植物乳桿菌163產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化

曾維偉,何鎮(zhèn)宏,陸兆新,呂鳳霞,別小妹,趙海珍,張 充

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095)

植物乳桿菌163產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化

曾維偉,何鎮(zhèn)宏,陸兆新*,呂鳳霞,別小妹,趙海珍,張 充

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095)

本文優(yōu)化了從泡菜中發(fā)現(xiàn)的一株植物乳桿菌163產(chǎn)植物乳桿菌素的發(fā)酵條件,并通過單因素實驗、Plackett-Btmnan實驗、Box-Behnken 實驗的響應(yīng)面方法得到的最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為:麥芽糖漿55 g/L,玉米漿干粉20 g/L,乙酸鈉8 g/L,檸檬酸氫二銨6 g/L,吐溫-80 1.26 g/L,發(fā)酵條件:初始pH4.7,接種量為2%。最終抑菌圈直徑提高到了31.90 mm,比原來的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵提升了1.10倍。本次優(yōu)化不僅提升了發(fā)酵液的抑菌活性,并且獲得了一種成本低廉的可以大規(guī)模應(yīng)用的食品級培養(yǎng)基配方。

植物乳桿菌163,響應(yīng)面方法,植物乳桿菌素

植物乳桿菌163是由本實驗室在貴州泡菜中篩選出的一株具有廣譜抑菌活性的乳酸菌,其所產(chǎn)的植物乳桿菌素163和163-1具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好和酸堿穩(wěn)定性好的特點[1]。植物乳桿菌素163和163-1是乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素,是兩種活性多肽。目前已發(fā)現(xiàn)并正被廣泛研究的細(xì)菌素有乳酸鏈球菌素(Nisin)、乳球菌素(Lactococcin)、片球菌素(Pediocin)、明串珠菌素(Canonic)等幾十種[2]。但只有少數(shù)被證明在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的經(jīng)濟潛能,如AMPs、Nisin等,被用作食物防腐劑[3]。其中Nisin己通過FAO/WHO認(rèn)證,并被世界幾十個國家和地區(qū)廣泛用于食品防腐保鮮。Nisin是由34個氨基酸組成的活性多肽,而植物乳桿菌素163和163-1是由氨基酸組成的活性多肽結(jié)構(gòu),且它們都具有廣譜抑菌活性的特點,因此能夠發(fā)酵產(chǎn)生兩種細(xì)菌素的植物乳桿菌163有較大的研究和應(yīng)用潛力。

但是植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的能力制約著其的生產(chǎn)和應(yīng)用,細(xì)菌素的產(chǎn)量不僅和乳酸菌菌株自身的特性有關(guān),而且還受到發(fā)酵條件的制約。如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵pH、接種量等因素的影響[4]。因為多因素的共同影響使得優(yōu)化變得相當(dāng)復(fù)雜,因而科學(xué)有效的方法就顯得尤為重要,響應(yīng)面方法(response surface methodology,RSM)通過實驗設(shè)計、建模、因子效應(yīng)評估,最后獲得一個最佳解決途徑,隨著計算方法的普及和發(fā)展,開始應(yīng)用于生物技術(shù)的許多方面[5]。響應(yīng)面法則是在通過Plackett-Burman 實驗篩選出顯著因子的基礎(chǔ)上,對幾個顯著的因子建立連續(xù)變量曲面模型,并對他們的交互作用進行評價,最終快速有效地得到優(yōu)化后的條件[6]。

表1 鹽離子正促進因素篩選實驗設(shè)計

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 植物乳桿菌163Lactobacillusplantarum163來源于實驗室分離菌株，現(xiàn)由中國微生物保藏中心保藏(No.8224);指示菌 藤黃微球菌(CMCC 28001);MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基[7]葡萄糖2%,牛肉膏l(xiāng)%,蛋白胨1%,酵母浸粉0.5%,檸檬酸氫二銨0.2%,磷酸酸氫二鉀0.2%,醋酸鈉0.5%,硫酸鎂0.058%,吐溫-80 0.1%,硫酸錳0.025%,pH6.2～6.4,蒸餾水1 L，滅菌條件:115 ℃,30 min;種子液培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基(同上);營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(NA) 牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,pH7.2～7.4,蒸餾水1 L。

DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;DRP-9612隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;ORION 3-star pH計 美國Thermo公司;5804 R臺式離心機 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 從甘油管中將凍存的植物乳桿菌接種到裝有50 mL MRS培養(yǎng)基液體的100 mL三角瓶中,于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后作為種子液。以2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,靜置發(fā)酵48 h。發(fā)酵液以8000 r/min離心10 min后,取上清待用[1]。

1.2.2 指示菌懸液的制備 將檢指示菌藤黃微球菌接至斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h,再接入100 mL種子培養(yǎng)基(NA),33 ℃,180 r/min,培養(yǎng)8～12 h,至菌對數(shù)生長中后期,取出置于冰箱備用,作為指示菌種子液。

1.2.3 抑菌效價測定方法 利用牛津杯單層瓊脂法[8]:在18 cm平板上放入牛津杯后倒入混有濃度為106～107cfu/mL的指示菌的培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯,在各孔中加入200 μL發(fā)酵上清,在37 ℃培養(yǎng)12 h,測定抑菌圈直徑。根據(jù)植物乳桿菌163發(fā)酵上清液的抑菌圈大小表示抑菌效價[9]。

1.2.4 Nisin標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱取0.8 g Nisin(1000 U/mg),溶于100 mL 0.02 mol/L HCl中,配制成8000 U/mL Nisin 標(biāo)準(zhǔn)液備用。需要時用0.02 mol/L HCl稀釋成250、500、1000、2000、4000和8000 U/mL幾種濃度的溶液。

1.2.5 培養(yǎng)基單因素實驗 單因素實驗如下進行[10]:

碳源單因素實驗:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以2%的糖蜜、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖漿、脫脂奶粉作為碳源,以MRS液體培養(yǎng)基作為對照,以單層瓊脂牛津杯法確定植物乳桿菌163對藤黃微球菌的抑菌效果,確定最優(yōu)碳源,并對該碳源的濃度進行確定。

氮源單因素實驗:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),100 mL培養(yǎng)基中分別以2%的酵母提取物、魚粉蛋白胨、黃豆粉、玉米粉、酵母膏、玉米漿干粉、牛肉膏、大豆蛋白胨作為氮源,以MRS液體培養(yǎng)基作為對照,以單層瓊脂牛津杯法確定植物乳桿菌163發(fā)酵上清對藤黃微球菌的抑菌效果,確定最優(yōu)氮源,并對該氮源的濃度進行確定。

鹽離子單因素實驗:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),以乙酸鈉、檸檬酸銨、檸檬酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、乙酸銨、乳酸鈉為鹽因素進行正促進因子篩選[11],對促進作用最大的幾種鹽離子確定其使用濃度。

刺激因子單因素實驗:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ),培養(yǎng)基中分別添加1%、2%、3%、4%、5%的吐溫作為刺激因子,以MRS液體培養(yǎng)基作為對照,以單層瓊脂牛津杯法確定植物乳桿菌163發(fā)酵上清對藤黃微球菌的抑菌效果,確定最優(yōu)刺激因子濃度。

1.2.6 發(fā)酵條件單因素實驗優(yōu)化 接種量單因素實驗:以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ),以原pH,分別以接種量1%、2%、3%、4%接種優(yōu)化后培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h后,以牛津杯抑菌圈的大小確定接種量對藤黃微球菌抑菌活性的影響。

初始pH優(yōu)化:以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在初始pH分別為5.4、5.7、6.0、6.3、6.6條件下,按2%的接種量37 ℃培養(yǎng)48 h后,以牛津杯抑菌圈的大小確定初始pH對藤黃微球菌抑菌活性的影響。

1.2.7 PB實驗(Plackett and Burman Design) 為了從上述單因素實驗中挑選主要實驗結(jié)果影響的因素[12],我們進行了PB實驗。實驗設(shè)計如表2。

表2 PB實驗設(shè)計

1.2.8 響應(yīng)面設(shè)計(Box-behnken(BBD)) 通過單因素實驗,確定響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素和水平,通過PB實驗選取3個主要影響因子的水平為自變量,同時通過爬坡實驗如表3趨近響應(yīng)面設(shè)計的中心點[13]。采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計實驗,因素和水平設(shè)計選擇如下表4。

表3 爬坡實驗設(shè)計

表4 響應(yīng)面設(shè)計

1.2.9 驗證實驗 將響應(yīng)面設(shè)計得到培養(yǎng)基組成和優(yōu)化的發(fā)酵條件進行實驗驗證,將實際值和預(yù)測值進行比較[14]。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 所有實驗均重復(fù)3次,使用SPSS 19.0和Excel進行數(shù)據(jù)處理。實驗設(shè)計通過Design Expert 8.06b進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用通過Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定發(fā)酵優(yōu)化后的發(fā)酵液抑菌效價,通過不同濃度的Nisin的抑菌圈的測定,我們獲得了抑菌活性與抑菌圈直徑之間的關(guān)系,如下圖1所示,二者的方程為y=0.1913x+0.0267,R2=0.9979,測定方法可行。

圖1 Nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Nisin

2.2 培養(yǎng)基單因素實驗

2.2.1 碳源單因素實驗 從圖2中可以看出,原MRS培養(yǎng)基使用的葡萄糖效果最好,乳糖和麥芽糖漿次之,脫脂奶粉效果較差,可溶性淀粉和糖蜜沒有效果,可能與葡萄糖參與某一代謝途徑有關(guān),但綜合效果和成本的兩方面考慮,使用麥芽糖漿最為合適。

圖2 碳源種類對抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on antimicrobial activity

同時,對麥芽糖漿濃度的研究結(jié)果見圖3,從圖3中可以看出,麥芽糖漿濃度在4%時抑菌圈直徑達(dá)到最大,麥芽糖漿濃度繼續(xù)增加,抑菌圈直徑呈現(xiàn)一定的下降趨勢,因此選擇4%作為麥芽糖漿的使用濃度。

圖3 碳源濃度對抑菌活性的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on antimicrobial activity

2.2.2 氮源單因素實驗 由圖4可以看出,抑菌效果比較好的氮源有玉米漿、酵母提取物(YE)、酵母膏、大豆蛋白胨、麥芽浸粉這五種物質(zhì),綜合考慮成本因素,選用玉米漿干粉作為最終使用的氮源,并且使得之前MRS培養(yǎng)基中復(fù)合氮源簡化為單一氮源,使得培養(yǎng)基更加簡單化。

圖4 氮源種類對抑菌活性的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on antimicrobial activity

選擇玉米漿干粉作為唯一氮源后,我們對其使用濃度進行了確定,從圖5中可以看出,玉米漿干粉的使用效果在4%之前呈上升趨勢,4%后呈下降趨勢。經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)1%與2%效果相差不顯著,2%和4%的效果相差不顯著,但由于1%與4%差異顯著,因此最終選擇2%的玉米漿干粉作為優(yōu)化后的氮源。

圖5 氮源濃度對抑菌活性的影響Fig.5 Effect of nitrogen source concentration on antimicrobial activity

2.2.3 鹽離子單因素實驗 對上述七種鹽離子進行正促進因子篩選實驗后,發(fā)現(xiàn)對實驗結(jié)果正促進作用最大的兩種鹽離子分別是乙酸鈉和檸檬酸氫二銨。如圖6所示,乙酸鈉的最佳使用濃度在8%左右。如圖7所示,檸檬酸氫二銨的最佳使用濃度在6%左右。

圖6 乙酸鈉濃度對抑菌活性的影響Fig.6 Effect of CH3COONa concentration on antimicrobial activity

圖7 檸檬酸氫二銨濃度對抑菌活性的影響Fig.7 Effect of diammonium citrate concentration on antimicrobial activity

2.2.4 刺激因子單因素實驗 如下圖8所示,隨著刺激因子吐溫-80的使用濃度使用的增加,抑菌活性呈下降趨勢。這可能與刺激因子吐溫-80會增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性有關(guān),高濃度的吐溫-80可能對細(xì)菌生長產(chǎn)生影響。因此吐溫-80的最佳濃度是1%。

圖8 刺激因子的濃度對抑菌活性的影響Fig.8 Effect of stimulating factor concentration on antimicrobial activity

2.3 發(fā)酵條件單因素實驗

2.3.1 接種量的單因素實驗 從圖9可以看出,抑菌活性在接種量為2%時最大,因而最終選擇2%為接種濃度。

圖9 接種量對抑菌活性的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on antibacterial activity

2.3.2 初始pH的單因素實驗 從圖10可以看出,初始pH在5.7時使得發(fā)酵液上清的抑菌圈直徑最大,因此選擇pH5.7作為發(fā)酵的起始pH。

2.4 Plackett-Btmnan實驗

表6 PB實驗方差分析結(jié)果

圖10 初始pH對抑菌活性的影響Fig.10 Effect of initial pH value on antibacterial activity

注:*表示顯著p<0.05,**表示極顯著,p<0.01。

通過上述PB實驗設(shè)計評價單因素獲得的七個因子A:麥芽糖漿、B:玉米漿干粉、C:乙酸鈉、D:檸檬酸氫二銨、E:吐溫-80、F:初始pH、G:接種量,實驗結(jié)果見表5。通過方差分析(表6)發(fā)現(xiàn)A:麥芽糖漿、E:吐溫-80、F:初始pH三個因子對實驗結(jié)果影響顯著性排在前三,后續(xù)均以原單因素實驗的最優(yōu)值作為發(fā)酵條件,因此我們選擇麥芽糖漿、吐溫-80和初始pH來進行后續(xù)的爬坡實驗。

表5 PB實驗結(jié)果

2.5 爬坡實驗

為了使最終得到的響應(yīng)面的曲面曲度達(dá)到要求,也就是讓實驗點更接近于實驗的中心點[15],進行了如表3的爬坡實驗,對五組設(shè)計進行實驗后發(fā)現(xiàn),抑菌圈直徑的最大值為4號實驗,因此最終選擇4號實驗組作為響應(yīng)面設(shè)計的中心點,即麥芽糖漿55 g/L、吐溫80 1.6 g/L、初始pH為4.8。

2.6 響應(yīng)面實驗及模型的建立

響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果見表7,并對響應(yīng)面實驗進行方差分析結(jié)果見表8。通過Design Expert軟件進行計算和分析,得到的抑菌圈直徑R1和三個因素A:麥芽糖漿(g/L),B:吐溫-80(g/L),C:初始pH的擬合方程為:

R1=31.96-0.055A-0.33B+0.010C+0.035AB-0.64AC+0.46BC-1.26A2-0.54B2-0.85C2

式(1)

表7 最陡爬坡實驗結(jié)果

表8 響應(yīng)面實驗及結(jié)果

表9 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

注:*表示顯著p<0.05,**表示極顯著,p<0.01。

上述分析結(jié)果表明:模型的p=0.0242<0.05,說明整個模型顯著,所擬合的二次回歸方程適合。失擬誤差p=0.0579>0.05,失擬相對誤差不顯著,因此,可用此模型對植物乳桿菌163發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的條件進行預(yù)測和分析。利用Design Expert軟件擬合出來的響應(yīng)面及等高線見圖11,從圖中可見三個拋物面開口向下,均出現(xiàn)了最高點。通過軟件分析計算得到當(dāng)A=54.83 g/L,B=1.26 g/L,C=4.73時,響應(yīng)面有最大值32.01。因此取麥芽糖漿55 g/L,吐溫-80 1.26 g/L,初始pH4.7,玉米漿干粉20 g/L,乙酸鈉8 g/L,檸檬酸氫二銨6 g/L,接種量為2%為優(yōu)化的最優(yōu)培養(yǎng)基,預(yù)測得到的抑菌圈直徑可達(dá)到32.01 mm,并以此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行驗證實驗。

圖11 因素交互的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface plots of variable parameters

2.7 驗證實驗

為了驗證模型擬合出來的預(yù)測值,利用已優(yōu)化的培養(yǎng)條件和原有條件均進行3次重復(fù)發(fā)酵實驗,實驗得到原有條件的抑菌圈直徑為29.11 mm,優(yōu)化條件后得到的抑菌圈直徑為31.90 mm,與預(yù)測值的擬合率達(dá)到99.65%,說明預(yù)測值與實際值相差不大,模型擬合較好[16]。

3 結(jié)論

通過單因素實驗、Plackett-Btmnan實驗、最陡爬坡實驗、響應(yīng)面實驗得到的最終得發(fā)酵培養(yǎng)基為:麥芽糖漿55 g/L,玉米漿干粉20 g/L,乙酸鈉8 g/L,檸檬酸氫二銨6 g/L,吐溫-80 1.26 g/L,發(fā)酵條件:初始pH4.7,接種量為2%。食品級培養(yǎng)基的篩選除了要考慮安全,也需要考慮生產(chǎn)的實際成本,本次優(yōu)化將原MRS發(fā)酵的植物乳桿菌163抑菌圈直徑從29.11 mm提升到了31.90 mm。本次優(yōu)化的培養(yǎng)基配方將原來MRS培養(yǎng)基的10種成分減為5種成分,且成分均為食品級原料。同時優(yōu)化后的培養(yǎng)基中的麥芽糖漿、玉米漿干粉等成本比原有的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏等的成本低,性價比更高,為后續(xù)植物乳桿菌的大規(guī)模發(fā)酵和應(yīng)用提供了很好的基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions of the production of antibacterial substances byLactobacillusplantarum163

ZENG Wei-wei,HE Zhen-hong,LU Zhao-xin*,LV Feng-xia,BIE Xiao-mei,ZHAO Hai-zhen,ZHANG Chong

(Nanjing Agriculture University,Nanjing 210095,China)

Optimization of fermentation conditions of the production of plantaricin byLactobacillusplantarum163,which was isolated from Chinese traditional pickled cabbage in our laboratory,was carried out using single-factor experiments,a Plackett Burman design(PB),a Box-Behnken design(BBD)and response surface methodology(RSM). The best concentration of the optimized medium was 55 g/L maltose syrup,20 g/L corn steep powder,8 g/L CH3COONa,6 g/L diammonium citrate,1.26 g/L Tween-80,and initial pH value 4.7,inoculum 2%.The inhibitory diameter has increased to 31.90 mm,which is 1.10 times lager than cultured in MRS medium.The optimization had not only improved the antimicrobial activity of the fermentation broth,but also found a food grade and cheap medium which could be used in large scale.

Lactobacillusplantarum163;response surface methodology;plantaricin

2016-09-01

曾維偉(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：食品生物科技，E-mail:2015108041@njau.edu.cn。

*通訊作者:陸兆新(1957-)，男，教授，研究方向: 酶工程、食品微生物、農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail:fmb@njau.edu.cn。

國家科技支撐計劃(2015BAD16B04)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0147-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.020