菊芋葉中多酚類成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

袁曉艷,封冬梅,陳曉蘭

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 分析化學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

菊芋葉中多酚類成分的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

袁曉艷,封冬梅,陳曉蘭

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 分析化學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

采用不同極性溶劑提取了菊芋葉中的多酚類成分，經(jīng)正、反相色譜結(jié)合的方法分離純化了這些成分，并根據(jù)UV、MS和NMR數(shù)據(jù)鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從菊芋葉中分離并鑒定的7個(gè)多酚化合物分別為咖啡酸(1)、3,5-二咖啡?？崴?2)、1,5-二咖啡?？崴?3)、4,5-二咖啡?？崴?4)、3,5-二咖啡酰奎尼酸甲酯(5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5為酚酸類化合物,化合物6～7為黃酮類化合物。僅通過1H-NMR即可確定4個(gè)二咖啡?？崴峄衔镏?個(gè)咖啡?；娜〈恢谩?/p>

菊芋葉;酚酸;黃酮;分離;結(jié)構(gòu)鑒定

菊芋(HelianthustuberosusL.)原產(chǎn)于北美洲,俗稱洋姜、鬼子姜,為菊科(Compositae)向日葵屬(HelianthusL.)多年生草本植物。傳統(tǒng)上,菊芋被當(dāng)作食物或者動(dòng)物飼料。在過去的2個(gè)世紀(jì)里,人們發(fā)現(xiàn)菊芋塊莖富含菊糖,是自然界已知含有菊糖的36000種植物中菊糖含量最高的植物之一,開始開發(fā)利用菊芋中的菊粉、低聚果糖和果糖等作為功能性食品的添加劑[1-2]。菊芋地上部分主要含有酚酸、黃酮及倍半萜內(nèi)酯類化合物,具有抗氧化、殺蟲抑菌、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等活性[3-9]，但對(duì)其研究開發(fā)較少。筆者曾利用高效液相色譜電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),初步鑒定出菊芋葉中7個(gè)綠原酸類化合物，并測(cè)定了菊芋葉中含量最大的成分綠原酸的含量[3,10]。本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步分離純化研究,從菊芋葉中分離得到7個(gè)多酚類化合物,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

1 儀器、試劑及材料

Bruker Avance-500核磁共振儀； Thermo Finnigan TSQ質(zhì)譜儀,電噴霧離子源(ESI)； Waters DP-4000制備液相色譜, Waters Prep Nova-Pak C18徑向加壓柱(300 mm ×20 mm,6 μm)； Waters 2690高效液相色譜儀,配996型二極管陣列檢測(cè)器。聚酰胺樹脂(30～60目)，為浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠生產(chǎn); H60型薄層層析硅膠(200～300目)，為青島海洋化工廠生產(chǎn);石油醚(分析純,科密歐);乙酸乙酯(分析純,科密歐);甲醇(色譜純,山東禹王); Millipore超純水。

實(shí)驗(yàn)所用菊芋葉于2010年11月采摘于陜西榆林地區(qū),由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院劉兆普教授鑒定為菊科向日葵屬菊芋的干燥葉子。

2 提取和分離

2.1 酚酸類化合物的提取分離

將干燥菊芋葉1 kg粉碎后,以20倍量(v/m)60%乙醇回流提取2次；合并提取液，減壓濃縮得浸膏248 g,浸膏得率為24.8%。取200 g浸膏用熱水溶解,對(duì)懸浮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次后濃縮至浸膏狀,分別得到石油醚萃取物6.4 g、乙酸乙酯萃取物53.0 g、正丁醇萃取物41.0 g,水部位重105.0 g。其中乙酸乙酯萃取部位過聚酰胺樹脂，以乙醇-水梯度洗脫[10∶(90～100)∶0]，得6個(gè)部位P1～P6；經(jīng)高效液相色譜分析后,合并P3、P4部位,以反相制備液相色譜在洗脫劑甲醇-0.5%乙酸水(36∶64)等度洗脫條件下得到化合物1(80.20 mg)、2(48.60 mg)、3(500.00 mg)、4(35.00 mg)、5(20.00 mg)。

2.2 黃酮類化合物的提取分離

稱取菊芋葉6 kg,以乙酸乙酯浸泡提取,每次浸泡24 h,提取3次,過濾后合并提取液,減壓濃縮至浸膏狀,浸膏以甲醇溶解,過濾除去甲醇不溶物,得到菊芋總提取物浸膏170 g。將浸膏過200～300目硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫[90∶(10～20)∶80],收集石油醚∶乙酸乙酯(9∶1)、石油醚∶乙酸乙酯(8∶2)、石油醚∶乙酸乙酯(6∶4)、石油醚∶乙酸乙酯(4∶6)、石油醚∶乙酸乙酯(2∶8)洗脫液,分別命名為F1～ F5；F3部位過H60型薄層層析硅膠裝填中壓制備柱進(jìn)行進(jìn)一步分離,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(90∶10、80∶20、70∶30、60∶40),最后以甲醇沖洗色譜柱,得P1～P6六個(gè)洗脫部位。P3部位得黃色針狀晶體,過濾得化合物6(236.00 mg); P4部位放置后有淡黃色晶體沉淀,過濾,得化合物7(148.00 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為淡黃色粉末,易溶于熱水及甲醇, mp 208～210 ℃,UV(MeOH-H2O):239.4,323.2 nm。1H-NMR(DMSO-d6,500 MHz):7.42 (1H,d,J=5.8 Hz,H-7),7.03 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.96(1H, dd, J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.76(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.17(1H,d,J=15.8 Hz,H-8)。13C-NMR(DMSO-d6,125 MHz):168.4 (C-9),148.1(C-4),145.5(C-7),144.5(C-3),125.7(C-1),121.1(C-8),115.73(C-2),115.12(C-5),114.61(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,故確定化合物1為咖啡酸。

3.2 化合物6的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物6為黃色針狀晶體,易溶于氯仿,三氯化鐵顯色陽性。ESI-MS:344(M+),329,314,299,依次失去3個(gè)甲基。1H-NMR(CDCl3, 300 MHz)δ:12.75(1H,s,C5-OH),7.89(2H,dd,J=2,6.8 Hz,H-2′,6′), 7.04(2H,dd,J=2.72 Hz, H-3′,4′),6.59(1H,s,H-3),3.901～4.021(3H each,s,OMe×3)。C-NMR(CDCl3,300 Hz)δ:183.2(C-4),164.0(C-2),162.9(C-4′),149.0(C-7),148.6(C-9),146.0(C-5),130.9(C-6),130.1(C-2′,C-6′),127.6(C-1′),115.7(C-3′,C-4′),104.8(C-10)103.9(C-3),62.03(-OCH3),61.2(-OCH3),55.8(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致,鑒定化合物6為5,8-diOH-6,7,4′-triOMe(pedunculin)。

3.3 化合物7的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物7為黃色粉末(氯仿)，mp:190～192 ℃,ESI-MS:374(M+),359,344,329,314,依次失去4個(gè)甲基。1H-NMR(CDCl3,300 MHz)δ:7.60(1H,dd,J=2.1,8.4 Hz,H-6′),7.42(1H,d,J=1.8 Hz,H-5′),7.01(1H,d,J=8.7 Hz,H-2′),6.76(1H,s,H-3),3.98～4.05(3H each,s,OMe×4)。C-NMR(CDCl3,300 Hz) δ:182.3(C-4),162.9(C-2),152.1(C-3′),150.9(C-4′),149.0(C-9),148.3(C-7),145.4(C-6),131.5(C-5),127.9(C-8),122.9(C-1′),119.7(C-6′),111.7(C-5′),109.1(C-2′),103.3(C-10),102.9(C-3),61.1(-OCH3),60.1(-OCH3),55.7(-OCH3×2)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物7為5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone。

3.4 化合物2～5的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2～5在242 nm和327 nm附近有最大紫外吸收,一級(jí)質(zhì)譜負(fù)離子全掃描結(jié)果表明化合物2～4的m/z均為514.9,化合物5的m/z為529。負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜掃描結(jié)果顯示,化合物2～5均存在191、179、173、161四個(gè)特征離子碎片,應(yīng)為[quinic acid-H]-、[caffeic acid-H]-、[quinic acid- H2O -H]-和[caffeic acid-H2O-H]-。由此可以確定化合物2～5為二咖啡?？崴犷惢衔?。單從一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜難以確定咖啡酰基在奎尼酸上的取代位置,必須輔以NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行確證。由于咖啡?；〈恢玫牟煌梢砸鹂崴嵘螲發(fā)生相應(yīng)的特征化學(xué)位移改變,僅以1H-NMR數(shù)據(jù)即可確定咖啡?；娜〈恢?從而確定二咖啡酰奎尼酸類化合物的結(jié)構(gòu)。

在奎尼酸中,3、4、5位氫的化學(xué)位移值分別為δ4.09、δ3.39、δ3.99。4-H處于直立鍵位置,它與處于直立鍵位置的5-H之間的二面角為180°,偶合常數(shù)較大(J=7.3 Hz),而它與處于平伏鍵位置的3-H之間的二面角為60°,偶合常數(shù)較小(J=2.6 Hz),因此,4-H在1H-NMR譜中表現(xiàn)為dd峰。5-H處于直立鍵位置,與6-H(a)也有較大的偶合常數(shù),而與6-H(e)偶合常數(shù)較小,因此,5-H表現(xiàn)為寬的多重峰。3-H處于平伏鍵位置,與4-H以及2-H(a,e)之間的二面角均為60°,偶合常數(shù)較小,所以與5-H相比,3-H分裂為較窄的多重峰。當(dāng)奎尼酸上的羥基氫被咖啡酰基取代后,同碳上的氫由于咖啡?；奈娮幼饔?化學(xué)位移會(huì)向低場(chǎng)大幅度移動(dòng),化學(xué)位移δ值大于5,而羥基氫未被取代的碳上氫的δ移動(dòng)幅度較小,化學(xué)位移δ值小于5[14]。

在化合物2中,較窄多重峰3-H和較寬多重峰5-H的化學(xué)位移分別移向低場(chǎng)δ 5.39和5.43處,而dd峰的4-H的化學(xué)位移移至δ 3.96,化學(xué)位移改變較小;另外化合物2的1H-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]的結(jié)果一致,由此判斷化合物2為3,5-二咖啡?；崴?3,5-DiCQA)。在化合物3中,較寬的多重峰5-H的化學(xué)位移移至5.24,3-H及4-H的化學(xué)位移分別移至4.08、3.62,改變較小,所以另1個(gè)咖啡?；娜〈恢弥荒馨l(fā)生在奎尼酸1位羥基上,與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的1H-NMR的數(shù)據(jù)基本一致,確定化合物3為1,5-二咖啡?；崴?1,5-DiCQA)?；衔?較寬的多重峰5-H以及dd四重峰的化學(xué)位移分別移至5.62、5.12,較窄的多重峰3-H的化學(xué)位移為4.38,改變較小,與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致,確定化合物4為4,5-二咖啡?？崴?4,5-DiCQA)。在化合物5中,3,4,5-H的化學(xué)位移改變趨勢(shì)與化合物2一致,咖啡?；娜〈灰葡嗤?與化合物3比較,化合物5另有一甲氧基的H譜信號(hào),且在同一色譜條件下化合物5在反相色譜柱上的保留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于化合物2的,分別為35.56、16.38 min,甲氧基的取代大大降低了化合物的極性,由此確定化合物甲氧基取代發(fā)生在奎尼酸的羧基位置,化合物5的1H-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致,確定化合物5為3,5-二咖啡?？崴峒柞?3,5-DiCQAME)?；衔?～5的結(jié)構(gòu)式見圖1,各自的1H-NMR數(shù)據(jù)見表1。

圖1 菊芋中二咖啡?？崴犷惢衔锏慕Y(jié)構(gòu)

4 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)研究了菊芋葉中的多酚類化學(xué)成分,通過多重色譜結(jié)合的方法從菊芋葉中分離制備了7個(gè)多酚類化合物,并采用UV、MS結(jié)合NMR鑒定了分離所得化合物的結(jié)構(gòu),分別為咖啡酸(化合物1)、3,5-二咖啡?？崴?2)、1,5-二咖啡?？崴?3)、4,5-二咖啡?？崴?4)、3,5-二咖啡?？崴峒柞?5)、5,8-diOH-6,7,4'-triOMe(pedunculin) (6)、5,8-diOH-6,7diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone(7),其中化合物1～5為酚酸類化合物,化合物6～7為黃酮類化合物,化合物2～7均為首次從菊芋葉中分離獲得。另外，對(duì)4個(gè)二咖啡?？崴峄衔?～5的1H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，得出了該類化合物咖啡?；〈恢貌煌瑫r(shí)的特征化學(xué)位移。

多酚類化合物具有抗氧化、強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力、抗輻射等功能,對(duì)癌癥、糖尿病及心血管疾病等慢性病具有良好的預(yù)防作用,因此研究開發(fā)多酚類化合物有著廣闊的市場(chǎng)前景及重要的現(xiàn)實(shí)意義。菊芋葉中多酚類化合物的研究為菊芋成為新的生物資源提供了依據(jù)。

表1 4個(gè)二咖啡?？崴犷惢衔锏?H-NMR數(shù)據(jù)

[1] 孔濤,吳祥云.菊芋中菊糖提取及果糖制備研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(18):375-382.

[2] Yang L X, He Q S, Corscadden K, et al. The prospects ofJerusalemartichokein functional food ingredients and bioenergy production [J]. Biotechnology Reports, 2015(5): 77-88.

[3] 袁曉艷,高明哲,王鍇,等.高效液相色譜-質(zhì)譜法分析菊芋葉中的綠原酸類化合物[J].色譜,2008,26(3):335-338.

[4] Yuan X Y, Cheng M C, Gao M Z, et al. Cytotoxic constituents from the leaves ofJerusalemartichoke(HelianthustuberosusL.) and their structure-activity relationships [J]. Photochemtry Letter, 2013, 6(1): 21-25.

[5] Baba H, Yaoita Y, Kikuchi M. Sesquiterpenoids from the leaves ofHelianthustuberosusL.[J]. Journal of Tohoku Pharmaceutical University, 2005, 52: 21-25.

[6] Otmar S. Sesquiterpene lactones fromHelianthustuberosus[J]. Photochemistry, 1991, 30(2): 519-522.

[7] 劉海偉,劉兆普,劉玲,等.菊芋葉片提取物抑菌活性與化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19(3):405-409.

[8] 楊明俊,王亮,吳婧,等.菊芋葉黃酮類化合物的體外抗氧化活性研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):52-54.

[9] 王海濤,于濤.菊芋花盤酚類物質(zhì)提取和體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(9):101-105.

[10] 袁曉艷,高明哲,肖紅斌,等.菊芋葉中綠原酸提取工藝研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23:225-227.

[11] 夏明文,譚菁,楊琳,等.黃花敗醬化學(xué)成分研究[J].中草藥,2010,41(10):1612-1614.

[12] Grayer R J, Veitch N C, Kite G C, et al. Distribution of 8-oxygenated leaf-surface flavones in the genusOcimum[J]. Phytochemistry, 2001, 56(6): 559-567.

[13] Bennardi D O, Romanelli G P, Jios J L, et al. Synthesis of substituted flavones and chromones using a Wells-Dawson heteropolyacid as catalyst [J]. Bmj British Medical Journal, 2008, 11: 123-130.

[14] 高穎,王新巒,王乃利,等.利用電噴霧質(zhì)譜儀快速鑒定二咖啡酰喹寧酸的取代位置[J].中國藥物化學(xué)雜志,2008,18(1):56-59.

[15] Carnat A, Heitz A, Fraisse D, et al. Major dicaffeoylquinic acids fromArtemisiavulgaris[J]. Fitoterapia, 2000, 71(5): 587-958.

[16] Eunju L, Jusun K, Hyunpyo K, et al. Phenolic constituents from theower buds ofLonicerajaponicaand their 5-lipoxygenase inhibitory activities [J]. Food Chemistry, 2010, 120(1): 134-139.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Extraction, Separation and Structural Identification of PolyphenolicComponents from Leaves ofHelianthustuberosus

YUAN Xiao-yan, FENG Dong-mei, CHEN Xiao-lan

(Department of Analytical Chemistry, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China)

The polyphenolic components were extracted from the leaves ofHelianthustuberosusthrough adopting different polarities of solvents, these components were separated and purified by using the normal-phase and reversed-phase chromatographic techniques, and their chemical structures were identified by UV, MS and NMR spectral data analysis. Seven polyphenolic compounds were separated from the leaves ofH.tuberosus, and they were identified as caffic acid (1), 3,5-dicaffeoylquinic acid (2), 1,5-dicaffeoylquinic acid (3), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4), 3,5-dicaffeoylquinic acidic methyl ether (5), 5,8-diOH-6,7,4′-triOMe (pedunculin) (6), and 5,8-diOH-6,7-diMeO-2-(3,4-diMeOPh)-4-benzopyrone (7). Among them, the compounds 1～5 were attributed to phenolic acids, and the compounds 6～7 were flavonoids. Meanwhile, the replacement places of 2 caffeoyls in 4 dicaffeoylquinic acid compounds could be determined only by1H-NMR data analysis.

Helianthustuberosusleaf; Phenolic acid; Flavonoids; Separation; Structural identification

2016-11-07

遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(F-635);貴州省聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(CK-881)。

袁曉艷(1980─),女,山東臨沂人,副教授,博士,主要從事藥用植物成分研究工作。

R284

A

1001-8581(2017)04-0081-04