新疆漢族及維吾爾族結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因突變分析

龐雪蓮，王玻瑋，李巧新，馬志萍，師 藝，張 巍，崔文麗

新疆漢族及維吾爾族結(jié)直腸癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因突變分析

龐雪蓮，王?，|，李巧新，馬志萍，師 藝，張 巍，崔文麗

目的 觀察新疆地區(qū)漢族、維吾爾族人群中結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因狀態(tài)的差異及其與CRC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 收集2012年～2014年間新疆地區(qū)漢族及維吾爾族CRC標(biāo)本189例，其中52例有配對轉(zhuǎn)移灶。采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)進(jìn)行KRAS基因12、13密碼子已知常見突變位點(diǎn)檢測。結(jié)果 KRAS基因在CRC原發(fā)灶病例中漢族、維吾爾族的突變率分別為42.8%(62/145)、43.2%(19/44)，兩者差異無顯著性(P>0.05)，T3/T4期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中突變率較高(P<0.05)，但與患者性別、民族、年齡、分化程度、TNM分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、原發(fā)灶所在的部位均無相關(guān)性(P>0.05)。KRAS基因在CRC轉(zhuǎn)移灶中漢族、維吾爾族的突變率分別為33.3% (12/36)、31.3% (5/16)，兩者差異無顯著性(P>0.05)，并發(fā)現(xiàn)年齡≥65歲者突變率較高(P<0.05)，與所研究的其他臨床病理特征無相關(guān)性。52例轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因的突變率為32.7%(17/52)，而對應(yīng)的原發(fā)灶突變率達(dá)50%(26/52)，明顯高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.000 1)，轉(zhuǎn)移灶突變類型與原發(fā)灶一致。結(jié)論 KRAS基因在浸潤較深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及65歲以上發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRC中突變率較高，在原發(fā)灶的突變率高于配對轉(zhuǎn)移灶。KRAS基因突變率在新疆漢族、維吾爾族CRC患者中差異無顯著性，提示KRAS基因突變促進(jìn)CRC的進(jìn)展，并且在原發(fā)灶中更易發(fā)生突變，但漢族、維吾爾族間無差異。

結(jié)直腸腫瘤；KRAS基因；漢族；維吾爾族；原發(fā)灶；轉(zhuǎn)移灶

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球常見的惡性腫瘤之一[1]。根據(jù)WHO報(bào)道：在常見惡性腫瘤中男性CRC發(fā)病率位居第3位，女性位居第2位。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CRC的發(fā)病與地理位置具有相關(guān)性[2]。中國CRC的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)30萬例，居全球首位[3]。CRC的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因共同參與的結(jié)果[4]，表皮生長因子受體(EGFR)信號通路與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，KRAS位于EGFR下游，KRAS基因是否發(fā)生突變對CRC患者能否接受EGFR抗體治療有重要臨床參考價值[5]。大樣本、多中心Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示KRAS基因2號外顯子第12、13密碼子基因狀態(tài)與EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗、帕尼單抗的療效呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)其為野生型時患者才可從EGFR抗體治療中獲益[6]，因此準(zhǔn)確檢測結(jié)直腸患者KRAS基因狀態(tài)對患者能否接受靶向治療意義重大。

亞洲人群KRAS基因的突變率低于白種人和黑種人，但是不同民族的CRC患者KRAS基因突變率是否一致尚未見報(bào)道[7]。新疆地處內(nèi)陸亞洲中心，維吾爾族是新疆地區(qū)的特有民族，維吾爾族與本地區(qū)漢族CRC患者KRAS基因狀態(tài)是否有差異，KRAS基因狀態(tài)與患者臨床病理特征之間是否有關(guān)，以及原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶之間是否存在異質(zhì)性？本實(shí)驗(yàn)將針對以上問題進(jìn)行分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，且術(shù)前均獲得患者知情同意書。選擇新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年1月～2014年12月間189例術(shù)前未經(jīng)任何治療的CRC手術(shù)標(biāo)本，包括145例漢族及44例維吾爾族，其中52例有配對轉(zhuǎn)移灶，由兩名資深病理醫(yī)師確診，按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤進(jìn)行病理分型，病例組織均為腺癌，52例配對轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本包括45例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，7例肝/肺轉(zhuǎn)移灶。被檢樣本均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控，納入標(biāo)準(zhǔn)必須符合：(1)組織中腫瘤細(xì)胞所占比例≥30%；(2)所有腫瘤細(xì)胞的總數(shù)不能低于200個。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用Qiagen DNA Min Kit(51304)，按照試劑說明書完成石蠟組織DNA提取，所提取DNA純度均達(dá)到：OD260/280=(1.8±0.2)，OD260/230≥1.7，濃度20～50 ng/μL，DNA提取試劑盒購于德國Qiagen公司。

1.2.2 KRAS基因突變檢測 按照KRAS突變檢測試劑盒說明書，每個樣本含8個孔位，分別用于檢測12密碼子的G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A位點(diǎn)，13密碼子的G13D位點(diǎn)，以及內(nèi)參基因。采用Agilent Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，人KRAS基因突變檢測試劑盒購于北京雅康博公司。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 每批檢測均含陰性及陽性質(zhì)控品，每個孔位均有FAM和HEX兩個通道，陰性質(zhì)控兩通道均為陰性，陽性質(zhì)控兩通道均為陽性；被檢測樣本HEX通道(為內(nèi)控基因)陽性，滿足以上條件才可判讀KRAS基因位點(diǎn)是否突變，樣本FAM通道Ct值<28判讀為突變型(圖1)。

圖1 A.樣本除陰性對照余內(nèi)控HEX通道位點(diǎn)均為陽性；B.FAM通道除了陽性對照位點(diǎn)陽性，余位點(diǎn)均陰性，判讀為KRAS基因野生型；C.FAM通道除了陽性對照位點(diǎn)陽性，有1個位點(diǎn)陽性，判讀為KRAS基因某位點(diǎn)單突變型；D.FAM通道除了陽性對照位點(diǎn)陽性，有2個位點(diǎn)陽性，判讀為KRAS基因某位點(diǎn)雙重突變

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因在漢族及維吾爾族CRC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的基因狀態(tài) 189例CRC原發(fā)灶病例中KRAS基因的總突變率為42.9%(81/189)，漢族和維吾爾族分別為42.8%(62/145)、43.2%(19/44)，兩者差異無顯著性(P>0.05)。其中69例為12密碼子突變(85.2%，69/81)，僅12例為13密碼子突變(14.8%，12/81)。以單突變?yōu)橹鳎?例發(fā)生雙重突變(4.9%，4/81)，突變率最高的位點(diǎn)是G12D，占總突變的38.3%(31/81)(表1)。52例配對轉(zhuǎn)移灶中有45例為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，7例為肝/肺轉(zhuǎn)移灶，共17例發(fā)生KRAS基因突變，突變率為32.7%(17/52)，漢族、維吾爾族突變率分別為33.3%(12/36)、31.3%(5/16)，兩者差異無顯著性(P>0.05)，均為12密碼子突變，突變率最高的位點(diǎn)也是G12D(47.1%，8/17)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的突變率為17.8%(8/45)，肝/肺轉(zhuǎn)移灶的突變率為57.1%(4/7)，肝/肺轉(zhuǎn)移灶的突變率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(P<0.05，表2)。

2.2 KRAS基因突變與CRC臨床病理特征的關(guān)系 在原發(fā)灶病例中，KRAS基因突變在腫瘤浸潤程度較深(T3+T4)(48.1%，63/131)及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1+N2)者中的突變率較高(54.4%，37/68)(P<0.05)，但與患者性別、民族、年齡、腫瘤分化程度、組織學(xué)分型以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05，表1)。在轉(zhuǎn)移灶病例中發(fā)現(xiàn)KRAS基因在≥65歲時突變率較高(50.0%，10/20)(P<0.05)，此外與所研究的其他臨床病理特征無相關(guān)性(P>0.05，表2)。

原發(fā)灶病例中12密碼子突變69例，13密碼子突變12例，發(fā)現(xiàn)12密碼子高、中分化時突變率高，(71.0%，49/69)，而13密碼子則在低分化時突變率較高(66.7%，8/12)。Ⅲ+Ⅳ期時12密碼子突變率較高(53.6%，37/69)，但是13密碼子在Ⅰ+Ⅱ期時突變率較高(83.3%，10/12)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時12密碼子突變率較高(50.7%，35/69)，但是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時13密碼子突變率較高，占13密碼子突變的83.3%(10/12)(表1)。

2.3 KRAS基因狀態(tài)在CRC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的比較 在52例配對的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶CRC中，KRAS基因狀態(tài)并不一致，原發(fā)灶突變型26例、野生型26例，在與之配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中突變型17例、野生型35例，有9例原發(fā)灶為突變型轉(zhuǎn)移灶為野生型，并未出現(xiàn)原發(fā)灶野生型轉(zhuǎn)移灶突變型的情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)原發(fā)灶的突變率明顯高于轉(zhuǎn)移灶(P<0.001)，發(fā)生突變的轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶突變類型一致(表3)。

應(yīng)用配對χ2檢驗(yàn)CRC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間KRAS基因狀態(tài)是否有差異，原發(fā)灶突變型26例，野生型26例，在與之配對的轉(zhuǎn)移灶中突變型17例，野生型35例，有9例原發(fā)灶為突變型，轉(zhuǎn)移灶為野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

近年來很多學(xué)者對KRAS基因與CRC的相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)KRAS基因在CRC中的突變率達(dá)35%～40%，突變主要發(fā)生在12、13密碼子，其中以12密碼子為主[8]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KRAS基因在CRC原發(fā)灶中的總突變率為42.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果接近，但在轉(zhuǎn)移灶中的突變率僅為32.7%，比文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)偏低，因此討論原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶KRAS基因異質(zhì)性很有意義。

表1 CRC原發(fā)灶KRAS基因及其12、13密碼子基因狀態(tài)及與之間的關(guān)系[n(%)]

Yamauchi等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)直腸癌更易發(fā)生KRAS基因突變，但本組實(shí)驗(yàn)卻未發(fā)現(xiàn)結(jié)腸、直腸KRAS基因狀態(tài)存在差異。關(guān)于結(jié)腸KRAS基因突變率，文獻(xiàn)報(bào)道存在不一致性，如Bleekr等發(fā)現(xiàn)右半側(cè)結(jié)腸癌突變率較高，Zulhabr等發(fā)現(xiàn)左側(cè)突變率較高，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)左側(cè)、右側(cè)及橫結(jié)腸KRAS基因突變率差異無顯著性。針對收集的結(jié)腸癌樣本量分析，Bleeker等[10]收集了55例，Zulhabri等[11]收集了70例，本實(shí)驗(yàn)共有100例結(jié)腸癌標(biāo)本。以上研究樣本量均不大，而且來自不同地域，有待于擴(kuò)大樣本，大樣本多因素分析，明確KRAS基因突變與結(jié)腸癌部位的相關(guān)性。

有很多學(xué)者研究了KRAS基因的狀態(tài)與CRC患者臨床病理特征的相關(guān)性。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KRAS基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度較深的CRC病例中突變率較高，也有學(xué)者得到相似的結(jié)果[12]，這恰好反應(yīng)了腫瘤惡性程度與KRAS基因突變呈正相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CRC轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因在≥65歲者中突變率高，Kadowaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)65歲以上的CRC患者生存率更低，這與KRAS基因突變導(dǎo)致高齡患者不良預(yù)后密切相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS基因狀態(tài)在漢族與維吾爾族CRC患者之間無差異，馬玲等[14]發(fā)現(xiàn)維吾爾族肺癌患者KRAS基因突變率高于漢族患者，但是目前并未發(fā)現(xiàn)KRAS基因在不同民族或種族CRC患者間有差異[15-16]，這提示KRAS基因狀態(tài)在同一地區(qū)不同民族CRC患者間可能無差異，也有待于大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS基因在配對的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶樣本中突變率有差異，原發(fā)灶的突變率高于轉(zhuǎn)移灶，并且轉(zhuǎn)移灶突變型的病例原發(fā)灶必定為突變型，但是原發(fā)灶為突變型的樣本轉(zhuǎn)移灶可能為野生型。目前關(guān)于CRC中KRAS基因原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性研究很多，結(jié)果也大相徑庭， Kleist等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因在發(fā)生肝/肺轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中突變率不一致，既有原發(fā)灶野生型轉(zhuǎn)移灶突變型也有原發(fā)灶突變型轉(zhuǎn)移灶野生型，但是也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)KRAS基因在原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶之間存在一致性，尤其是非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶一致性較高[19]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS基因狀態(tài)在原發(fā)灶與肝/肺轉(zhuǎn)移灶一致，但是原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間不一致，前者高于后者。腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生突變，在腫瘤形成和發(fā)育的不同階段，具有不同的基因突變和表達(dá)譜；腫瘤組織存在異克隆生長現(xiàn)象，因此轉(zhuǎn)移病灶和原發(fā)灶之間可能具有不同的生物學(xué)特性和特異性基因表達(dá)特點(diǎn)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶通常樣本量較小或腫瘤細(xì)胞比例低，可能發(fā)生假陰性結(jié)果，但是本組實(shí)驗(yàn)納入樣本的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本均是通過嚴(yán)格篩查，腫瘤細(xì)胞比例不足者予以剔除，所以假陰性可能性小。淋巴細(xì)胞因子可以作用于RAS信號通路影響KRAS基因的表達(dá)[20]，因此推測淋巴細(xì)胞的自身免疫抑制了KRAS基因發(fā)生突變。

表2 CRC轉(zhuǎn)移灶KRAS基因狀態(tài)與臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

表3 KRAS基因突變狀態(tài)在CRC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的比較[n(%)]

KRAS基因在原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義，尤其是對于只能獲取轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本的晚期腫瘤患者具有重要指導(dǎo)意義，選取肝肺轉(zhuǎn)移灶比選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的一致性更高。

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時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.044.html

國家自然科學(xué)基金(81360352)、國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金(81560035)、新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C032)、科技支撐計(jì)劃(14495800300)、自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(qn2015bs011)

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830054

龐雪蓮，女，碩士，醫(yī)師。Tel: (0991)4362806，E-mail: 448665867@qq.com 崔文麗，女，博士，副主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: cwl860@163.com

R 735.3

A

1001-7399(2017)02-0195-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.019

接受日期：2016-09-21