葛根素對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)及PI3KAkt信號(hào)通路的作用機(jī)制研究

范少平，丁文學(xué)，梁碧先

葛根素對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)及PI3KAkt信號(hào)通路的作用機(jī)制研究

范少平，丁文學(xué)，梁碧先

目的 觀察葛根素對(duì)缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，分析神經(jīng)保護(hù)作用是否涉及PI3K/Akt 信號(hào)通路的參與以及可能的機(jī)制。方法 90只新生7 日齡Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)、HIE 組(n=40)及葛根素療組(n=40)，后兩組又進(jìn)一步分為3 h、6 h、12 h、24 h 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10 只。參照Rice 等和吳婉芳法，建立新生大鼠HIE 模型。HE 染色觀察各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化Akt 的表達(dá)。依據(jù)免疫組化的結(jié)果采用Western blot 方法進(jìn)一步檢測(cè)PI3K/Akt 信號(hào)通路表達(dá)。結(jié)果 90只Wistar大鼠模型全部成功，全部納入結(jié)果分析。HE 染色示葛根素治療組大鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死率較HIE 組明顯減少。免疫組化結(jié)果示：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素治療組磷酸化Akt 蛋白陽(yáng)性率較HIE 組顯著上調(diào)(P<0.01)。HIE 組磷酸化Akt 在12 h 時(shí)達(dá)到高峰，但葛根素治療組在24 h 時(shí)達(dá)到高峰；在每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)葛根素組磷酸化Akt 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均高于HIE 組(P<0.01)。假手術(shù)組亦有極少量表達(dá)。Western blot 結(jié)果示：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，各組總Akt 的表達(dá)一致；但磷酸化Akt 的表達(dá)(Ser473 和Thr308)在葛根素治療組明顯強(qiáng)于HIE 組；且隨著時(shí)間變化，其表達(dá)于上述免疫組化的檢測(cè)大致一致。葛根素顯著提高磷酸化Akt 的水平，既可作用于Ser473 磷酸化位點(diǎn)，也可作用于Thr308 磷酸化位點(diǎn)。結(jié)論 葛根素對(duì)HIE大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。葛根素可激活PI3K/Akt通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表達(dá)水平，增加Akt磷酸化水平的表達(dá)有關(guān)。

缺氧缺血性腦??；葛根素；神經(jīng)保護(hù)；新生大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒常見(jiàn)疾病，有著較高的致死率和致殘率，HIE對(duì)新生兒生命有著嚴(yán)重的威脅，該病癥還會(huì)引起新生兒腦癱，癲癇，智力低下，精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩?fù)Ｖ沟葒?yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的疾病。這幾年來(lái)，新生兒缺血性腦病的發(fā)病率越來(lái)越高，已經(jīng)超過(guò)了產(chǎn)傷性顱內(nèi)出血，所以新生兒腦損傷最常見(jiàn)的原因就是缺血性腦病。傳統(tǒng)中藥葛根在我國(guó)使用已有幾千年歷史，葛根素是從葛根中分離得到的4，7-二羥基一級(jí)8-β-D 葡萄糖異黃酮，它們都是多羥基的黃酮類(lèi)化合物，分子量比較小，主要在治療心血管疾病方面有較好的效果，其本身活性強(qiáng)、藥理作用強(qiáng)、藥代動(dòng)力學(xué)良好、沒(méi)有毒副作用。葛根素能夠?qū)θ毖阅X損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，但是其相關(guān)的保護(hù)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究分析，接下來(lái)主要是研究葛根素怎樣在不同腦缺血中影響腦神經(jīng)細(xì)胞的缺血缺氧，還對(duì)腦缺血再灌注損傷之后敏感蛋白如何表達(dá)有一定的影響。本研究主要是把出生一周的新生大鼠制作成HIE模型，在腹腔注射葛根素，密切觀察葛根素是否能夠治療新生大鼠的HIE，葛根素的影響位點(diǎn)及作用途徑是否涉及PI3K/Akt 信號(hào)通路，這也是本次實(shí)驗(yàn)試圖證實(shí)之處。以期為葛根素在臨床上治療新生兒HIE 提供可行性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物：SPF級(jí)7日齡(以出生日計(jì)算為0天)，Wistar大鼠購(gòu)自我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，雌雄不限，營(yíng)養(yǎng)中等，體重19 g～21 g，共90只。在模型制備后及觀察階段放回飼養(yǎng)籠，在自然狀態(tài)下由母鼠哺乳喂養(yǎng)，保持適宜的光照，室溫和空氣濕度等。

主要試劑：葛根素購(gòu)自山東省煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司。磷酸化Akt 一抗，免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德公司(用于免疫組化)。磷酸化Akt 信號(hào)通路試劑盒購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers 公司(用于western blot 檢測(cè)總Akt、磷酸化AktSer473、磷酸化AktThr308)。鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自sigama公司。硝酸纖維素膜購(gòu)自Sigama公司。Tris Base、溴酚藍(lán)、NP40、Tris-Hcl、脫氧膽酸鈉、SDS、甘氨酸、過(guò)磷酸胺、DTT、四甲基乙二胺、TWEEN20購(gòu)自Sigama公司。甲醇為國(guó)產(chǎn)分析純。脫脂奶粉市售。氧氣由我院提供，氮?dú)赓?gòu)自武漢造船廠，自行配制8%氧氣和92%氮?dú)饣旌蠚怏w。其他：乙醚、5%水合氯醛、4%多聚甲醛、眼科剪、組織剪、紗布、絲線、顯微鏡等均由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供。

儀器和設(shè)備：便攜式數(shù)字測(cè)氧儀：上海第三分析儀器廠。自制常壓缺氧艙：直徑為40 cm，高60 cm 的圓柱形透明塑料容器，上下各有1個(gè)直徑1 cm的小孔與外界相通。UV-754 紫外分光光度計(jì)：讓奇(上海)儀器科技有限公司。HQ45 恒溫?fù)u床：金壇市順華儀器有限公司。垂直電泳槽：上海佑偉實(shí)業(yè)有限公司。電轉(zhuǎn)儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。Bio-Rad GELDOC-2000 紫外凝膠成像系統(tǒng)。法國(guó)Bio-profil圖像分析系統(tǒng)。YJ-875S 超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司。7530-G 型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)：費(fèi)爾伯恩精密儀器(上海)有限公司。低溫離心機(jī)(TGL-18R)：上海茸研儀器有限公司。SZ-97 自動(dòng)三重純水蒸餾器：上海科曉科學(xué)儀器有限公司。BS60 三用恒溫水箱：上海善志儀器設(shè)備有限公司。AE200 電子天平：上海平軒科學(xué)儀器有限公司。HJ-3 磁力攪拌器：金壇市新航儀器廠。300 度恒溫烘箱：北京醫(yī)療設(shè)備廠。Gilson 1 000 μL，200 μL，10 μL自動(dòng)移液器：法國(guó)Gilson 公司。低溫高速離心機(jī)：上海茸研儀器有限公司。超低溫冰箱：東莞市匯泰機(jī)械有限公司。電子天平：AE200 型，拓赫機(jī)電科技(上海)有限公司。手提式壓力滅菌消毒器：廣州藍(lán)靈水處理設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物分組、給藥方式、模型建立和標(biāo)本采集：健康7日齡Wistar大鼠90只，雌雄不拘，體重(21.0±3.1)g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)、HIE組(n=40)和葛根素治療組(n=40)。以上3組又隨即分為A、B兩個(gè)亞組，并設(shè)假手術(shù)組為正常對(duì)照組。葛根素治療組大鼠于模型制備前一天開(kāi)始腹腔注射葛根素20 mg/kg，每日兩次，直至標(biāo)本采集完畢。假手術(shù)組和HIE組大鼠同步注射相同劑量生理鹽水。假手術(shù)組只把頸部切開(kāi)同時(shí)在左側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行分離術(shù)，不需要結(jié)扎，將切口縫合之后吸入正?？諝?。將HIE組和葛根素治療組建立的HIE經(jīng)典模型。HIE組和葛根素組術(shù)后3 h、6 h、12 h，24 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取8只，假手術(shù)組于24 h取標(biāo)本。以上三組然后隨機(jī)各自再分為A B兩個(gè)亞組。A亞組5%水合氯醛麻醉后，經(jīng)心臟4%多聚甲醛灌注固定，斷頭，頭皮沿前自剪開(kāi)顱骨，取出大腦，分離左右大腦半球。固定，脫水，透明，包埋后，于前囟前0.3 mm至前囟后0.6 mm之間連續(xù)切片，片厚5 μm，粘于處理的切片上，室溫保存?zhèn)洹Ｆ渲袃蓮埑Ｒ?guī)HE染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，余留免疫組化檢測(cè)磷酸化Akt水平。B亞組直接斷頭取腦，快速剝離腦表面大血管，取左側(cè)大腦，液氮凍存，以備western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)總Akt、磷酸化Akt(Ser473和Thr308)表達(dá)水平。

免疫組織化學(xué)染色步驟：利用二甲苯和酒精進(jìn)行標(biāo)本脫蠟處理，使用過(guò)氧化酶(3%)進(jìn)行孵育5 min，目的是消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。接下來(lái)需要把玻片放到枸櫞酸緩沖液的容器中，放到微波爐中維持在92℃～98℃加熱10 min，將抗原修復(fù)，取出之后在室溫環(huán)境中冷卻10 min。滴加磷酸化一抗Akt (1∶200稀釋)同時(shí)被生物素標(biāo)記的第二抗體，放置在37 ℃環(huán)境中孵育半小時(shí)。隨后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素三抗(普通型SP試劑盒，1∶ 100稀釋)，放置環(huán)境如上。最后需要滴加新鮮的DAB溶液，觀察有沒(méi)有顯色反應(yīng)，如果細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀則為陽(yáng)性反應(yīng)，利用顯微鏡控制反應(yīng)時(shí)間，上述處理完成之后還需要用蒸餾水進(jìn)行洗滌，等到干燥之后用中性樹(shù)膠封好固定。以上各步驟之間均以0.01 mol/ LPBS ( pH7.4 )漂洗5 min×3次。假手術(shù)對(duì)照組以0.01 mol/LPBS代替磷酸化Akt抗血清。

Western blot：提取保存新鮮組織中的100 mg蛋白組織放到勻漿機(jī)，然后取50 mL Tris-HCI，150 mLNaCl，1 μg/μL的1%脫氧膽酸鈉，1 μg/μL的1%NP-40，1 μg/μL的1%SDS，1 μg/μLlAprotinin、Leuptin、Pepstalin 配制成裂解液后攪拌均勻。放置到轉(zhuǎn)速13 000 r/min裝置中離心10 min。然后，把上清液放到Ep管中，蛋白定量，并描繪出標(biāo)準(zhǔn)的蛋白曲線。然后進(jìn)行圖像分析；隨后通過(guò)吸光度值對(duì)磷酸化的Akt進(jìn)行蛋白量的調(diào)整，目的是讓每對(duì)組織中的蛋白量都相同，還要利用相似的方法對(duì)磷酸化Akt(Ser473、Thr308)行western blot 檢測(cè)(方法同上)，目的是找到調(diào)整后每對(duì)組織磷酸化Akt表達(dá)的差異。最后要把樣本中的Akt的積分光密度值和β-actin 的積分光密度值進(jìn)行比較，同時(shí)把磷酸化Akt 積分光密度值和調(diào)平后Akt 的積分光密度值比較，得出蛋白質(zhì)的含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組HIE大鼠腦組織的病理表現(xiàn) HE染色顯示假手術(shù)組皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻，無(wú)明顯神經(jīng)元損傷表現(xiàn)。在3 h、6 h、12 h、24 h這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，隨著時(shí)間推移，HIE組皮層和海馬區(qū)可見(jiàn)大量神經(jīng)元的壞死，排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色加深，形狀不規(guī)則，甚至胞膜破裂，細(xì)胞解體消失；而葛根素治療組可看到部分的神經(jīng)細(xì)胞的壞死，形狀不規(guī)則，核固縮，染色加深，腦組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清楚，皮層和海馬區(qū)未見(jiàn)明顯細(xì)胞丟失(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組HIE大鼠腦組織的病理表現(xiàn)

2.2 葛根素對(duì)HIE大鼠皮層和海馬組織中磷酸化Akt表達(dá)的影響 磷酸化Akt陽(yáng)性細(xì)胞主要為胞漿著色，呈棕黃色。免疫組化的結(jié)果顯示各組磷酸化Akt的表達(dá)詳見(jiàn)表1、圖2。假手術(shù)組亦有極少量表達(dá)；HIE組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，在12 h達(dá)到高峰；葛根素治療組的陽(yáng)性細(xì)胞時(shí)間延長(zhǎng)而增多，但在24 h時(shí)達(dá)到高峰。葛根素對(duì)HIE大鼠皮層和海馬組織中磷酸化Akt表達(dá)的影響。

表1 葛根素對(duì)皮層和海馬組織中磷酸化Akt 表達(dá)的影響

圖2 葛根素對(duì)皮層和海馬組織中磷酸化Akt 表達(dá)的影響

2.3 Western blot檢測(cè)總Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表達(dá)的變化 造模后3 h，6 h，12 h，24 h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)HIE組與葛根素治療組相比較總Akt的表達(dá)一致；磷酸化Akt(Thr308 和Ser473)的表達(dá)在葛根素治療組明顯高于HIE組。且葛根素治療組磷酸化Akt的表達(dá)隨著損傷后時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在24 h到達(dá)高峰；HIE組Akt的表達(dá)在12 h達(dá)到高峰。詳見(jiàn)表2、圖3。

組別 Ser473 3h6h12h24h Thr308 3h6h12h24hHIE組45.89±4.2173.59±7.05119.57±10.2843.26±4.0828.26±2.5462.54±5.68107.63±9.2527.59±2.39葛根素組49.67±4.6489.68±8.45168.24±15.21204.65±18.2240.28±3.5678.64±7.23147.89±12.35182.64±15.32

圖3 western blot 檢測(cè)總Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表達(dá)的變化

3 討 論

對(duì)于新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究，由于受到多種因素的制約，目前大多采用HIE 動(dòng)物模型進(jìn)行研究。對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō)，腦發(fā)育的高峰期是在出生時(shí)候，而新生一周的大鼠和新生兒出生時(shí)的腦發(fā)育處于相同的階段。該實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象是新生一周的大鼠，并成功建立新生兒HIE模型。腦缺氧缺血所致的病理?yè)p害由復(fù)雜的綜合因素引起。研究證明，HIE的腦損傷神經(jīng)元壞死包括缺氧缺血后的即刻腦死亡(腦細(xì)胞壞死)和延遲性腦損傷(以細(xì)胞凋亡為主)兩個(gè)階段[1-3]。腦細(xì)胞壞死階段，因?yàn)槟芰康膿p耗嚴(yán)重，離子平衡失調(diào)，細(xì)胞中的鈉離子和鈣離子不斷聚集，同時(shí)興奮性氨基酸、氧自由基和NO不斷地增加，最終造成細(xì)胞溶解死亡，此過(guò)程稱(chēng)為神經(jīng)元壞死。神經(jīng)元壞死的第二階段也稱(chēng)為遲發(fā)型神經(jīng)元壞死，一般發(fā)生在幾小時(shí)之后，主要是由局部環(huán)境的刺激引起的，容易受到基因的調(diào)控發(fā)生非炎癥性死亡。腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和HIE新生動(dòng)物遲發(fā)型神經(jīng)損傷具有非常緊密的聯(lián)系。

腦缺血和細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括下面幾種酶物質(zhì)：有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3-K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，Akt)信號(hào)通路。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們研究的不斷進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，MAPK信號(hào)通路具備雙重功能，然而，PI3K/AKT信號(hào)通路依舊是重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路，大多數(shù)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子會(huì)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，然后對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PI3K屬于磷脂?；技っ?，激活之后能夠使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，生成一系列的相關(guān)物質(zhì)，如磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PI-3，4-P2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI-3，4，5-P3 )。后兩種物質(zhì)可以和Akt的PH區(qū)結(jié)合，使得一部分Akt被激活，同時(shí)使Akt轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面。5-磷酸酶能夠把磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸轉(zhuǎn)化為PI-3和4-P2，進(jìn)而能夠使位于細(xì)胞膜內(nèi)的磷脂酰激酶依賴(lài)激酶1(phosphatidylinositol dependent kinase，PDK1)和磷脂酰激酶依賴(lài)激酶2(PDK2)激活，同時(shí)這兩種酶又可以把Akt激活。Akt屬于重要的抵抗凋亡的調(diào)節(jié)因子，能夠介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[3]。PI3K被激活后，可以合成磷脂物質(zhì)，進(jìn)而使得Akt和下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被全部激活，對(duì)細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)發(fā)育以及分化增殖產(chǎn)生一定的影響[4]。因此Akt磷酸化可以作為衡量PI3K活性的指標(biāo)許多研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路與腦缺血損傷有關(guān)。有學(xué)者研究大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞90 min后磷酸化Akt和磷酸化ERK在神經(jīng)元中的表達(dá)，通過(guò)采取免疫熒光方法后得到結(jié)果，對(duì)照組中磷酸化Akt陽(yáng)性細(xì)胞弱表達(dá)，而模型組在缺血再灌注1 h～3 h表達(dá)上高，1 h達(dá)到高峰，而且缺血周?chē)鷧^(qū)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于中央?yún)^(qū)[5]。磷酸化的ERK單陽(yáng)性細(xì)胞核Akt/ERK雙陽(yáng)性細(xì)胞在一小時(shí)后也達(dá)到高峰。由此可知，缺血再灌注早期Akt和ERK信號(hào)通路都在腦缺血誘發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用，同時(shí)這兩種物質(zhì)是共同發(fā)揮作用的。還有學(xué)者通過(guò)進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)缺血條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和磷酸化Akt和ERK之間的關(guān)系進(jìn)行研究[6]，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在缺血后6 h開(kāi)始出現(xiàn)，12 h呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，但是磷酸化Akt和ERK都是在缺血后6 h～12 h表達(dá)增加，由此可說(shuō)明磷酸化Akt和ERK都和缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有一定的聯(lián)系。但是還有部分研究認(rèn)為Akt參與了缺血的預(yù)適應(yīng)，能夠?qū)δX缺血神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，而且其激活程度和腦缺血的損傷程度有密切的聯(lián)系。缺血預(yù)適應(yīng)主要功能是確保嚴(yán)重缺血情況下神經(jīng)細(xì)胞的死亡，可以保護(hù)嚴(yán)重缺血條件下的神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。

葛根素主要是從中藥豆科植物中提取出來(lái)的，干燥根是其主要的成分，其化學(xué)名稱(chēng)是4，7-二羥基和8-β-D葡萄糖異黃酮。目前研究表明，葛根素可擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量和降低腦組織氧耗量，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有抗氧化、清除自由基以及抑制缺血再灌注損傷的作用[8-9]；葛根素對(duì)細(xì)胞凋亡具有干預(yù)作用，這說(shuō)明細(xì)胞凋亡屬于葛根素發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制?，F(xiàn)在已經(jīng)有大量研究表明，葛根素的作用主要和Bcl家族因子有關(guān)，比如P53，fas，fos等，除此之外還和caspase-3信號(hào)傳遞途徑有關(guān)。細(xì)胞凋亡的過(guò)程是非常復(fù)雜的，葛根素的影響位點(diǎn)以及作用途徑都和其他的基因和調(diào)控因子有關(guān)聯(lián)。這些問(wèn)題對(duì)于相關(guān)疾病的預(yù)防以及治療具有非常重要的意義[10]。本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果顯示，在病理切片的HE染色皮層和海馬區(qū)內(nèi)可明顯看到葛根素治療組神經(jīng)壞死程度較HIE組輕，腦組織的空隙中空泡逐漸減少，并出現(xiàn)核邊集，固縮及染色體片段的神經(jīng)元比HIE組少。通過(guò)免疫組化檢測(cè)方法可以發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)渭僅IE組磷酸化Akt表達(dá)在損傷3 h后會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，在24 h后達(dá)到低谷。但是隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素治療組磷酸化Akt的表達(dá)會(huì)呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到高峰，同時(shí)還會(huì)發(fā)現(xiàn)12 h和24 h會(huì)出現(xiàn)明顯上升。這表明葛根素能保護(hù)HIE損傷過(guò)程中大鼠海馬神經(jīng)元，磷酸化Akt的表達(dá)上調(diào)可能是其重要的機(jī)制之一。為進(jìn)一步證實(shí)葛根素的作用涉及PI3K/Akt途徑，用western blot方法檢測(cè)PI3K通路下游關(guān)鍵性激酶Akt(總Akt、磷酸化Akt Ser473，磷酸化Akt Thr308)的表達(dá)情況 ?？偟腁kt表達(dá)在葛根素治療組及HIE組之間無(wú)明顯差別，但磷酸化Akt的表達(dá)在葛根素治療組明顯強(qiáng)于HIE組。葛根素顯著提高磷酸化Akt的水平，既可作用于Ser473磷酸化位點(diǎn)，也可作用于Thr308磷酸化位點(diǎn)。故葛根素可激活PI3K/Akt通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)HIE 模型新生大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過(guò)激活PI3K/Akt 通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)HIE 新生大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與上調(diào)磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表達(dá)水平，增加Akt 磷酸化水平的表達(dá)有關(guān)。加之已有的研究結(jié)果，葛根素可明顯減輕HIE 神經(jīng)元死亡，是一種較好的有廣闊應(yīng)用前景的神經(jīng)保護(hù)劑。

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(本文編輯王雅潔)

Study on the Mechanism of Puerarin on Neurons and PI3K/Akt Signaling Pathway in Neonatal Rats with Hypoxic-ischemic Encephalopathy

Fan Shaoping，Ding Wenxue，Liang Bixian

People’s Hospital of Longhua District，Southern Medical University，Shenzhen 518109，Guangdong，China

Objective To observe the neuroprotective effect of puerarin in hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) rats model， and to investigate whether the PI3K/Akt signal pathway was involved in the neuroprotective effect of puerarin on neonate rat in HIE model and its possible mechanisms.Methods Ninety 7-day neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group (n=10)， HIE group (n=40) and puerarin treatment group (n=40).The last two group were further divided into 3 h，6 h，12 h and 24 h four time points， each of them had 10 rats.Rats model of HIE were established according to Rice's and Wu Wanfang's method， then HE stain was used to observe the morphological change， immunohistochemical method and western blot were used to detect the changes of PI3K/Akt pathway， including the expression level of total Akt， phosphorylated Akt(Ser473 and Thr308)in brains of rats.Results The HIE rats model had been established successfully and 90 Wistar rats were take into the results analysis.Compared with HIE group， HE result showed that the necrotic neurons in cortical layer and hippocampus were significantly reduced in puerarin treatment group.The immunohistochemical result proved that the expression of phosphorylated Akt in puerarin treatment group was apparently increased with time going by(P<0.01).Phosphorylated Akt reached its peak after 12 h in HIE group while after 24 h in puerarin treatment group， and the expression of phosphorylated Akt in puerarin treated group was higher than that in HIE group in every time point (P<0.01).There was extremely small amount expression in sham operation group.Western blot showed that the expression level of total Akt was at equal pace between three groups in every time point.Compared with HIE group，the phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) level was increased significantly in puerarin treatment group， what's more， with time going by， the change of expression roughly conformed to the immunohistochemical result above.Puerarin could increase the levels of phosphorylated Akt by playing role on Ser473 phosphorylation site as well as Thr308 phosphorylation site.Conclusion Puerarin has neuroprotective effect on HIE rats model by activating the PI3K/Akt signal pathway.Its mechanism may be related to the up-regulation of phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) expression， and increased the expression of Akt phosphorylation

hypoxic-ischemic encephalopathy;puerarin;neuroprotecton；neonatal rat

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81370449)，項(xiàng)目名稱(chēng)：腦缺血后lncRNA調(diào)控神經(jīng)元生存的機(jī)制研究

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院(深圳 518109)，E-mail：szfanshaoping@163.com

引用信息：范少平，丁文學(xué)，梁碧先.葛根素對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)及PI3KAkt信號(hào)通路的作用機(jī)制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(6)：680-685.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.012

1672-1349(2017)06-0680-06

2016-08-15)