茶多酚和維生素C清除亞硝酸鹽反應(yīng)的簡化模型的構(gòu)建

侯鐘令,周才瓊

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

茶多酚和維生素C清除亞硝酸鹽反應(yīng)的簡化模型的構(gòu)建

侯鐘令,周才瓊*

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

為彌補(bǔ)常見的表達(dá)亞硝酸鹽清除能力的參數(shù)的不足以及深入研究清除反應(yīng)的動力學(xué)過程,建立了茶多酚和維生素C清除亞硝酸鹽的簡化反應(yīng)模型并推導(dǎo)出參數(shù)1/C0t0.5,其中C0為抗氧化劑濃度,t0.5為亞硝酸鹽被半數(shù)清除所需時(shí)間,并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在亞硝酸鹽濃度變化時(shí)底物與清除劑不存在固定的物質(zhì)的量的對應(yīng)關(guān)系;而對于同一種抗氧化劑,底物濃度變化時(shí)參數(shù)1/C0t0.5的值不存在顯著性差異;同時(shí)通過清除反應(yīng)的動力學(xué)過程提出了“最大效率時(shí)間”的觀點(diǎn),即在該段時(shí)間內(nèi)絕大多數(shù)亞硝酸鹽被清除。參數(shù)1/C0t0.5同時(shí)將底物濃度和反應(yīng)速率考慮在內(nèi)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)參數(shù)的不足；“最大效率時(shí)間”的觀點(diǎn)對于提高亞硝酸鹽清除劑的使用效率有一定指導(dǎo)作用。

茶多酚,維生素C,亞硝酸鹽,反應(yīng)模型,模型驗(yàn)證

亞硝酸鹽廣泛存在于各類食物中,除肉制品加工中為防腐和發(fā)色而適當(dāng)添加之外,其存在往往是不利的,以腌制蔬菜為典型[1-2]。亞硝酸鹽具有急性毒性,同時(shí),含有硝酸鹽或亞硝酸鹽的食物成分在人體消化道的酸性環(huán)境中發(fā)生亞硝基反應(yīng),并與胺類物質(zhì)合成具有強(qiáng)致癌性的N-亞硝基化合物[3-4]。因此,清除亞硝酸鹽的研究對控制腌制食品加工過程亞硝酸鹽的含量至關(guān)重要,也對膳食健康具有較好的指導(dǎo)作用。

研究表明常見的抗氧化劑對亞硝酸鹽具有較好的清除作用,常用的抗氧化劑或有抗氧化性的提取物,如含多酚提取物[5-7]、植物多酚[8-11]和維生素[12]等對亞硝酸鹽的清除能力得到了較為廣泛的研究，并找到了上述物質(zhì)清除一定濃度亞硝酸鹽底物的最適濃度。目前常采用“最優(yōu)清除濃度”和“半數(shù)清除濃度EC50”表征抗氧化劑清除亞硝酸鹽能力。但筆者認(rèn)為這兩種參數(shù)均存在一定的不足。一是反應(yīng)平衡時(shí)間未在參數(shù)中得以表現(xiàn),而反應(yīng)平衡時(shí)間顯然也能夠體現(xiàn)其清除能力;二是無法體現(xiàn)在整個清除反應(yīng)過程可能存在的反應(yīng)速率變化的情況,而速率的變化對應(yīng)用清除反應(yīng)和清除劑時(shí)的“效率”有顯著影響。因此有必要從動力學(xué)的角度對清除作用的過程進(jìn)行探究。

清除反應(yīng)過程中,N的價(jià)態(tài)隨著反應(yīng)物濃度、反應(yīng)條件等的不同而變化,具體的反應(yīng)機(jī)理較為復(fù)雜,難以用方程式明確定量地描述[12]。實(shí)驗(yàn)選用研究較多的茶多酚(Tea Polyphenols,TP)和維生素C(Vitamin C,VC),考慮到清除劑清除亞硝酸鹽后不應(yīng)當(dāng)生成為更加不適宜的物質(zhì)——高濃度TP和VC均可抑制亞硝胺的生成,而低濃度TP反而會促進(jìn)亞硝胺生成[13-15];同時(shí)以簡化的思路考慮VC和清除劑的作用機(jī)理——當(dāng)?shù)孜飦喯跛猁}與清除劑濃度之比足夠大時(shí),反應(yīng)中清除劑濃度相對變化小,可認(rèn)為濃度近似恒定。由此,在人為設(shè)置的較高濃度清除劑條件下,對清除反應(yīng)的描述可以簡化為一次反應(yīng)。本研究旨在探究和驗(yàn)證基于以上兩點(diǎn)考慮所建立的模型是否可以正確地表征清除劑清除亞硝酸鹽的能力,并通過探究反應(yīng)的動力學(xué)過程以期找到某些具有指導(dǎo)作用的規(guī)律。

表1 實(shí)驗(yàn)組C1～C6加入的清除劑的體積數(shù)

注:編號a的實(shí)驗(yàn)組用于測定EC50,編號b的實(shí)驗(yàn)組用于測定最優(yōu)清除濃度;C1～C3為TP實(shí)驗(yàn)組,C4～C6為VC實(shí)驗(yàn)組。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品,重慶市北碚區(qū)化學(xué)試劑廠;茶多酚 食品級,重慶青陽藥業(yè)有限公司;維生素C 分析純,重慶青陽藥業(yè)有限公司。

FA2004A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;721型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝酸鹽清除率 采用最常用的對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺法[6-9],通過反應(yīng)前后亞硝酸鹽溶液的吸光度之比計(jì)算清除率如下。

注:A1:未添加清除劑時(shí)反應(yīng)液的吸光度;Ax:添加清除劑之后反應(yīng)液的吸光度;A′x:清除劑吸光度本底。

1.2.2 亞硝酸鹽清除反應(yīng)模型建立

1.2.2.1 反應(yīng)模型建立的原理 當(dāng)清除反應(yīng)被簡化地看做一次反應(yīng)時(shí),易得到:

lnC=K0C0t

其中C和C0分別表示亞硝酸鹽殘余濃度和清除劑初始濃度,K0表示該反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)。測亞硝酸鹽的殘余量,則殘余率y與C成正相關(guān),即

lny=K1C0t

其中K1為反應(yīng)速率常數(shù)經(jīng)過換算后得到的比例系數(shù)。

取y=0.5即亞硝酸鹽被半數(shù)清除令式子左邊為常數(shù)。則參數(shù)C0t0.5為與反應(yīng)速率常數(shù)有關(guān)的定值。為使參數(shù)值和清除能力大小同向變化,取其倒數(shù)得參數(shù)1/C0t0.5。從推導(dǎo)過程及參數(shù)的結(jié)構(gòu)來看,參數(shù)中含有反應(yīng)速率常數(shù)有關(guān)的定值,因此該參數(shù)能夠表示出清除劑清除作用的強(qiáng)弱,同時(shí)參數(shù)中含有清除劑初始濃度以及反應(yīng)時(shí)間,故又將清除劑濃度和反應(yīng)速率考慮在內(nèi)。

1.2.2.2 最優(yōu)清除濃度和EC50的相關(guān)分析 參考李桂星[6]、吳守林[11]等的研究和預(yù)實(shí)驗(yàn),配制不同濃度清除劑使用液和亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,在一定體積的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同體積的清除劑使用液以得到不同濃度的清除劑溶液。加入亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液體積和清除劑體積見表1。加入5 mL pH=3.0的0.5 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液,加入純水使反應(yīng)溶液總體積為10 mL。37 ℃恒溫水浴反應(yīng)60 min。每個實(shí)驗(yàn)組均做3組平行實(shí)驗(yàn)、1組空白對照以及1組清除劑本底。

按照常用的方法計(jì)算EC50:作清除率-體積(ω-V)圖,當(dāng)ω=0.5時(shí),得V0.5,則

EC50=V0.5·C/10

同時(shí)找到最優(yōu)清除濃度:將清除率達(dá)到最大時(shí)對應(yīng)的最小清除劑濃度(換算為加入的初始濃度),記做最優(yōu)清除濃度。將底物濃度與最大清除率的積與最優(yōu)清除濃度之比(乘以合適的系數(shù)以便于觀察)記做清除效率。

1.2.2.3 參數(shù)1/C0t0.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以TP為例,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,體積分?jǐn)?shù)為1%～4%的清除劑與底物反應(yīng)時(shí),滿足清除劑與底物濃度之比足夠大的條件,且底物濃度降低第一個對數(shù)周期(90%)所需時(shí)間適中(1～10 min)。選擇上述濃度TP溶液50 mL分別與50 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,并加入檸檬酸鈉-鹽酸和純水緩沖液調(diào)節(jié)pH至3,以純水補(bǔ)足反應(yīng)液體積至150 mL。每隔一定時(shí)間取5 mL反應(yīng)液進(jìn)行比色。樣品濃度和采樣方案見表2。實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作時(shí)先將清除劑、緩沖劑配制、純水按量配置至總體積150 mL置于磁力攪拌器上,再加入1 mL 250 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)樣,加入后立即計(jì)時(shí)。

VC同樣經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測得適宜濃度,濃度見表2。按照同樣的條件進(jìn)行反應(yīng)。

表2 實(shí)驗(yàn)組D1～D2清除劑濃度

1.2.2.4 清除速率變化情況的探究 結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)出方案A和方案B兩種取樣方法,以確保準(zhǔn)確性和效率的統(tǒng)一。方案A為前10 min每1 min取樣一次,10～30 min每5 min取樣一次,30～60 min每10 min取樣一次;方案B僅為前10 min每1 min取樣一次。具體應(yīng)用見表2,對采用了取樣方案A的實(shí)驗(yàn)組,繪制其ln y-t圖像,以更加全面地探究亞硝酸鹽清除率ω與反應(yīng)時(shí)間之間可能存在的規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)初步整理(計(jì)算清除率)使用Excel 2016(Microsoft Corporation),以SPSS 22.0(IBM Co.Ltd)和MATLAB 2014b(Mathwork Lnc.)軟件進(jìn)行回歸分析并以α=0.05的最小顯著極差(LSR)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)清除濃度和EC50存在的局限性

按照1.2.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別找到實(shí)驗(yàn)組C1～C6的最優(yōu)清除濃度,計(jì)算EC50和清除效率。結(jié)果如表3所示。

表3 各組清除劑半數(shù)清除濃度(EC50)、最優(yōu)清除濃度、清除效率

注：C1～C3組為茶多酚(TP)對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組，不同字母表示茶多酚組數(shù)據(jù)間差異顯著(p<0.05)；C4～C6組為VC對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組，不同字母表示VC組數(shù)據(jù)間差異顯著(p<0.05)。

對上述數(shù)據(jù)分析可見,TP和VC,濃度加倍和減半時(shí)(10 μg/mL變?yōu)? μg/mL和20 μg/mL),它們的EC50和最優(yōu)清除濃度并沒有同樣簡單地加倍和減半。進(jìn)而由“清除效率”這個量的計(jì)算方法可知其表征了清除劑與底物反應(yīng)時(shí)物質(zhì)的量的對應(yīng)關(guān)系。TP和VC,濃度加倍和減半時(shí),每個底物濃度對應(yīng)的清除效率也有顯著差異,表明上述兩種清除劑與亞硝酸鹽反應(yīng)時(shí),底物和清除劑的物質(zhì)的量的對應(yīng)關(guān)系隨著濃度的改變而變化。因此,從反應(yīng)物物質(zhì)的量的對應(yīng)情況來看,僅僅用濃度的相關(guān)參數(shù)表示抗氧化劑對亞硝酸鹽的清除作用是不全面的。

2.2 模型驗(yàn)證

圖1為分別設(shè)置不同的TP濃度時(shí)的lny-t曲線。取反應(yīng)開始至清除率達(dá)到約90%(殘余率的對數(shù)ln y=ln0.1≈-2.3)附近的點(diǎn),可以看到曲線存在著較好的線性關(guān)系。這一線性關(guān)系符合一次反應(yīng)的假設(shè)。當(dāng)濃度增加時(shí),曲線的斜率絕對值的顯著增大即反應(yīng)速率顯著增大,這顯然符合清除反應(yīng)的原理。

圖1 不同濃度的TP lny-t間圖Fig.1 lny vs time of different concentration of TP

表4 各樣品半數(shù)清除時(shí)間、趨勢線方程斜率、相關(guān)系數(shù)(R2)和1/C0t0.5

注:同列相同字母表示無顯著差異。

計(jì)算圖1中各直線的斜率、相關(guān)系數(shù),并將ln y=0.5代入直線方程求出半數(shù)清除時(shí)間,計(jì)算出參數(shù)1/C0t0.5如表4所示。當(dāng)取TP濃度為0.1%和0.5%時(shí),由相關(guān)系數(shù)可知該濃度下ln y與t不存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系。這證明清除劑的濃度不足以達(dá)到遠(yuǎn)大于亞硝酸鹽濃度的水平時(shí),一次反應(yīng)的假設(shè)無法成立。對于其余組數(shù)據(jù),取α=0.05,以LSR法對參數(shù)1/C0t0.5值分析可知,當(dāng)清除劑濃度在一定范圍內(nèi)變化時(shí),參數(shù)1/C0t0.5的值無顯著差異。即新參數(shù)的值在該段時(shí)間內(nèi)不隨著清除劑濃度變化而變化。證明在適當(dāng)?shù)臈l件下,參數(shù)1/C0t0.5可以衡量清除劑對亞硝酸鹽的清除效果,并且避免了EC50和最優(yōu)清除濃度所具有的依賴底物濃度和忽視平衡時(shí)間的不足。

2.3 對清除率-時(shí)間的分析

將延長反應(yīng)時(shí)間至60 min的實(shí)驗(yàn)組取較為典型的結(jié)果繪制ln y-t如圖2所示。在清除率達(dá)到95%(殘余率的對數(shù)ln y=ln0.05≈-3.0)附近后,圖像出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn),轉(zhuǎn)折之后的圖線斜率絕對值顯著減小,這與周才瓊[16]的報(bào)道中的數(shù)據(jù)相吻合。針對轉(zhuǎn)折點(diǎn)后的反應(yīng)情況分析數(shù)據(jù),轉(zhuǎn)折點(diǎn)之后的較長一段時(shí)間(60 min)內(nèi),ln y與t仍然具有較顯著的線性相關(guān)。直線斜率和相關(guān)系數(shù)見表5,在該段時(shí)間內(nèi),直線斜率絕對值較小,顯示清除速率很小。

圖2 延長反應(yīng)時(shí)間后的TP各濃度lny-t間圖Fig.2 lny vs time of different concentration of TP at extenden reaction time

樣品濃度(%)斜率相關(guān)系數(shù)TP1.00-0.02150.96602.00-0.02070.95594.00-0.03280.9724VC2.00-0.01800.95144.00-0.01960.9647

分別將轉(zhuǎn)折點(diǎn)前后的直線延長得到交點(diǎn),計(jì)算出交點(diǎn)對應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間、該時(shí)間對應(yīng)的清除率ω1、該時(shí)間至60 min間清除率變化量Δω見表6。將兩直線的交點(diǎn)即轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對應(yīng)的時(shí)間定義為“最大效率時(shí)間(TMAX)”?？梢钥闯?在TMAX之前的時(shí)間段內(nèi),清除速率較大,而TMAX之后的較長時(shí)間清除率難以增加。即在清除反應(yīng)中,清除大部分底物所需的時(shí)間較短,而清除剩余部分底物則需要較長的時(shí)間。這可能是因?yàn)榍宄齽┡c底物反應(yīng)的產(chǎn)物積累,以及反應(yīng)物濃度的變化,對反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行有阻礙作用。

表6 不同濃度清除劑最大效率時(shí)間和清除率

3 結(jié)論與討論

茶多酚和維生素C對亞硝酸鹽的清除作用效果已得到了廣泛認(rèn)同。即在模擬胃液條件下茶多酚對亞硝酸鹽的清除作用總體遠(yuǎn)大于VC[17-19]。本研究所得到的結(jié)果中,TP和VC的1/C0t0.5值的差異同樣可以印證這一點(diǎn)。但這并不能否認(rèn)其余研究中采用的方法和得到的結(jié)果的意義。

這一參數(shù)的理論推導(dǎo)過程揭示了它是與化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)有關(guān)的一個量,即該參數(shù)是一個與清除劑本身物質(zhì)結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)有關(guān)的量。本研究中該參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證的過程中,采用了現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中一般不需用的較高濃度的清除劑,這一設(shè)計(jì)的目的是為了體現(xiàn)出清除劑本身的性質(zhì)并且便捷地通過實(shí)驗(yàn)得出并驗(yàn)證參數(shù)1/C0t0.5的值,而非旨在以此種高濃度清除劑應(yīng)到于實(shí)際生產(chǎn)中。在使用較低濃度的清除劑時(shí),本研究基于簡化的一次反應(yīng)所建立的模型雖不再適用,但該參數(shù)1/C0t0.5所體現(xiàn)出的清除劑的固有性質(zhì)同樣存在。該參數(shù)可能能夠推廣到更多的抗氧化劑以表征它們對亞硝酸鹽的清除作用并用于比較清除能力的差異,這有待于更加深入的研究。

目前普遍采用的EC50和最優(yōu)清除濃度表示抗氧化劑對亞硝酸鹽清除效果具有一定局限性。不僅在于其忽視了反應(yīng)速率和對底物濃度有很大的依賴性。并且多數(shù)情況下清除劑與亞硝酸鹽底物不存在簡單的數(shù)量對應(yīng)關(guān)系。參數(shù)1/C0t0.5同時(shí)將反應(yīng)速率和清除劑濃度考慮在內(nèi),可以在一定程度上克服上述不足。通過對清除作用的動力學(xué)過程進(jìn)行分析,提出了最大效率時(shí)間的觀點(diǎn):在清除反應(yīng)中,清除大部分底物所需的時(shí)間較短,而欲清除剩余部分底物則需要的時(shí)間顯著增加。這對亞硝酸鹽清除劑的使用可能有一定的指導(dǎo)作用。

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A simplified model and it’s verification of nitrite scavenging reaction with tea polyphenols and vitamin C

HOU Zhong-ling,ZHOU Cai-qiong*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

To making up the shortage of commonly-used parameter for scavenging effect to nitrite,a simplified mathematical model of nitrite scavenging reaction with tea polyphenols and vitamin C was established and the parameter 1/C0t0.5on nitrite under certain conditions was derived,where C0was concentration of the antioxidants and t0.5was the time taken to eliminate half amount of nitrite. It’s proved that there isn’t a certen and constant magnitude relation among nitrite and scavenger when nitrite changes its concentration. However,significant difference of the value of 1/C0t0. 5was not found during the change. Meanwhile,a viewpoint,time of maximum efficiency,which means the majority of nitrite will be eliminated in a short time during the clear reaction,was put forward. The parameter 1/C0t0.5,which takes the concentration of reactant and the reaction rate into consideration, make up for the deficiency of commonly-used parameter,and the viewpoint,time of maximum efficiency might make contribute to the practical application.

tea polyphenols;vitamin C;nitrite;reaction model;model validation

2016-09-01

侯鐘令(1995-)，男，本科生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：lengchen95@gmail.com。

*通訊作者:周才瓊(1964-)，女，博士，教授，主要從事食品營養(yǎng)化學(xué)相關(guān)教學(xué)與科研方面的研究，E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn。

西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院(百超)創(chuàng)新項(xiàng)目。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.014