MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達(dá)變化及臨床意義

李 菲

MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達(dá)變化及臨床意義

李 菲

目的 比較MicroRNA-101(miR-101)、L型鈣通道β2(L-type calcium channel β2Subunit，CACNB2)及鈉鈣交換體(NCX)在房顫(AF)病人血清中的表達(dá)變化，并分析其臨床意義。 方法 篩選2014年3月—2015年3月來(lái)就診的100例AF病人為研究對(duì)象，設(shè)為試驗(yàn)組(n=100)；同時(shí)選取100例正常病人作為空白對(duì)照組(n=100)。試驗(yàn)時(shí)，分別應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)兩組右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性，闡述 miR-101 在房顫發(fā)生與維持中可能機(jī)制及臨床檢測(cè)意義。 結(jié)果 ①治療前，兩組受試者在年齡、性別、手術(shù)方式等臨床資料比較無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，試驗(yàn)組左房?jī)?nèi)徑(58.9±7.2)mm，大于對(duì)照組(37.9±8.1)mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量(0.620 7±0.132 1)，較正常病人(2.310 0±0.342 2)低；AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道m(xù)RNA表達(dá)量(1.980 0±0.315 1，1.802 7±0.281 1)，較正常病人(0.752 6±0.383 0，0.602 1±0.291 1)表達(dá)量高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫印跡(Western blot)結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平(1.36±0.18，1.46±0.12)均較正常病人(1.10±0.25，1.06±0.21)高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 AF病人右心耳組織中 miR-101的表達(dá)水平與AF的發(fā)生具有相關(guān)性，CACNB2、NCX通道是miR-101的靶向調(diào)控位點(diǎn)，參與AF的發(fā)生。

房顫；MicroRNA-101；L型鈣通道β2；鈉鈣交換體

房顫(AF)是臨床中常見的一種心房電生理紊亂疾病，病人表現(xiàn)為無(wú)序的快速心房顫動(dòng)，失去心肌的正常收縮、舒張功能，容易引發(fā)心功能受損、血栓等嚴(yán)重并發(fā)癥。 微小 RNA(microRNAs)在AF的發(fā)生過程中具有重要作用，其中microRNA-101(miR-101)是AF疾病表征的重要指標(biāo)[1-2]。L 型鈣通道β2亞基(CACNB2)[3]和鈉鈣交換體(NCX)[4]的表達(dá)水平變化可能與miR-101的水平變化有緊密聯(lián)系，成為導(dǎo)致AF的重要原因，但是一直沒有相關(guān)報(bào)道進(jìn)行研究證實(shí)。本次研究針對(duì)AF病人右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測(cè)，初步探討了miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性及miR-101在AF疾病發(fā)生中的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2014年3月—2015年3月就診的AF病人，采集病史并完善術(shù)前檢查，共選出100例AF病人作為試驗(yàn)組，男性50例，女性50例，年齡30歲～55歲(40.28歲±5.17歲)。同時(shí)篩選100例正常病人作為空白對(duì)照，男性47例，女性53例，年齡30歲～55歲(40.30歲±4.87歲)。所有參試者均自愿簽訂同意書，參加本次研究。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 臨床確診為AF病人。排除標(biāo)準(zhǔn)：口服鈣離子拮抗劑；感染性心內(nèi)膜炎和風(fēng)濕性疾??；糖尿病；肝腎功能障礙；各種精神疾患。

1.1.3 失聯(lián)原因及其應(yīng)對(duì)措施 預(yù)計(jì)原因?yàn)橹型就顺鲈囼?yàn)或者在試驗(yàn)過程中轉(zhuǎn)院治療；應(yīng)對(duì)措施為按照1∶1比例相應(yīng)補(bǔ)充受試病人進(jìn)試驗(yàn)組。

1.1.4 倫理學(xué)考量 病人及其直系家屬在充分了解研究過程的基礎(chǔ)上簽署參與該臨床研究的知情同意書；相關(guān)診治和監(jiān)護(hù)措施均以臨床指南相關(guān)原則為依據(jù)，對(duì)病人的醫(yī)療治療和安全有充分保障；對(duì)信息及診療記錄予以保密，保護(hù)隱私權(quán)；試驗(yàn)過程遵循《渥太華工作組關(guān)于臨床試驗(yàn)注冊(cè)的聲明》(Ottawa Group Statement for Clinical Trial Registration)。

1.1.5 雙盲原則 研究人員分為4組：第一組研究人員負(fù)責(zé)篩選和隨機(jī)分配試驗(yàn)對(duì)象；第二組負(fù)責(zé)施行疼痛治療；第三組負(fù)責(zé)進(jìn)行觀察指標(biāo)數(shù)據(jù)采集；第四組負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)分析以及文章撰寫。試驗(yàn)對(duì)象的分組情況嚴(yán)格保密：試驗(yàn)對(duì)象和具體施行鎮(zhèn)痛治療的研究人員均不清楚試驗(yàn)對(duì)象的具體分組。4個(gè)研究組的研究人員對(duì)各自的操作互相保密。

1.2 方法 將100例AF病人設(shè)為試驗(yàn)組(n=100)，100例正常病人作為空白對(duì)照組(n=100)。試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法，檢測(cè)右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.2.1 檢測(cè)方法 灌注心肌停搏液前剪取200 g左右右心耳組織，用冰生理鹽水洗凈后剪成兩部分，分別置于兩個(gè)凍存管中(不含RNA酶)，迅速放入液氮中凍存，凍實(shí)后快速置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 PCR檢測(cè)miR-101表達(dá)水平 將-80 ℃冰箱中保存的右心耳組織取出稱重，冰上剪碎后加入1 mL的Buffer RLM 組織裂解液；片刻后，將裂解液轉(zhuǎn)移到DEPC 處理水處理過的 5 mL 勻漿管中，將組織充分粉碎、混勻，室溫下放置5 min；待組織充分裂解后，加入200 μL 氯仿，振蕩 15 s 后室溫靜置 5 min。再將裂解液置于4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上層無(wú)色水相置于1.5 mL EP管中，加入1/2體積的無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入收集管(Collection Tube 2 mL)內(nèi)的吸附柱R(Mspin Column RM)中，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s，收集流出液，加入2/3體積無(wú)水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱RS中，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，將吸附柱RS重新放入收集管中，加入 700 μL Buffer RWT，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，再次向吸附柱RS中加入500 μL LBuffer RW2，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心30 s后，重復(fù)加入500 μL Buffer RW2，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心1 min后，將吸附柱 RS 置于室溫下晾干。最后，將吸附柱 RS 置于干凈1.5 mL 離心管中，加入 20 μL～30 μL RNase-Free Water，室溫下靜置 1 min，4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心1 min后，收集溶液，測(cè)定總microRNA 濃度和純度。通過microRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行熒光定量 PCR。熒光定量 PCR使用美國(guó)ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀完成，每樣設(shè)定3個(gè)平行，嚴(yán)格按照說明操作。

1.2.3 免疫印跡(Western blot)法 將右心耳組織取出后處理，加入500 μLRIPA 裂解液裂解，再加入蛋白酶抑制劑(1 mM)，待充分混勻、裂解后，靜置15 min，置于4oC離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行BCA試劑盒對(duì)蛋白定量，使用SDS-PAGE 電泳法得到凝膠圖像，進(jìn)行半定量分析。嚴(yán)格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組在年齡、性別、手術(shù)方式等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示AF病人左房?jī)?nèi)徑(58.9±7.2) mm。較對(duì)照組(37.9±8.1) mm顯著增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組miR-101、CACNB2和NCX通道m(xù)RNA的表達(dá)水平 試驗(yàn)組miR-101表達(dá)水平較對(duì)照組低，CACNB2和NCX通道的mRNA水平均較對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別nmiR-101CACNB2的mRNA水平NCX的mRNA水平試驗(yàn)組1000.6207±0.13211.9800±0.31511.8027±0.2811對(duì)照組1002.3100±0.34220.7526±0.38300.6021±0.2911P<0.05<0.05<0.05

2.3 免疫印跡法對(duì)CACNB2和NCX蛋白表達(dá)水平分析 CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組高，與CACNB2和NCX通道的mRNA水平具有相同的變化，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

組別nCACNB2蛋白表達(dá)NCX蛋白表達(dá)試驗(yàn)組1001.36±0.181.46±0.12對(duì)照組1001.10±0.251.06±0.21P<0.05<0.05

3 討 論

AF是一種嚴(yán)重的心律失常疾病，病人失去規(guī)則有序的心房活動(dòng)，導(dǎo)致心房顫動(dòng)。近年來(lái)，伴隨人口老齡化日益加重，我國(guó)AF患病率逐年上升，嚴(yán)重影響了人們的健康生活，特別是高致死率的特點(diǎn)成為AF病人的巨大陰影。由于現(xiàn)在醫(yī)療條件和科技發(fā)達(dá)程度的限制，人們對(duì)于AF的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前針對(duì)AF的治療主要包括抗凝藥物和抗心律失常藥物的開發(fā)和使用，但是對(duì)于持續(xù)性AF的治療具有很大限制。為了臨床AF防治手段的開發(fā)，探索AF的發(fā)病機(jī)制，需找新的靶點(diǎn)成為醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。

研究報(bào)道[5-7]，miR-101表達(dá)量的下調(diào)可能與AF的發(fā)生有關(guān)。隨后研究者又發(fā)現(xiàn)CACNB2[3]、NCX[4，8]可能是miR-101的靶基因，但是未給出深入研究。另外，關(guān)于CACNB2的表達(dá)變化與miR-101表達(dá)之間的關(guān)系也尚未可知。

本研究針對(duì)miR-101和CACNB2、NCX的表達(dá)量與AF之間的相關(guān)性及CACNB2、NCX表達(dá)量與miR-101表達(dá)量的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。以AF病人為主要研究對(duì)象，設(shè)為試驗(yàn)組，與非AF病人進(jìn)行對(duì)照研究。結(jié)果表明，兩組在年齡、性別、手術(shù)方式等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AF病人左房?jī)?nèi)徑較對(duì)照組顯著增大。通過生物信息學(xué)手段，對(duì)兩組病人右心耳組織中的總microRNA表達(dá)量和CACNB2、NCX通道的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量較正常病人低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。證實(shí)了右心耳組織中的microRNA-101表達(dá)量與AF有關(guān)，在AF病人中的表達(dá)量下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道的mRNA表達(dá)量較正常病人表達(dá)量高，說明右心耳組織中的CACNB2、NCX通道與AF的發(fā)生也具有相關(guān)性，參與AF的發(fā)生。通過免疫印跡法對(duì)CACNB2和NCX蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達(dá)水平均較正常病人高，與CACNB2和NCX通道的mRNA表達(dá)量具有相同的變化規(guī)律，符合microRNA-101的生理調(diào)節(jié)規(guī)律，證實(shí)了CACNB2和NCX通道作為microRNA-101的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，參與了AF的發(fā)生。由于NCX是心肌細(xì)胞膜上的一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的作用。NCX表達(dá)量的改變證明了電子通道在AF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[8，11]，也說明了心肌細(xì)胞內(nèi)過量的鈣離子對(duì)引發(fā)AF發(fā)生的重要作用[12]。

microRNA-101表達(dá)量與AF的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)聯(lián)，即AF病人血清中的microRNA-101表達(dá)下調(diào)。此外，CACNB2和NCX蛋白與microRNA-101的表達(dá)相關(guān)，即microRNA-101上調(diào)CACNB2和NCX的表達(dá)，繼而誘發(fā)或加重AF。

[1] Li GQ，Lei XY.MicroRNAs and atrial fibrillation[J].International Journal of Pathology and Clinical Medicine，2011，31(6)：507-512.

[2] Wang Z，Lu Y，Yang B.MicroRNAs and atrial fibrillation：new fundamentals[J].Cardiovasc Res，2011，89(4)：710-721.

[3] 蒙滋滋，鐘國(guó)強(qiáng)，涂榮會(huì)，等.L 型鈣通道β2亞基在心房顫動(dòng)中的表達(dá)變化[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2014，9(7)：22-23.

[4] 劉元生，郭林娜，郭繼鴻，等.鈣離子通道基因 mRNA 表達(dá)在心房顫動(dòng)發(fā)生機(jī)制中的作用[J].臨床心血管病雜志，2009，3：170-174.

[5] Luo XB，Zhang JC，Chen GR，et al.Crintical Role of miRNA-101 in atrial electrical remodeling in experimental atrial fibrillation[J].Circulation，2009，120：S617.

[6] Luo XB，Zhang HJ，Xiao JN，et al.Regulation of human cardiac ion channel genes by MicroRNAs：theoretical perspective and pathophysiological implications[J].Cell Physiol Biochem，2010，25：571-586.

[7] Luo XB，Pan ZW，Xiao JN，et al.Crintical role of microRNAs miR-26 and miRNA-101 in atrial electrical remodeling in experimental atrial fibrillation[J].Circulation，2010，122：A19435.

[8] 連雯雯，郝麗英.鈣通道在心房顫動(dòng)時(shí)表達(dá)及功能變化的研究進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床，2013，16(2)：151-154.

[9] Lu Y，Zhang Y，Wang N，et al.Micro RNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation[J].Circulation，2010，122(23)：2378-2387.

[10] Wakili R，Voigt N，K??b S，et al.Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation[J].Clin Invest，2011，121(8)：2955-2968.

[11] 李耀東，湯寶鵬.鈣離子通道與老齡心房顫動(dòng)心房電重構(gòu)的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32(5)：718-720.

[12] Niels Voigt，Na Li，Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+leak and increased Na+-Ca2+exchanger function underlie delayed after depolarizations in patients with chronic atrial fibrillation[J].Circulation，2012，125：2059-2070.

(本文編輯王雅潔)

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分院(上海 200092)，E-mail：gghvx2342@163.com

引用信息：李菲.MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達(dá)變化及臨床意義[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(6)：712-714.

R541.7 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.027

1672-1349(2017)06-0712-03

2016-09-03)