雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵對燕麥多酚的影響

劉紅艷，翟飛紅，馬茹男，韓建榮

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵對燕麥多酚的影響

劉紅艷，翟飛紅，馬茹男，韓建榮

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

初步研究了雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵對燕麥中游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚含量的影響，并采用高效液相色譜法測定了酚酸種類的變化。結(jié)果表明，燕麥經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，游離態(tài)多酚含量從0.015 mg/g提高到5.782 mg/g，是對照的385.5倍；結(jié)合態(tài)多酚含量由0.335 mg/g減少到0.156 mg/g，是對照的46.6%；總酚含量由0.350 mg/g增加到5.938 mg/g，是對照的16.966倍。高效液相色譜法測定結(jié)果表明，經(jīng)雙孢蘑菇發(fā)酵后，燕麥中的酚酸種類發(fā)生了變化，且種類明顯多于對照組，其中，對照組中綠原酸含量（25.43%）豐富，而發(fā)酵后的燕麥中咖啡酸含量（16.79%）豐富。

雙孢蘑菇；燕麥；固態(tài)發(fā)酵；多酚

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）在分類學(xué)上屬擔(dān)子菌類傘菌目傘菌科，其具有很高的營養(yǎng)價值[1]。研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇具有降低血脂、護肝、抗氧化、防癌抗癌和抑菌等廣泛的藥理作用[2]。對于雙孢蘑菇，不僅其子實體可以被利用，其菌絲體也可以通過固態(tài)發(fā)酵等方式加以利用。

燕麥的主要成分為淀粉和蛋白質(zhì)，具有多元酚結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)也廣泛存在于燕麥中，其多酚類物質(zhì)不僅具有很強的清除自由基能力，還可以通過抑制氧化酶和絡(luò)合過渡金屬離子等方式起到抗氧化作用[3-4]。有報道表明，燕麥中的多酚主要以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在，并且結(jié)合態(tài)多酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離態(tài)多酚含量[5]。結(jié)合態(tài)多酚主要分布在皮層和糊粉層，人們在食用燕麥的過程中，結(jié)合態(tài)多酚往往不能被人體充分吸收，從而降低了對燕麥多酚的利用率。

大量研究表明，經(jīng)微生物發(fā)酵以后，谷物中的大分子物質(zhì)能被降解成利于人體吸收的小分子物質(zhì)，提高其營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[6]。但關(guān)于雙孢蘑菇利用燕麥進行固態(tài)發(fā)酵的研究還未見報道。

本試驗選用燕麥作為培養(yǎng)基，初步研究了雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵對燕麥多酚含量的影響，并對發(fā)酵后多酚的成分進行了初步鑒定，旨在為提高谷物營養(yǎng)價值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）2796菌株，由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供，保存于馬糞瓊脂培養(yǎng)基中。

1.2 試劑

沒食子酸、福林酚、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、甲醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、碳酸鈉、酒石酸甲鈉、石油醚、可溶性淀粉，均為國產(chǎn)分析純；原兒茶酸、龍膽酸、咖啡酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸、肉桂酸，均為高效液相色譜純。

1.3 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SC-3614低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Waters高效液相色譜儀配Waters 2487泵和Waters 2526紫外檢測器，上海鉑力生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 燕麥培養(yǎng)基的制備 準(zhǔn)確稱取800 g（干質(zhì)量）除去谷殼和石子等雜物的燕麥，在100℃沸水中煮沸至無白心，瀝干水分，攤開晾干至不黏手（水分含量大約為40%）。然后，將處理好的燕麥平均分裝在16個250 mL的錐形瓶中，用透氣塑料膜封口，121℃滅菌1 h。

1.4.2 固態(tài)發(fā)酵 將活化后的雙孢蘑菇斜面菌種切成1 cm×1 cm的小塊，接種至滅菌后的燕麥培養(yǎng)基中，每瓶接種3塊，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿瓶后開始計時，分別在滿瓶后第5，10，15，20，30天后取出。取出的樣品用玻璃棒攪拌均勻，部分用來直接測定碳水化合物水解酶的酶活；部分在40℃烘箱中烘干并粉碎過0.177 mm篩，用來測定發(fā)酵產(chǎn)物的多酚含量及組成。每個處理做3個重復(fù)，以不接種的培養(yǎng)基作為對照。

1.4.3 發(fā)酵產(chǎn)物多酚的提取

1.4.3.1 游離態(tài)多酚的提取 按照CHETHAN等[7]的方法，略作改動。分別準(zhǔn)確稱取5 g烘干并粉碎的樣品，用石油醚（30～60）脫脂，加入50 mL 1%HCl-甲醇提取劑，在搖床上振蕩提取24 h（25℃，150 r/ min）。然后，4 000 r/min離心10 min，取上清。采用相同方法重復(fù)提取2次，并合并上清液。將所得提取液45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，并用甲醇定容至一定體積，即為游離態(tài)多酚提取液。

1.4.3.2 結(jié)合態(tài)多酚的提取 將1.4.3.1所得殘渣40℃烘干后加入20 mL NaOH溶液（2 mol/L），25℃搖床150 r/min振蕩1 h，然后用濃HCl調(diào)pH值至2，加入15 mL乙酸乙酯，靜置10 min，4 000 r/min離心6 min，收集乙酸乙酯部分，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，最后用甲醇定容至10 mL，即為結(jié)合態(tài)多酚提取液。

1.5 測定項目及方法

1.5.1 發(fā)酵產(chǎn)物多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測定多酚的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用沒食子酸，根據(jù)沒食子酸的濃度和OD值來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y＝7.157 5x－0.003 5（R2＝0.999 8）。多酚含量以mg沒食子酸/g燕麥（干質(zhì)量）來表示（文中單位均表示為mg/g）。

1.5.2 發(fā)酵產(chǎn)物多酚種類的測定 采用HPLC法測定發(fā)酵后燕麥中游離態(tài)多酚的組成成分。具體HPLC條件等參考CHETHAN等[7]的方法，高效液相系統(tǒng)：Waters 1525泵、Waters 2487雙波長吸收檢測器，用C18反相色譜柱（Venusil XBP C18（L）5 μm，150?，250 mm×4.6 mm），紫外檢測波長295 nm，樣品過0.45μm的濾器，進樣量20μL，流速1.0 mL/min，柱溫為25℃；色譜條件：流動相A為0.01%的乙酸，流動相B為甲醇（色譜純）。洗脫梯度程序：0 min（80%A＋20%B），0～40 min（60%A＋40%B），40～50 min（60%A＋40%B），50～55 min（80%A＋20%B），55～65 min（80%A＋20%B）。

樣品色譜圖出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間作比較，分析對照組與發(fā)酵后燕麥中游離態(tài)多酚種類的變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件Duncan多重比較法[9]進行多個均值間的兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物多酚的含量

從圖1可以看出，燕麥經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，隨著發(fā)酵時間的延長，游離態(tài)多酚含量逐漸增加，結(jié)合態(tài)多酚含量逐漸減少，總酚含量逐漸增加。未經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵的燕麥，游離態(tài)多酚含量為0.015 mg/g，結(jié)合態(tài)多酚含量為0.335 mg/g，結(jié)合態(tài)多酚含量遠(yuǎn)高于游離態(tài)多酚含量，且結(jié)合態(tài)多酚含量為游離態(tài)多酚含量的22倍；當(dāng)發(fā)酵時間為30 d時，游離態(tài)多酚含量達最高值，為5.782 mg/g，結(jié)合態(tài)多酚含量達到最少值，為0.156 mg/g，總酚含量為5.938 mg/g，其中，游離態(tài)多酚含量是對照的385.5倍，結(jié)合態(tài)多酚含量是對照的46.6%，總酚含量是對照的16.966倍。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物多酚種類的測定

選取12種谷物中最常見的酚酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，進行HPLC分析，其色譜圖如圖2所示。

如圖3所示，通過和圖2中的12種標(biāo)準(zhǔn)品色譜出峰時間進行對比，對照組燕麥中的游離態(tài)多酚的HPLC圖譜中有5種峰可以被確定，分別為綠原酸、對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸和肉桂酸。由表1可知，對照組燕麥中，綠原酸的峰面積占總酚峰面積的比例最大（25.43%），即對照組燕麥中的綠原酸含量較豐富。

表1 發(fā)酵前后燕麥不同種類酚酸的相對峰面積 %

如圖4所示，發(fā)酵后燕麥中的游離態(tài)多酚的HPLC圖譜出峰數(shù)明顯多于對照組，與圖2中的12種標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間比對發(fā)現(xiàn)，有7種峰可以被確定，除了對照組中的對羥基苯甲酸和香草酸之外，還檢測出了原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和龍膽酸。由表1可知，發(fā)酵后的燕麥中，咖啡酸的峰面積占總酚峰面積的比例最大（16.79%），即發(fā)酵后的燕麥中咖啡酸含量較豐富。

結(jié)合圖3，4可以看出，經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，對照組中的綠原酸、阿魏酸和肉桂酸并未檢測出，檢測出了新的龍膽酸、咖啡酸、p-香豆酸和芥子酸。猜想可能在發(fā)酵過程中發(fā)生了某些生物化學(xué)反應(yīng)，使燕麥中游離態(tài)多酚的種類發(fā)生了變化。此外，表1結(jié)果表明，經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，燕麥中各酚酸的比例也發(fā)生了變化，如對照組中的香草酸僅為0.32%，經(jīng)雙孢蘑菇發(fā)酵后，其比例變?yōu)?.59%。結(jié)果表明，雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵不僅提高了燕麥的多酚含量，也增多了酚酸的種類，而且各酚酸的比例也得到了改變。從圖3，4還可以看出，對照組和發(fā)酵后的HLPC色譜圖中，仍有很多含量很高卻無法被確定的酚酸存在，所以，下一步將采用高效液相分步收集各組分，并采用核磁共振結(jié)合高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)來分析這些發(fā)酵后產(chǎn)生的未知新物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，燕麥經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，隨著發(fā)酵時間的延長，游離態(tài)多酚含量逐漸增加，結(jié)合態(tài)多酚含量逐漸減少，總酚含量逐漸增加。經(jīng)雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，燕麥的游離態(tài)多酚含量增加了5.767 mg/g，而其結(jié)合態(tài)多酚含量僅降低了0.179 mg/g，表明其游離態(tài)多酚含量的增加要遠(yuǎn)高于結(jié)合態(tài)多酚含量的減少。LIU等[10]研究結(jié)果表明，雙孢蘑菇的子實體中富含多酚，且其多酚含量會受到栽培條件和周圍環(huán)境等的影響。在固態(tài)發(fā)酵過程中，雙孢蘑菇代謝會產(chǎn)生多酚，使得燕麥發(fā)酵產(chǎn)物中的游離態(tài)多酚含量提高。

目前，BHANJA等[11]用2種絲狀真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）來發(fā)酵小麥，研究了發(fā)酵后小麥的總酚含量和抗氧化性，結(jié)果表明，小麥經(jīng)這2種絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵后總酚含量及抗氧化性顯著提高，其中，總酚含量從未發(fā)酵時的7.226 μmol/g提高到158.192 μmol/g；此外，還對發(fā)酵體系中的α-淀粉酶、β-葡糖苷酶和纖維素酶等碳水化合物水解酶的酶活進行了測定，并對這些酶活與多酚含量之間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果表明，碳水化合物水解酶的酶活與多酚含量之間有一定的正相關(guān)性，表明碳水化合物水解酶在釋放結(jié)合態(tài)多酚中起到了一定的作用。雙孢蘑菇可以分泌一些碳水化合物水解酶來分解大分子物質(zhì)，以提供生長過程中所需的能量[12]。在本試驗中，發(fā)酵后燕麥中結(jié)合態(tài)多酚含量的減少，可能是由于碳水化合物水解酶引起了結(jié)合態(tài)多酚釋放。MOORE等[13]使用酵母發(fā)酵麥麩，研究發(fā)現(xiàn)，麥麩中的酚酸及總酚含量顯著增加，其清除自由基能力明顯提高。LEE等[14]用各種安全的絲狀真菌，包括泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）、醬油曲霉（Aspergillus sojae）和根曲霉（Rhizopus azygosporus）等發(fā)酵黑豆，研究發(fā)酵前后黑豆抗氧化能力的變化，結(jié)果表明，發(fā)酵后黑豆中多酚含量顯著上升，抗氧化能力得到改善。表明豆類經(jīng)絲狀真菌或酵母類真菌固態(tài)發(fā)酵后，其多酚含量和抗氧化作用都有了顯著提高。本試驗結(jié)果也表明，利用雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵后，多酚含量得到了顯著提高。

雙孢蘑菇子實體也具有治療高血壓和肝炎等功效[15]，很多研究表明，雙孢蘑菇子實體與菌絲體具有相同的功效，并且有的菌絲體要優(yōu)于子實體。翟飛紅等[16]利用雙孢蘑菇菌絲體進行液態(tài)發(fā)酵，對所得到的菌絲體的抗氧化性和多糖含量進行分析，結(jié)果表明，雙孢蘑菇菌絲體具有很強的抗氧化活性，且含有豐富的多糖?？赡苁怯捎诠虘B(tài)發(fā)酵過程中會發(fā)生很多生物化學(xué)變化，會分泌一些有益的小分子物質(zhì)，除此之外，微生物中含有豐富的酶系，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物[6]。

一般固態(tài)發(fā)酵都會采用酵母菌如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和泡盛曲霉（A.awamori）、米曲霉（A.oryzae）及根曲霉（R.azygosporus）等霉菌，利用食用真菌對谷物進行固態(tài)發(fā)酵，研究的人還很少。所以，在研究雙孢蘑菇固態(tài)發(fā)酵對多酚含量影響的情況下，其抗氧化作用還有待研究，并對其發(fā)酵后產(chǎn)生的其他營養(yǎng)物質(zhì)進行深入分析。

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Effect of Solid-state Fermentation of Agaricus bisporus on Polyphenols Content of Oats

LIUHongyan，ZHAI Feihong，MARunan，HANJianrong

（College ofLife Science，Shanxi Univeisity，Taiyuan 030006，China）

In this paper,the effect of solid-state fermentation with Agaricus bisporus on free polyphenol and bound polyphenol of oats were studied.The polyphenol species and the three kinds of hydrolytic enzymes（α-amylase,β-glucosidase and xylanase）were measured.The results showed that the contents of free polyphenol and total phenols increased after solid-state fermentation and varied with the prolonging of fermentation time.The contents of free polyphenol increased from 0.015 mg/g to 5.782 mg/g and the contents of total phenols increased from 0.350 mg/g to 5.938 mg/g,while the bound polyphenol content of fermentation products decreased from 0.335 mg/g to 0.156 mg/g.The results of HPLC indicated that the kinds of phenolic acid had a great change after fermentation.The chlorogenic acid（25.43%）in non-fermented oats and the caffeic acid（16.79%）in fermentation products was abundant,respectively.

Agaricus bisporus;oats;solid-state fermentation;polyphenol

S646.1＋1

A

1002-2481（2017）03-0361-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.11

2016-11-03

山西省煤基重點科技攻關(guān)項目（FT2014-03-15）

劉紅艷（1990-），女，山西交城人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。韓建榮為通信作者。