲(chóng)的電鏡和光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，脫包后0～4 h的幼蟲(chóng)蟲(chóng)體，細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整，周身遍布體纖毛，于培養(yǎng)液中快速游動(dòng)；8～16 h時(shí)，幼蟲(chóng)體纖毛逐漸減少，游動(dòng)緩慢，細(xì)胞胞質(zhì)稀薄，幼蟲(chóng)長(zhǎng)徑縮短；20～24 h時(shí)，體纖毛稀少，幼蟲(chóng)不運(yùn)動(dòng)沉底，細(xì)胞形狀由淚滴形變?yōu)椴灰?guī)則并開(kāi)始凋亡，蟲(chóng)體明顯萎縮，長(zhǎng)徑僅10 μm左右。在不同時(shí)段的幼蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征與感染活性喪失過(guò)程相關(guān)聯(lián)，反映能量衰減可能是影響刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染能力的主要原因。

刺激隱核蟲(chóng)；感染力；人工感染；超微結(jié)構(gòu)

刺激隱核蟲(chóng)(Cryptocaryonirritans)又名海水小瓜蟲(chóng)，隸屬于前口綱(Class Prostomatea)，前管目(Order Proreodonisa)，隱核蟲(chóng)科(Family Cryptocaryonidae)的隱核蟲(chóng)屬(Genuscryptocaryon)[1]。最早被日本學(xué)者Sikama[2]研究報(bào)道。刺激隱核蟲(chóng)常寄生于海水硬骨魚(yú)類體表的上皮組織中，導(dǎo)致白點(diǎn)病的發(fā)生[3]。一旦海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類發(fā)病，就會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)貪O業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重大損失[4]。

在刺激隱核蟲(chóng)超微結(jié)構(gòu)研究方面，1981年Cheung[5]采用掃描電鏡研究了刺激隱核蟲(chóng)的包囊以及滋養(yǎng)體，其中詳實(shí)地描述了滋養(yǎng)體口器的觀察，而未對(duì)幼蟲(chóng)階段進(jìn)行研究。徐潤(rùn)林等[6]和Xu等[7]分別研究了刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)的口器和包囊壁結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)。Colorni和Diamont[8]對(duì)刺激隱核蟲(chóng)不同發(fā)育期蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。Matthews[9]首次使用透射電鏡對(duì)刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)階段進(jìn)行描述。黃瑋等[10]對(duì)人工感染的刺激隱核蟲(chóng)的皮層和口器進(jìn)行詳細(xì)地描述。上述文獻(xiàn)雖對(duì)刺激隱核蟲(chóng)各階段結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了研究，但未探討幼蟲(chóng)24 h內(nèi)失去感染力的原因。本實(shí)驗(yàn)參考但學(xué)明[11]以卵形鯧鲹(Trochintuovatus)為宿主建立的刺激隱核蟲(chóng)傳代系統(tǒng)，稍加改進(jìn)后選擇養(yǎng)殖大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)作為宿主。通過(guò)人工感染和傳代的方法收集幼蟲(chóng)，對(duì)其進(jìn)行較為系統(tǒng)地超微結(jié)構(gòu)觀察，以探索刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染力喪失的原因，為驅(qū)殺該蟲(chóng)的時(shí)機(jī)和防治白點(diǎn)病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)體來(lái)源

大黃魚(yú)樣本分批采自寧波市象山養(yǎng)殖海區(qū)和福建省寧德養(yǎng)殖海區(qū)，并按照但學(xué)明[11]的方法選取患病大黃魚(yú)。剪下鰓片，放入含過(guò)濾海水的培養(yǎng)皿中，用載玻片刮下滋養(yǎng)體，用吸管將長(zhǎng)徑大于400 μm的滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)移至9 cm培養(yǎng)皿中，加入25‰的滅菌海水，25℃黑暗中培育。

1.2 蟲(chóng)體的感染及不同時(shí)期幼蟲(chóng)的收集

待刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)從包囊中孵出后，收集幼蟲(chóng)。以每尾魚(yú)用大約20 000個(gè)幼蟲(chóng)，感染體重250 g左右的大黃魚(yú)2 h，之后放入海水網(wǎng)箱中養(yǎng)殖。每天檢查魚(yú)體和鰓表面，待白點(diǎn)充分顯現(xiàn)后，將魚(yú)放到特制的收蟲(chóng)漏斗中暫養(yǎng)過(guò)夜。最后取下收蟲(chóng)漏斗下的收蟲(chóng)杯，即可從中收獲大量的包囊。在包囊脫包后放出幼蟲(chóng)高峰期(即收集包囊后第3天的晚上)，更換培養(yǎng)液，然后將收集的活躍幼蟲(chóng)同步分成若干份，分別在0、4、8、12、16、20和24 h用0.2%福爾馬林殺死幼蟲(chóng)，于4000 r/min離心5 min 收集蟲(chóng)體。

1.3 透射電鏡樣品制備

用3 %戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液)固定幼蟲(chóng)1 h以上(4℃)。將樣品用磷酸緩沖液洗滌2次，每次15 min。之后酒精逐級(jí)脫水，然后樹(shù)脂包埋(幼蟲(chóng)包埋之前，需進(jìn)行離心濃縮)，超薄切片，再用檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色。透射電鏡下觀察、拍照及記錄。

1.4 掃描電鏡樣品制備

用3 %戊二醛(0.1 mol/L 磷酸緩沖液)固定幼蟲(chóng)1 h(4℃)。之后用酒精逐級(jí)脫水(每次脫水均需進(jìn)行離心濃縮)，臨界點(diǎn)干燥，噴金。掃描電鏡下觀察、拍照及記錄。

1.5 幼蟲(chóng)形態(tài)大小測(cè)量

分別取各時(shí)段幼蟲(chóng)10條，測(cè)量長(zhǎng)徑和短徑，統(tǒng)計(jì)數(shù)值取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)脫包后形態(tài)變化過(guò)程的顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)觀察

幼蟲(chóng)在光鏡下呈卵圓形或淚滴狀，長(zhǎng)徑約50 μm，短徑約20 μm，全身布滿纖毛。脫包后0～4 h的幼蟲(chóng)蟲(chóng)體，在光鏡下清晰可見(jiàn)隨著周身纖毛的擺動(dòng)，蟲(chóng)體于培養(yǎng)液中快速游動(dòng)，此時(shí)幼蟲(chóng)感染力最強(qiáng)；脫包后8～16 h時(shí)，幼蟲(chóng)蟲(chóng)體纖毛逐漸減少，游動(dòng)緩慢，感染力開(kāi)始減弱；脫包后20～24 h，只有少部分蟲(chóng)體仍在運(yùn)動(dòng)，大部分幼蟲(chóng)沉于培養(yǎng)板底部，并可見(jiàn)周身纖毛大量減少，感染力喪失。

圖1 刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)脫包0～4 h亞顯微觀察

1：幼蟲(chóng)口器及纖毛的透射電鏡(剛脫包)，示口纖毛(OC)、黏液囊(Mu)、質(zhì)膜小泡(PA)；2：整個(gè)幼蟲(chóng)掃描電鏡(剛脫包)，示體纖毛；3：示雙動(dòng)基口纖毛(4 h)；4：示幼蟲(chóng)橫切面(4 h)，口肋(OR)

幼蟲(chóng)全身密被單動(dòng)基體纖毛(圖1-2)，分為縱向平行排列的體纖毛和環(huán)向排列的口纖毛(圖1-2、3)。胞口(oralrib)從幼蟲(chóng)的前部頂端延伸至后腹部，整個(gè)口肋位于前端偏腹側(cè)，呈縫隙狀(圖1-4) 。幼蟲(chóng)有3 層外膜，由內(nèi)向外分別是內(nèi)泡膜(inner alveolar membrane)、外泡膜(outer alveolarmembrane) 和外限制膜(outer limiting membrane)。內(nèi)泡膜在質(zhì)膜小泡的內(nèi)側(cè)，質(zhì)膜小泡凸出于質(zhì)膜表面且內(nèi)部充滿電子致密物質(zhì)(圖1-1)，兩排質(zhì)膜小泡之間的細(xì)胞膜凹下呈犁溝狀，縱行的纖毛即從此犁溝內(nèi)長(zhǎng)出來(lái)(圖1-1)。外泡膜襯于外限制膜之下，外限制膜覆蓋整個(gè)蟲(chóng)體、口囊、纖毛和細(xì)胞表面內(nèi)陷部分。

幼蟲(chóng)脫包后0～4 h：從掃描電鏡可以看出幼蟲(chóng)蟲(chóng)體全身遍布體纖毛(圖1-2)并且較為濃密，而且這一時(shí)期幼蟲(chóng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較完整，細(xì)胞中含有較多顆粒狀胞質(zhì)比如高爾基體、伸縮泡、線粒體和共生細(xì)菌，幼蟲(chóng)胞質(zhì)中還含少量的脂肪顆粒 (圖1-1)。

幼蟲(chóng)脫包后8～16 h：纖毛不斷脫落導(dǎo)致體纖毛數(shù)量明顯減少(圖2-5、7)。此時(shí)幼蟲(chóng)長(zhǎng)徑約為20～30 μm。透射電鏡圖顯示其細(xì)胞胞質(zhì)變的稀薄(圖2-5)，電子致密物質(zhì)減少，但口器清晰可見(jiàn)，口纖毛依然茂密(圖2-6、7)。

圖2 刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)脫包8～16 h亞顯微觀察

5：幼蟲(chóng)胞質(zhì)稀薄(16 h)，單動(dòng)基體纖毛(SC)；6：口器橫切面(8 h)；7：幼蟲(chóng)掃描電鏡(12 h)，示體纖毛已逐漸脫落

幼蟲(chóng)脫包后20～24 h：幼蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)生顯著變化。體纖毛和口纖毛幾乎完全脫落，露出一列一列的毛基體。細(xì)胞大小也發(fā)生了變化，嚴(yán)重緊縮，平均長(zhǎng)徑僅10 μm左右，體型變得更為修長(zhǎng)。細(xì)胞膜變松弛，細(xì)胞形狀由淚滴形變得不規(guī)則，細(xì)胞器幾乎完全凋亡，形成許多凋亡小體(圖3-8、9、10、11)。

3 討論

若想系統(tǒng)地研究刺激隱核蟲(chóng)，能夠適時(shí)獲得足量的寄生蟲(chóng)材料是非常必要的，但要想從自然界穩(wěn)定地獲得樣本卻非常困難，發(fā)病的時(shí)間和地點(diǎn)，及其采樣的客觀條件都直接制約著獲取樣本的數(shù)量。曾經(jīng)有學(xué)者試圖在實(shí)驗(yàn)室里用其他海水魚(yú)類作為宿主培育寄生蟲(chóng)，但由于某些海水魚(yú)類飼養(yǎng)的復(fù)雜性而存在著某些缺陷，導(dǎo)致最終的寄生蟲(chóng)產(chǎn)量較低。本研究建立的以大黃魚(yú)為宿主的傳代系統(tǒng)有諸多優(yōu)點(diǎn)：首先，材料收集方法簡(jiǎn)單，幼蟲(chóng)可以殺死后離心收集；其次，寄生蟲(chóng)孵化率高，循環(huán)周期短，因此總產(chǎn)量很高，為研究工作提供了保障；再次，大黃魚(yú)是最易感染刺激隱核蟲(chóng)的養(yǎng)殖魚(yú)類[12]，故緊密結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，研究結(jié)果可及時(shí)應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。

圖3 刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)脫包20～24 h亞顯微觀察

8：凋亡的刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)(24 h)；9：體被纖毛完全脫落的幼蟲(chóng)(20 h)；10：幼蟲(chóng)體積萎縮(24 h)；11：凋亡中的刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)(20 h)

刺激隱核蟲(chóng)的幼蟲(chóng)期是其整個(gè)生活史中唯一具有感染能力的時(shí)期，其蟲(chóng)體透明，游動(dòng)速度快，且脫離包囊后2 h的幼蟲(chóng)感染力最強(qiáng)，3～20 h 感染力逐漸減弱到喪失感染力，幼蟲(chóng)30 h內(nèi)不感染宿主就會(huì)死亡[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，分別將存活了0、4、8、12、16、20和24 h的幼蟲(chóng)固定后，利用顯微及亞顯微技術(shù)觀察各時(shí)段發(fā)育形態(tài)的變化特征，探索其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與感染力消失之間的關(guān)系，為防治刺激隱核蟲(chóng)病的有效時(shí)間和方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

觀察脫包0～4 h時(shí)期的幼蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其全身布滿纖毛，游動(dòng)速度快，有利于它在水體中尋找宿主和成功感染。有報(bào)道認(rèn)為脫包6～8 h后，幼蟲(chóng)的感染能力大大減弱[14-16]，作者觀察脫包8～16 h時(shí)期的幼蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn)在掃描電子顯微鏡下其體纖毛大部分脫落，光鏡下幼蟲(chóng)行動(dòng)遲緩，這些現(xiàn)象表明刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染能力的下降。Burgess[14]和Dan[17]認(rèn)為刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)在脫包18 h后完全喪失感染力，本實(shí)驗(yàn)在觀察脫包20～24 h時(shí)期的幼蟲(chóng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)纖毛幾乎完全脫落，細(xì)胞發(fā)生顯著變化，形體急劇萎縮，呈現(xiàn)凋亡。Nigrelli和Ruggier[18]研究發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)從包囊溢出之后并不進(jìn)食而是在水中快速游動(dòng)，尋找感染宿主才能維系生命活動(dòng)。徐潤(rùn)林等[6]研究刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)超微結(jié)構(gòu)時(shí)也發(fā)現(xiàn)此時(shí)僅有無(wú)法攝食的口器原基，無(wú)明顯口器結(jié)構(gòu)。由此推測(cè)，刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)3～20 h 感染力逐漸減弱到喪失感染力，與幼蟲(chóng)擺動(dòng)纖毛尋找宿主過(guò)程中能量的不斷消耗有關(guān)，最終幼蟲(chóng)能量枯竭而失去感染活性。本研究在不同時(shí)段的幼蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化特征與感染活性喪失過(guò)程相關(guān)聯(lián)，反映能量衰減可能是影響刺激隱核蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染能力的主要原因。

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Electron microscopic observation of artificial infection of theront ofCryptocaryonirritansin vitro

SHEN Chen, ZHOU Min-xi, ZHOU Su-ming, WANG Guo-liang

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Cryptocaryonirritanstheront stage development characteristics were examined by observation of scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Tomont in each period collected from the diseasedPseudosciaenacrocea, and the strains were maintained in experimentally infectingPseudosciaenacroceafrom which the sample used for ultrastructural observation was collected. The result of observing different stages of theront off the tomont by electron microscope and light microscope showed: theront off the tomont after 0-4 h, ciliary body of the worm body was more dense and the cell structure was complete, swimming quickly in culture fluid; theront off the tomont after 8-16 h,Cryptocaryonirritanslarvae significantly reduced the long diameter and the number of its body cilia, with thin cytoplasm, swimming slowly; theront off the tomont after 20-24 h, the larvae body cilia was few. And the larvae were nonmoving, sinking to the bottom. Meanwhile, the cell shapes of teardrop changed into the irregular and begain apoptosis, the cell size in a serious recession significantly, with long diameter of only 10 μm around. In this study, the morphological and structural characterization changes of the larvae in different periods are associated with the process of the loss of infectivity, reflecting the main reason that the influences on infectivity ofCryptocaryonirritansis energy attenuation.

Cryptocaryonirritans; contagious; artificial infection; ultrastructure

2016-05-30；

2016-06-21

教育部長(zhǎng)江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(IRTO734號(hào))；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(200903029號(hào))；浙江省海水養(yǎng)殖重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2010R50025-08號(hào))

沈 晨,碩士研究生,水生動(dòng)物病害方向,E-mail:1506012768@qq.com

王國(guó)良,教授,主要從事水生動(dòng)物病害研究,E-mail:wangguoliang@nbu.edu.cn

S941.51

B

2095-1736(2017)02-0104-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.104