寡雄蛋白(Oligandrin)處理對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病及苯丙烷代謝的影響

劉 筱,潘靜宇,李永才,楊 蘭,高春麗,畢 陽(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

寡雄蛋白(Oligandrin)處理對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病及苯丙烷代謝的影響

劉 筱,潘靜宇,李永才*,楊 蘭,高春麗,畢 陽(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

本實(shí)驗(yàn)以“新大坪”馬鈴薯(Solanumtuberosum)為試材,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),研究了寡雄蛋白(oligandrin)對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病的控制效果;同時(shí)從生化和分子水平上分析揭示了寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝的調(diào)控機(jī)理。結(jié)果表明:56、24、18、12、6 μg/mL寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病的擴(kuò)展都有一定的控制效果,其中24 μg/mL寡雄蛋白處理效果最佳,處理后塊莖病斑直徑為對(duì)照的58.33%;進(jìn)一步研究表明寡雄蛋白處理能提高與馬鈴薯塊莖組織苯丙烷代謝相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸脫氫酶(CAD)、肉桂酸羥化酶(C4H)和4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)的活性及相關(guān)基因的表達(dá);同時(shí)抗性物質(zhì)總酚、類(lèi)黃酮及木質(zhì)素含量也因寡雄蛋白處理而提高,在處理后第3 d類(lèi)黃酮含量出現(xiàn)高峰,高于對(duì)照果實(shí)54%?？梢?jiàn)寡雄蛋白可通過(guò)增強(qiáng)組織的苯丙烷代謝而提高馬鈴薯塊莖的抗病性。

馬鈴薯,干腐病,寡雄蛋白,苯丙烷代謝

作為世界上第四大糧食作物的馬鈴薯[1],在采后貯藏期間因采后生理和病理等方面的因素而造成嚴(yán)重的腐爛,腐爛率高達(dá)20%～25%,不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也給整個(gè)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重影響[2]。其中,由硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum)引起的干腐病則導(dǎo)致了中國(guó)西北地區(qū)馬鈴薯的爛窖[1]。目前馬鈴薯采后病害的控制主要通過(guò)化學(xué)殺菌劑處理,雖然化學(xué)殺菌劑的使用能夠有效地控制馬鈴薯采后貯藏過(guò)程中干腐病的發(fā)展,但化學(xué)殺菌劑易帶來(lái)環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題,并且會(huì)使病原物產(chǎn)生抗藥性[3]。因此,亟需尋找一種安全有效且能夠應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)際的經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法來(lái)替代化學(xué)殺菌劑。近年來(lái),有關(guān)生防菌誘導(dǎo)采后果蔬產(chǎn)生抗病性的效果和機(jī)理已經(jīng)進(jìn)行了許多研究,但是開(kāi)發(fā)新型防治方法仍然具有非常廣闊的研究前景。

寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)屬于卵菌綱、霜霉目、腐霉科、腐霉屬,主要通過(guò)腐生,重寄生作用殺死致病真菌后吸取其營(yíng)養(yǎng)成分[4]。寡雄蛋白(oligandrin)是一種從寡雄腐霉的培養(yǎng)濾液中分離所得到的分子量約為10 ku、等電點(diǎn)為4.5且與激發(fā)子有相似功能的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白[5],可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性(SAR)。研究表明寡雄蛋白能誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)鐮刀菌引起的根腐病的抗性[6],并能不同程度地誘導(dǎo)番茄葉片中與抗性相關(guān)的酶(過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶)的活性升高,另外寡雄蛋白處理顯著抑制了番茄果實(shí)灰霉病,即在室溫條件下貯藏發(fā)現(xiàn)處理后番茄果實(shí)腐爛率相比對(duì)照降低了49.5%[7]?？梢?jiàn)寡雄蛋白作為一種新型的生物農(nóng)藥具有廣闊的應(yīng)用前景。

苯丙烷代謝是酚類(lèi)物質(zhì)代謝的重要途徑,在植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中具有重要的作用[8],此外,苯丙烷代謝也是植物響應(yīng)病原物侵染過(guò)程中被激活的一種生化反應(yīng)途徑[9]。葛永紅等[10]研究結(jié)果表明,100 mg/L的苯并噻重氮(BTH)處理蘋(píng)果果實(shí)后,顯著提高了組織PAL和4CL活性,并且促進(jìn)了苯丙烷代謝產(chǎn)物總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素含量的提高,增強(qiáng)了果實(shí)抵抗病原物侵染的能力。陳年來(lái)等[11]用誘導(dǎo)劑BTH、SA噴霧處理甜瓜葉片并接種白粉菌后發(fā)現(xiàn),甜瓜葉片抗性相關(guān)酶(PAL)的活性和抗菌物質(zhì)(總酚、類(lèi)黃酮)含量的增加程度與甜瓜對(duì)白粉病的抗性呈顯著的正相關(guān)。Hatem等[12]研究發(fā)現(xiàn)硫胺素(VB1)處理誘導(dǎo)了葡萄樹(shù)葉片中苯丙烷代謝產(chǎn)物總酚、類(lèi)黃酮以及木質(zhì)素的積累,并且提高了葉片對(duì)霜霉病菌的抗性。綜上研究結(jié)果表明苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶的活性增強(qiáng)及其代謝產(chǎn)物的積累均與果蔬抵抗病原菌的能力密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以甘肅馬鈴薯品種“新大坪”為試材,研究了寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖組織苯丙烷代謝的影響,以期為進(jìn)一步闡明寡雄蛋白在病害控制方面的生防調(diào)控機(jī)制,并對(duì)采后馬鈴薯病害安全控制技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試“新大坪”馬鈴薯(Solanumtuberosum) 購(gòu)于甘肅省定西市安定區(qū),挑選健康、無(wú)機(jī)械損傷、大小均勻的馬鈴薯塊莖,裝袋運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于5～8 ℃下貯藏1 d備用;多利維生寡雄腐霉(Pythiumoligandrum) 由北京比奧瑞生物科技有限公司提供;硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum) 分離純化自感病的馬鈴薯塊莖。

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;H-1850R型離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UV-2450型分光光度計(jì) 日本島津公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;CX21FS1C生物顯微鏡 奧林巴斯(廣州)工業(yè)有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 寡雄蛋白的誘抗作用

1.2.1.1 寡雄腐霉濾液的制備 參照Wang等[13]的方法,并稍作修改。在玻璃三角瓶(規(guī)格為50 mL)中裝入液體培養(yǎng)基并進(jìn)行滅菌。之后每瓶接入8塊經(jīng)活化的寡雄腐霉菌餅(直徑8 mm),于25 ℃、150 r/min下暗培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)液經(jīng)8000 r/min離心10 min,上清液用4層無(wú)菌濾紙過(guò)濾,即得無(wú)菌發(fā)酵液,濃度為100%,置于4 ℃冰箱中備用。寡雄腐霉液體培養(yǎng)基簡(jiǎn)稱PO培養(yǎng)液,參照Bonnet等[14]的方法制備。

1.2.1.2 寡雄蛋白的提取、純化 參照林釵等[7]方法,在得到的寡雄腐霉濾液中邊加固體硫酸銨邊攪拌,加至硫酸銨最終濃度為100%,4 ℃靜置過(guò)夜,10000 r/min離心15 min,沉淀保存于-20 ℃?zhèn)溆?上清液中再加固體硫酸銨至50%,靜置過(guò)夜、離心、保存沉淀;上清液再加固體硫酸銨至60%(所有方法同上),依此類(lèi)推,一直加到100%,每級(jí)收集的沉淀用雙蒸水溶解,裝入分子截留量為8 ku的透析袋中,放在生理鹽水中透析48 h以除去鹽類(lèi)物質(zhì),期間更換生理鹽水?dāng)?shù)次,用0.2% BaCl2檢測(cè)硫酸銨是否除去。吸取透析袋中液體,剩余沉淀即為寡雄蛋白。

1.2.1.3 蛋白濃度的測(cè)定 參考Bradford[15]的方法,用牛血清蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算蛋白的含量。

1.2.1.4 寡雄蛋白最佳誘抗?jié)舛鹊暮Y選 根據(jù)1.2.1.3中方法測(cè)得的蛋白濃度為56 μg/mL,用無(wú)菌水稀釋不同倍數(shù)后,在馬鈴薯塊莖及切片上進(jìn)行誘抗處理,通過(guò)觀察塊莖與切片的發(fā)病情況與病斑直徑篩選出最佳的誘抗?jié)舛取?/p>

1.2.1.5 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖的誘抗作用 采用本實(shí)驗(yàn)室成熟方法,選擇貯藏于5～8 ℃下的外觀整齊,無(wú)病蟲(chóng)害的馬鈴薯塊莖,先用自來(lái)水清洗后,再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min后立即用無(wú)菌水沖洗,并自然晾干,之后再用75%的酒精進(jìn)行表面消毒,最后用直徑3 mm的無(wú)菌鐵釘在馬鈴薯塊莖赤道部位均勻刺3 mm×3 mm的傷口3個(gè),之后用接種針接種10 μL 56、24、18、12、6 μg/mL寡雄蛋白,誘抗12 h后的塊莖分別接種10 μLF.sulphureum孢子懸浮液,對(duì)照接種10 μL無(wú)菌水,之后用PE保鮮袋(30 cm×40 cm)包裝,在室溫條件貯藏并測(cè)量不同時(shí)期的塊莖病斑直徑。每個(gè)處理3個(gè)塊莖,重復(fù)3次。

1.2.1.6 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯切片的誘抗作用 參照楊志敏等[16]的方法并作修改。用無(wú)菌刀和打孔器將馬鈴薯塊莖制成厚1 cm、直徑為35 mm的圓片。切片用無(wú)菌水清洗后再用75%酒精消毒,并在酒精燈火焰上輕微灼燒除去多余酒精,之后置于鋪有無(wú)菌濕濾紙且已滅菌的大培養(yǎng)皿上,黑暗恒溫恒濕條件下培養(yǎng)4 h后,用無(wú)菌涂布器分別在切片上均勻涂布50 μL 56、24、18、12、6 μg/mL寡雄蛋白,誘抗12 h之后的切片在其中央位置接種培養(yǎng)7 d的F.sulphureum菌餅(直徑3 mm),菌餅含菌絲面與切片接觸,將處理后的切片培養(yǎng)在25 ℃,相對(duì)濕度(RH)為72%～75%的條件下,并于不同時(shí)期測(cè)定切片的病斑直徑。每個(gè)處理8個(gè)切片,重復(fù)3次。

1.2.2 寡雄蛋白對(duì)苯丙烷代謝的影響

1.2.2.1 取樣方法 參照Bi[17]的方法并稍作修改。先將馬鈴薯制成切片,用最佳濃度的寡雄蛋白進(jìn)行誘抗處理后接種培養(yǎng)1周的F.sulphureum菌餅(直徑3 mm),分別取處理后第0、0.5、1、2、3、4 d各處理組的切片,用無(wú)菌不銹鋼刀切取切片表層0～3 mm處的馬鈴薯組織3 g,用錫箔紙包好后立即用液氮進(jìn)行冷凍,然后保存于-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

表1 引物設(shè)計(jì)表

1.2.2.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸脫氫酶(CAD)活性的測(cè)定 PAL活性的測(cè)定參照Yin[18]的方法并稍作修改。稱取3 g冷凍樣品置于預(yù)冷的研缽中,加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的100 mmol/L硼酸緩沖液(pH8.8,含1% PVP、1 mmol/L EDTA和50 mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴條件下充分研磨,然后于4 ℃ 11250×g 條件下離心 20 min,收集上清液立即用于酶活性的測(cè)定。取三支試管分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,向Ⅰ、Ⅱ兩支試管分別加入3 mL 7 mmol/L L-苯丙氨酸溶液(用50 mmol/L 硼酸緩沖液配制),再分別向Ⅰ和Ⅲ兩支試管中加入500 μL 上清液后立即于37 ℃保溫1 h,保溫完畢后立即在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值,以Ⅱ和Ⅲ混合后測(cè)定的吸光度值為初始值,Ⅰ中測(cè)定值為終止值。另以提取液代替上清液按照上述方法測(cè)得的吸光度分別作為初始值和終止值的對(duì)照。PAL活性表示為0.01ΔOD290/h·g。

CAD活性的測(cè)定參照Goffner[19]的測(cè)定方法并修改。取3 g冷凍樣品加入3 mL預(yù)冷0.1 mmol/L pH6.25 PBS(含15 mmol/L巰基乙醇和2% PEG及約0.1 g PVPP),冰浴條件下充分研磨,18000×g,4 ℃離心20 min,上清液用于酶活性測(cè)定。取200 μL酶粗提液加800 μL反應(yīng)液(含10 mmol/L NADP,5 mmol/L反式肉桂酸),以200 μL PBS加800 μL反應(yīng)液為對(duì)照,37 ℃水浴30 min,1 mol/L HCl終止反應(yīng)后在340 nm處測(cè)吸光值。

1.2.2.3 4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)和肉桂酸羥化酶(C4H)活性的測(cè)定 4CL活性參照 Knobloch[20]等的方法測(cè)定。取3 g冷凍樣品,加入3 mL,0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0,含25%甘油、0.1 mol/L DTT),冰浴條件下充分研磨,10000×g離心20 min,上清液用于酶活測(cè)定。反應(yīng)體系包括0.45 mL 15 μmol/L Mg2+、0.15 mL 15 μmol/L p-香豆酸、0.15 mL 50 μmol/L ATP、0.15 mL 1 μmol/L CoA以及0.5 mL 酶液(對(duì)照不加香豆酸),于333 nm處測(cè)定吸光值。連續(xù)測(cè)定3 min,以反應(yīng)液在333 nm處吸光值每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。

C4H 活性參照Lamb[21]的方法進(jìn)行測(cè)定,稱取3 g冷凍樣品,加入5 mL的0.2 mol/L Tris-HCl提取緩沖液(pH8.9,含15 mmol/Lβ-巰基乙醇、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L 抗壞血酸、10 μmol/L亮抑酶肽、1 mmol/L PMSF、0.15% PVPP和10%甘油),冷凍研磨勻漿,在4 ℃下12000 r/min離心20 min,取上清液待測(cè)。反應(yīng)液包括2 μmol/L反式肉桂酸、2 μmol/L NADPNa2、5 μmol/L 6-磷酸鈉葡萄糖,參比不加酶提取液,于340 nm處測(cè)定吸光值。以反應(yīng)液在340 nm處吸光度值每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活性單位。

1.2.2.4 總酚物質(zhì)和類(lèi)黃酮含量的測(cè)定 總酚物質(zhì)的測(cè)定參照Pirie和Mullins[22]的方法,稱取3 g樣品,加入5 mL的1%的HCl-甲醇溶液,冷凍研磨勻漿,在0～4 ℃下12000 r/min離心20 min,取上清液并于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,含量用OD280/g mf表示。

類(lèi)黃酮含量的測(cè)定參照Pirie等[22]的方法測(cè)定。稱取3 g馬鈴薯組織,加入5 mL的1% HCl-甲醇在冰浴條件下研磨提取2 h后,于4 ℃下 15000×g離心30 min,于325 nm測(cè)定吸光值,含量單位表示為OD325/g mf,樣品重復(fù)測(cè)3次。

1.2.2.5 木質(zhì)素含量的測(cè)定 參照林葵等[23]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。稱取3 g樣品,加入3 mL 95%乙醇研磨勻漿,轉(zhuǎn)入帶蓋離心管中,12000×g離心10 min,沉淀物用95%乙醇反復(fù)洗滌3次,再用乙醇(95%)∶正己烷=1∶2(v/v)反復(fù)洗滌3次,隨后收集沉淀物氮?dú)獯蹈?將其溶于1 mL 25% 溴乙酞冰醋酸溶液中,加蓋于70 ℃水浴中放置30 min,加1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),再加入2 mL冰醋酸,0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸,振動(dòng)混勻后在1000 r/min離心10 min,上清液即為木質(zhì)素待測(cè)液。取0.1 mL待測(cè)液,加冰醋酸定容至5 mL,振動(dòng)混勻,在280 nm下測(cè)定樣品吸光值,含量用OD280/g mf表示。

1.2.3 寡雄蛋白處理后相關(guān)基因表達(dá) 取寡雄蛋白誘抗處理后的馬鈴薯組織,液氮速凍后放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用 TRIZOL法對(duì)其進(jìn)行RNA的提取。RNA提取完成后取1 μL提取液并稀釋至70 μL,測(cè)OD值,計(jì)算RNA濃度,之后電泳檢測(cè)RNA是否降解。

表3 PCR擴(kuò)增程序

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI查得馬鈴薯的序列(見(jiàn)表1),進(jìn)而設(shè)計(jì)特異性引物,選擇內(nèi)參基因18 S(GenBank ID:AB971541.1),用于Real-time PCR,用于比較Ct值的相對(duì)定量。

這部分實(shí)驗(yàn)在生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行,通過(guò)柱式植物總RNA抽提純化試劑盒,按照標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行基因蛋白的分離純化,并進(jìn)行測(cè)定。

PCR反應(yīng)條件設(shè)定為:95 ℃變性3 min 1 cycle;95 ℃變性15 s;60 ℃延伸40 s;記錄熒光強(qiáng)度,40cycles。完畢后產(chǎn)生熔解曲線(melting curve,或稱解離曲線dissociation curve)。完成上述步驟后,把加好樣品的96/384孔板放在Light Cycler 480 Software Setup(Roche羅氏)中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于比較Ct值的相對(duì)定量,則根據(jù)目的基因的Ct值,按照2-ΔΔCtQ的分析方法,對(duì)于目的基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增 按表2建立實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增體系,之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如表3所示。

表2 PCR擴(kuò)增體系

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪制圖表。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析和多重差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯抗干腐病的誘導(dǎo)

用不同濃度的寡雄蛋白處理馬鈴薯塊莖或切片后再進(jìn)行損傷接種,發(fā)現(xiàn)其能不同程度的抑制病斑的擴(kuò)展。除56 μg/mL外,隨著蛋白濃度的減小,病斑的擴(kuò)展增加。其中最佳誘抗?jié)舛葹?4 μg/mL。在塊莖培養(yǎng)9 d、切片培養(yǎng)3 d后,最佳誘抗?jié)舛忍幚砗蟮牟“咧睆椒謩e為對(duì)照組的58.33%(圖1A)和79.3%(圖1B)。

圖1 不同濃度寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖(A)和切片(B)抗干腐病的誘導(dǎo)Fig.1 Induction effect of different concentrations oligandrin treatment on potato tuber(A)and slice(B)resistance to dry rot注:不同小寫(xiě)字母表示不同處理、同一時(shí)間差異顯著(p<0.05);圖2～圖4同。

2.2 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯苯丙烷代謝相關(guān)酶活性及產(chǎn)物、基因表達(dá)的影響

2.2.1 對(duì)PAL、CAD、C4H、4CL活性的影響 從圖2(A)中可以看出,寡雄蛋白誘抗處理對(duì)馬鈴薯PAL活性的影響,對(duì)照組馬鈴薯切片PAL在貯藏期間總體呈現(xiàn)較穩(wěn)定的趨勢(shì),處理組活性在12 h達(dá)到最大值,比對(duì)照高22.9%。隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)照組切片組織的CAD活性呈波浪形變化的趨勢(shì)。寡雄蛋白誘抗處理提高了馬鈴薯切片組織CAD的活性,并且在第3 d達(dá)到高峰,比對(duì)照組高22.17%(圖2B)。寡雄蛋白處理誘導(dǎo)后,馬鈴薯C4H的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在整個(gè)貯藏期間出現(xiàn)了一個(gè)高峰趨勢(shì),即在處理后第2 d出現(xiàn)峰值,比對(duì)照組高22.5%(圖2C),對(duì)照組活性在貯藏期間呈現(xiàn)出先升后降的總體趨勢(shì)。寡雄蛋白誘抗處理馬鈴薯后對(duì)其4CL活性有一定的影響,處理組活性在貯藏期間呈現(xiàn)先降后升的總體趨勢(shì),并在第4 d達(dá)到最大值,比對(duì)照高10.1%。對(duì)照組4CL活性在第2 d時(shí)出現(xiàn)峰值(圖2D)。

圖2 24 μg/mL寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯切片PAL(A)、CAD(B)、C4H(C)和4CL(D)活性的影響Fig.2 Effect of 24 μg/mL oligandrin treatment on the PAL activity(A),CAD activity(B),C4H activity(C)and 4CL activity(D)in slices of potato tuber

圖3 24 μg/mL寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯切片PAL(A)、CAD(B)、C4H(C)和4CL(D)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of 24 μg/mL oligandrin treatment on expression of PAL(A)、CAD(B)、C4H(C)和4CL(D)genes of potato tissue

2.2.2 對(duì)PAL、CAD、C4H和4CL基因表達(dá)的影響 寡雄蛋白誘抗處理誘導(dǎo)了馬鈴薯PAL基因表達(dá)量的升高,處理組馬鈴薯切片在培養(yǎng)期間總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),并且表達(dá)量在12 h達(dá)到最大值,比對(duì)照高1.69倍(圖3A)。在貯藏后期,寡雄蛋白誘導(dǎo)處理對(duì)馬鈴薯切片CAD的基因表達(dá)量有顯著影響,處理組切片組織在貯藏期間基因表達(dá)總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),并且表達(dá)量在12 h達(dá)到最大值(圖3B)。隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),處理組與對(duì)照組馬鈴薯切片的C4H基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。處理組C4H基因表達(dá)量在12 h時(shí)出現(xiàn)高峰,比對(duì)照組高53.07%(圖3C);處理和對(duì)照切片組織的4CL基因表達(dá)量在貯藏期間總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),蛋白誘抗處理在一定程度上促進(jìn)了馬鈴薯4CL基因表達(dá)量的升高,并且在12 h時(shí)達(dá)到最大值,比對(duì)照組高出1.71倍(圖3D)。

2.2.3 對(duì)總酚、類(lèi)黃酮及木質(zhì)素含量的影響 由圖4(A)可知,寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯切片組織中總酚含量有一定的影響,且處理組和對(duì)照組之間的總酚含量存在一定的差異,處理組中總酚含量整體呈先下降后升高的趨勢(shì)。寡雄蛋白誘抗處理提高了切片組織類(lèi)黃酮的含量,處理后類(lèi)黃酮總體呈先降后升的趨勢(shì),并在第3 d出現(xiàn)高峰,高于對(duì)照果實(shí)54%(圖4B)。木質(zhì)素含量在處理后開(kāi)始下降,而對(duì)照組木質(zhì)素含量則出現(xiàn)上升的趨勢(shì),此時(shí)處理組比對(duì)照減少41%(圖4C)。

圖4 24 μg/mL寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯總酚(A)、類(lèi)黃酮(B)和木質(zhì)素(C)含量的影響Fig.4 Effect of 24 μg/mL oligandrin treatment on the content of total phenolic(A),flavonoid(B)and lignin(C)in potato

3 討論

寡雄腐霉不僅能對(duì)大多數(shù)病原微生物產(chǎn)生很強(qiáng)的寄生或拮抗作用[24-25],而且也能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[5,26]。Benhamou等[6]研究發(fā)現(xiàn)番茄根系統(tǒng)的細(xì)胞并沒(méi)有因?yàn)楣研鄹咕z體的進(jìn)入而受到損害,且寡雄腐霉進(jìn)一步誘導(dǎo)番茄植株對(duì)尖孢鐮刀菌產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),阻止了病原物的侵入和生長(zhǎng)繁殖[7]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖和切片抗干腐病均具有一定的誘導(dǎo)作用,且存在濃度效應(yīng)(圖1),表明寡雄蛋白也能誘導(dǎo)采后植物組織產(chǎn)生抗性。

苯丙烷類(lèi)代謝是生物特別是植物次級(jí)代謝中很重要的一條途徑,在苯丙氨酸解氨酶(PAL)作用下,生成香豆酸、阿魏酸、綠原酸等中間產(chǎn)物,再進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、酚類(lèi)物質(zhì)、植保素等抗菌物質(zhì)[27]。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御病蟲(chóng)害、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[28]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酸羥化酶(C4H)是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶系[29]?？偡?、木質(zhì)素和類(lèi)黃酮是該代謝途徑的最終產(chǎn)物,是植物體內(nèi)最主要的抗菌物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯中苯丙烷代謝相關(guān)酶PAL、C4H、4CL、CAD酶活性及代謝產(chǎn)物總酚、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素的積累有一定影響,但是處理前期作用不明顯,后期酶活性以及代謝產(chǎn)物都有所增加(圖2、圖4),實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明其相應(yīng)酶的基因表達(dá)量也有一定的增加(圖3)。這與Picard等[5]在黃瓜和番茄幼苗上的研究結(jié)果一致。Lou等[30]研究發(fā)現(xiàn),10 μg/mL的寡雄蛋白處理番茄葉片后,在接種Botrytis cinerea后第3 d葉片組織的PPO、POD、PAL的酶活性均有所增加,同時(shí)王愛(ài)英等[31-32]研究表明,寡雄蛋白處理不僅誘導(dǎo)了番茄果實(shí)苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性的增加,同時(shí)也提高了果實(shí)總酚及木質(zhì)素含量,這均與本文的研究結(jié)果有相似之處,表明對(duì)苯丙烷代謝的促進(jìn)是寡雄蛋白誘導(dǎo)植物體抗病性提高的主要原因之一。

有關(guān)寡雄蛋白處理誘導(dǎo)馬鈴薯抗性的增強(qiáng)的其他作用機(jī)理及其在采后果蔬中的應(yīng)用技術(shù),尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖干腐病及組織苯丙烷代謝的調(diào)控作用,結(jié)果表明寡雄蛋白處理能顯著提高馬鈴薯塊莖對(duì)干腐病的抗性,其中24 μg/mL寡雄蛋白處理效果最佳,其處理后塊莖病斑直徑僅為對(duì)照的58.33%;且24 μg/mL寡雄蛋白處理能提高馬鈴薯組織的苯丙烷代謝相關(guān)酶PAL、CAD、C4H、4CL的酶活性及其基因表達(dá);抗性物質(zhì)類(lèi)黃酮及木質(zhì)素含量也因誘抗處理而提高。

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Effects of oligandrin treatment on dry rot and phenylpropanoid pathway metabolism of potato tubers

LIU Xiao,PAN Jing-yu,LI Yong-cai*,YANG Lan,GAO Chun-li,BI Yang

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Effects of oligandrin on dry rot development of potato tubers(cv. Xindaping)were evaluated throughinvivotests,regulation mechanism of oligandrin treatment on phenylpropanoid pathway metabolism of potato tubers was also revealed at biochemical and molecular level. The results showed that the dry rot development of potato tuber was effectively controlled with 56,24,18,12 and 6 μg/mL oligandrin treatments in potato tubers,and treatment with 24 μg/mL oligandrin showed the best effect as lesion diameter of potato tubers after this treatment with oligandrin was only 58.33% of the control. Further studies showed that oligandrin enhanced related enzymes activities of phenylpropanoid pathway metabolism including PAL,CAD,C4H,4CL and the corresponding gene expression of potato tuber. At the same time,antifungal substances such as total phenols,flavonoids and lignin content increased with oligandrin treatment,the content of flavonoids was 54% higher than the control 3 days after treatment. The findings suggested that oligandrin possibly increased disease resistance of potato tubers by enhancing phenylpropanoid pathway metabolism.

potato tubers;dry rot;oligandrin;phenylpropanoid pathway metabolism

2016-09-06

劉筱(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:采后果蔬貯藏與保鮮,E-mail：liuxiao0028@163.com。

*通訊作者:李永才(1972-)，男，博士，教授，研究方向:采后果蔬貯藏病害控制,E-mail：lyc@gsau.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0339-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.056