禁食、急性冷暴露和外源性注射Ghrelin對羔羊生理指標(biāo)的影響

王 琴，趙紅瓊*，許 琴，侯 宇，卡力比夏提·艾木拉江，閆書平，姚 剛，劉江偉，張 丹，王麗芳

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科，新疆烏魯木齊 830000)

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禁食、急性冷暴露和外源性注射Ghrelin對羔羊生理指標(biāo)的影響

王 琴1△，趙紅瓊1△*，許 琴2，侯 宇1，卡力比夏提·艾木拉江1，閆書平1，姚 剛1，劉江偉2，張 丹1，王麗芳1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科，新疆烏魯木齊 830000)

為了探究禁食、急性冷暴露和注射外源性生長激素釋放肽Ghrelin對羔羊生理指標(biāo)的影響，本研究監(jiān)測了室溫禁食24 h后繼續(xù)禁食并冷凍(-24.7 ℃ ± 0.2 ℃)2 h羔羊基本生命體征、血液生理指標(biāo)和血糖濃度的變化，同時探究了外源性Ghrelin對于冷凍的禁食羔羊以上指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，在禁食后8、16、24 h羔羊呼吸頻率、心率和血糖濃度均較禁食前顯著降低(P<0.05)，在禁食后16 h和24 h直腸溫度均較禁食前極顯著降低(P<0.01)，而血液生理指標(biāo)變化不明顯(P>0.05)；在冷凍1.5 h和2.0 h后羔羊呼吸頻率較保溫組顯著減慢(P<0.05)，心率和血糖濃度在冷凍后1.0、1.5、2.0 h顯著增加(P<0.05)，冷凍過程中羔羊直腸溫度差異不顯著(P>0.05)；冷凍2 h后頸靜脈一次性注射Ghrelin未發(fā)現(xiàn)對羔羊以上指標(biāo)的影響(P>0.05)。以上研究結(jié)果提示，羔羊在禁食和低溫情況下可通過調(diào)整自身活動，以維持機體穩(wěn)態(tài)，并且Ghrelin可能并未參與該調(diào)整過程。

禁食；冷暴露；生長激素釋放肽；羔羊；血糖

養(yǎng)羊業(yè)在我國西北畜牧業(yè)中占有重要地位，一般分為農(nóng)區(qū)集中舍飼模式和牧區(qū)散養(yǎng)放牧模式。對于放牧的羊遇到暴風(fēng)雪天氣，由于氣溫低，大雪覆蓋牧草，而儲備干草不足的時候，這些羊會出現(xiàn)饑餓和凍傷情況，尤其是斷奶羔羊由于抵抗力下降容易出現(xiàn)死亡情況。劉璐等[1-2]研究表明，經(jīng)過24 h禁食羔羊再持續(xù)禁食并在-6.1 ℃～-14.7 ℃圈舍外冷暴露4 h～24 h可引起心率和呼吸加快，體溫降低，甚至少部分羔羊死亡。但由于劉璐等冷暴露試驗是在圈舍外進行，存在氣溫、濕度和風(fēng)速等環(huán)境因素不穩(wěn)定的問題。另外，生長激素釋放肽(Ghrelin)除了具有公認的促進生長激素釋放的作用，而且有研究表明Ghrelin可能參與饑餓和冷暴露時大鼠和魚類機體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[3-5]。因而本研究計劃在氣溫條件穩(wěn)定的人工冷凍艙探究急性冷暴露對禁食羔羊基本生命體征、血液生理指標(biāo)和血糖的影響，同時也探究在冷暴露情況下外源性給予Ghrellin是否對以上指標(biāo)具有干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 選取8只60日齡斷奶后約1周的新疆細毛羊，公羔，試驗初始體重 18.2 kg ± 0.8 kg，來源于新疆科創(chuàng)畜牧繁育中心。試驗前1周羔羊集中在普通圈舍(20 ℃～30 ℃)進行適應(yīng)性飼喂，每天飼喂2 次(11:00 和21:00)精料，每餐150 g/只，飼料購自新疆泰昆集團昌吉飼料有限責(zé)任公司，苜蓿干草和水自由采食。

1.1.2 試劑 羊?；疓hrelin(GSSFLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR，Uniprot序號：Q6BEG7)用多肽固相合成法合成，其生物學(xué)活性通過牛頸靜脈注射1 μg/kg該Ghrelin促進生長激素分泌得到驗證；肝素鈉注射液，江蘇萬邦生化股份有限公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸二鈉，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；血糖測定試劑盒，北京利德曼生化股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器和設(shè)備 冷凍艙為西北地區(qū)特殊環(huán)境人工實驗艙，由新疆軍區(qū)總醫(yī)院提供；全自動動物血液細胞分析儀，南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；溫濕度儀，天津市津南區(qū)工藝美術(shù)陶瓷廠產(chǎn)品；SynergyHTX多功能酶標(biāo)儀，美國Bio Tek儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 試驗開始日，8只羔羊進行正常飼喂(如上適應(yīng)性飼喂)，在第2天3:00開始禁食，但水自由飲用，在第3天11:00將4只羔羊放入保溫圈(25.8 ℃±0.2 ℃)，為保溫組，另外4只羔羊放入冷凍艙(氣溫-24.7℃±0.2℃)，為冷凍組。以上兩組羔羊在13:00(即保溫或冷凍2 h)每組選取2只(Ghrelin組)通過靜脈留置針(用10 IU/mL肝素生理鹽水抗凝維持)注射10 μg/kg Ghrelin，而另外2只(對照組)注射1 g/L牛血清白蛋白(BSA)，每只羔羊注射量為5 mL，因而羔羊共分為4組，即保溫對照組、保溫Ghrelin組、冷凍對照組和冷凍Ghrelin組。每只羔羊均按照不完全拉丁方試驗設(shè)計，接受每種處理，試驗共進行4次，每次試驗之間動物休息2 d。

1.2.2 檢測指標(biāo)

1.2.2.1 圈舍或艙內(nèi)氣溫和濕度的監(jiān)測 在飼喂和禁食日(11:00、19:00、3:00)、冷凍時段(11:00、11:30、12:00、12:30、13:00)和注射時段(13:30和14:00)時間點之前測定氣溫和濕度，以監(jiān)測動物所處圈舍內(nèi)環(huán)境變化。圈舍內(nèi)氣溫的監(jiān)測用酒精溫度計，濕度用溫濕度儀記錄，由于本試驗羔羊頭仰起身高約0.5 m，所以均將儀器高度放在離地面約0.5 m處。

1.2.2.2 羔羊基本生命體征的監(jiān)測 在以上監(jiān)測圈舍氣溫時間點慢慢靠近羔羊測定呼吸、心率和直腸溫度。監(jiān)測方法參考劉璐等報道[1]。

1.2.2.3 血液生理指標(biāo)和血糖濃度的測定 在飼喂和禁食日(11:00、19:00、3:00)、冷凍時段(11:00、11:30、12:30、13:00)和注射時段(13:05、13:15、13:30和14:00)每只羊從靜脈留置針采集5 mL血液，迅速注入含肝素鈉 (8 IU/mL血液)的冰浴離心管，混勻，離心(4 ℃，3 000 r/min,20 min)，分離血漿，置-20 ℃冷凍貯藏，用于血糖的測定。同時，禁食日(11:00)、冷凍前(11:00)、注射時段前(13:00)、注射后(14:00)一部分采集血液注入含乙二胺四乙酸二鈉 (50 mg/mL血液)的 1.5 mL離心管，用于血液生理指標(biāo)(WBC、RBC、HGB和HCT)的檢測；血液生理指標(biāo)用全自動動物血液細胞分析儀測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)表示，用 SPSS 16. 0 軟件進行雙因素方差分析P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 禁食對羔羊基本生命體征、血糖和血液生理指標(biāo)的影響

圖1顯示了在4輪羔羊飼喂和禁食試驗過程中每天3個時間點(11:00、19:00和3:00)氣溫和濕度的變化，全天平均氣溫27.0 ℃ ± 1.0 ℃、平均濕度38.6 % ± 0.8%，在3個監(jiān)測時間點中19:00氣溫較其他兩個時間點高，而濕度相對最低。

由圖2A和2B可見，在凌晨3:00開始禁食時羔羊呼吸頻率和心率均較試驗開始時(給料)11:00(呼吸頻率為114次/min ± 4次/min，心率為118次/min ± 4次/min)顯著減慢，并且在禁食后8、16、24 h均減慢(P<0.05或0.01)。由圖2C可見，在禁食后16 h和24 h直腸溫度均較給料時11:00 (40.0 ℃ ± 0.1 ℃)極顯著降低(P<0.01)。由圖2D可見，在禁食后8、16、24 h血糖濃度均較給料時11:00 (4.1 mg/dL ± 0.1 mg/dL)極顯著降低(P<0.01)。全血白細胞總數(shù)、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白含量和紅細胞壓積在各采血點之間差異不顯著(P>0.05)，試驗前均值分別為7.8×109/L±0.4×109/L、10.2×1012/L±0.2×1012/L、106g/L±4 g/L和24%±1%。

圖1 羔羊禁食過程中氣溫和濕度的變化

2.2 冷暴露對禁食羔羊基本生命體征和血糖的影響

羔羊禁食32 h后進入保溫圈(氣溫25.8 ℃±0.2 ℃，濕度40.9%±0.2% )和冷凍艙(氣溫-24.7 ℃±0.2 ℃，濕度28.5%±0.9%)后呼吸頻率、心率和血糖變化見圖3。由圖3A可見，在進入冷凍艙1.5 h和2.0 h時冷凍組羔羊呼吸頻率較保溫組顯著減慢(P<0.05)；由圖3B可見，心率在0.5 h較保溫組顯著加快(P<0.05)，在1.0、1.5 、2.0 h極顯著加快(P<0.01)；而在整個試驗過程中兩組羔羊直腸溫度差異不明顯(P>0.05)，其均值為39.7 ℃±0.1 ℃；由圖3C可見，冷凍組血糖濃度在1.0、1.5、2.0 h較保溫組顯著升高(P<0.05)。

2.3 外源性注射Ghrelin對羔羊基本生命體征和血糖的影響

羔羊在進入保溫圈和冷凍艙后2 h注射外源性Ghrelin，從圖4可見，盡管保溫組和冷凍組之間(無論是否注射Ghrelin)呼吸頻率、心率和血糖濃度均有差異(P<0.05或P<0.01)，但是在同一溫度組同一時間點中Ghrelin注射組和對照組之間以上3種指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)，而且同一組羔羊在Ghrelin注射前后以上3種指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。在整個試驗過程中各組羔羊之間直腸溫度差異不顯著(P>0.05)。

A.呼吸頻率;B.心率;C.直腸溫度;D.血糖；同試驗開始(11:00給料)值比較差異顯著(P<0.05)用*表示，極顯著(P<0.01)用**表示

A.呼吸頻率；B.心率；C.血糖；保溫組和冷凍組之間比較差異顯著(P<0.05)用*表示，極顯著(P<0.01)用**表示

A.呼吸頻率；B.心率；C.血糖；同一時間點，兩組之間比較差異顯著(P<0.05)，用*表示，差異極顯著( P<0.01)，用**表示

3 討論

本試驗結(jié)果顯示，斷奶羔羊在室溫下禁食24 h，可引起呼吸頻率和心率顯著減慢，直腸溫度顯著下降，血糖濃度降低。張伯偉等[6]研究結(jié)果表明，新疆伊犁馬在室溫下禁食禁水48 h，期間時間點心率和呼吸頻率均顯著慢于正常飼喂馬匹。Ohmura H等[7]報道，英純血馬禁食24 h內(nèi)心率均低于正常采食馬匹，這些結(jié)果同本試驗結(jié)果一致。在禁食對血糖影響方面，在馬、牛和魚類研究顯示,禁食一段時間后均觀察到血糖濃度較正常飼喂動物降低的現(xiàn)象[8-11]。動物在禁食情況下，由于不能從外界獲取能量，只有降低自身代謝水平，例如減弱心血管活動和呼吸運動，甚至降低體溫，以維持基礎(chǔ)代謝。另一方面，可能由于禁食使糖攝入和糖的異生原料減少，因而造成血糖濃度下降。

動物暴露于冷環(huán)境中，容易造成冷應(yīng)激。新疆細毛羊?qū)儆诿饧嬗眯?，該品種適于干燥寒冷高原地區(qū)飼養(yǎng)，但羔羊在斷奶應(yīng)激和饑餓的情況下，對寒冷的抵抗力相對減弱。本試驗結(jié)果表明，在禁食32 h后，新疆細毛羊羔羊在-24.7 ℃±0.2 ℃人工冷凍艙保持冷暴露2 h，同保溫組比，在冷暴露0.5 h后心率加快，1.0 h 后血糖濃度升高，1.5 h后呼吸頻率減慢，而體溫在此過程中變化不明顯。劉璐等[1]報道，禁食24 h的小尾寒羊在-13.3 ℃～-14.7 ℃急性冷暴露2 h，羔羊心率和呼吸頻率均較保溫組的羊快，血糖濃度在15 min后高于保溫羊，體溫變化也不明顯。姜冬梅等[12]報道，禁食12 h的蛋雞置于 3.0 ℃±1.0 ℃冷暴露5 h ，心率和呼吸頻率分別在2 h和3 h后較試驗前顯著減慢。井霞[13]報道，冬季(12月～2月)慢性冷應(yīng)激期荷斯坦奶牛的呼吸頻率相對于秋季(9月～11月)非應(yīng)激期顯著下降。于長青等[14]發(fā)現(xiàn)， Wistar 大鼠置于4 ℃±2 ℃的冷環(huán)境，連續(xù)8周，每天冷暴露4 h，在第2周時心率較保溫大鼠顯著升高，并升高持續(xù)到第8周。蔣華瓊等[15]報道，SD大鼠在急性冷暴露-15 ℃±1 ℃下3 h，引起直腸溫度顯著下降，血糖濃度也下降。大鼠在冷暴露情況下，出現(xiàn)體溫下降情況[16]。從以上結(jié)果來看，冷暴露由于動物種屬不同，暴露前動物生理狀態(tài)不同以及冷暴露溫度和持續(xù)時間不同，均可能影響動物基本生命體征或血糖濃度，但對各指標(biāo)影響有所差異。在冷應(yīng)激情況下，為了維持體溫，增加貯存糖原的分解，而使血糖升高，為機體活動供能，因而對于體表保溫能力相對較強的細毛羊，在急性冷應(yīng)激情況下一般不會出現(xiàn)體溫較大幅度的波動，而對于體表被毛相對較少的大鼠來說，其保溫能力相對弱，這可能是冷應(yīng)激情況下體溫下降的原因。

之前初步研究[2]提示,外源性Ghrelin可影響羔羊冷應(yīng)激引起的血糖升高，但是本試驗結(jié)果顯示，對于禁食羔羊，無論是在保溫圈舍還是冷凍艙，靜脈一次性注射外源性Ghrelin均未對羔羊基本生命體征和血糖濃度造成影響。Thidar Myint H等[17]給荷斯坦小母牛一次性靜脈注射Ghrelin，在注射后2 h內(nèi)未見血糖有顯著變化。然而，在人類和鼠研究表明，外源性Ghrelin可升高血糖[18]。目前，普遍認為當(dāng)人或動物饑餓時Ghrelin水平升高，而在飽腹后Ghrelin水平下降，但是在反芻動物牛和羊可能由于其胃排空相對單胃動物慢，因而在短期禁食時并不表現(xiàn)Ghrelin水平升高[19]。羊和牛屬于多胃動物，而人類和鼠屬于單胃動物，推測Ghrelin對血糖調(diào)控可能在單胃動物和多胃動物之間也存在差異，其機理有待進一步探究。

本研究結(jié)果顯示，羔羊在禁食后基本生命體征和血糖水平下降，在急性冷暴露情況下心率加快，血糖濃度升高，而呼吸頻率減慢，但禁食羔羊無論處于室溫還是急性冷暴露情況下，外源性Ghrelin并不影響其基本生命體征和血糖濃度，提示羔羊在禁食和低溫情況下可通過調(diào)整自身活動，以維持機體穩(wěn)態(tài)，并且Ghrelin可能并未參與該調(diào)整過程。

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Effects of Fasting，Cold Exposure and Exogenous Ghrelin Injection on Physiological Indexes in Lambs

WANG Qin1，ZHAO Hong-qiong1，XU Qin2，HOU Yu1，KALIBIXIATI·Aimulajiang1，YAN Shu-ping1，YAO Gang1，LIU Jiang-wei2，ZHANG Dan1，WANG Li-fang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.DepartmentofLaboratoryAnimalScience,GeneralHospitalofXinjiangMilitaryRegion，Urumqi，Xinjiang，830000，China)

In order to explore the effect of acute cold exposure and exogenous injection of ghrelin on physiological indexes of lambs,basic vital signs,physiological indexes and blood glucose concentration of lambs were monitored after fasting for 24 h,then freezing (-24.7 ℃ ± 0.2 ℃) for 2 h.Moreover,changes of above indexes of lambs by exogenous ghrelin injection were determined.The results showed that breathing rates,heart rates and blood glucose concentrations after fasting for 8 h,16 h and 24 h were significantly decreased compared with that before fasting (P<0.05).Rectal temperature after fasting for 16 h and 24 h were significantly reduced compared with that before fasting (P<0.01),however,blood physiological indexes had no changes during the fasting period (P>0.05). Breathing rates after cold exposure for 1.5 h and 2 h were slowed compared to warm groups (P<0.05),however,heart rates and blood glucose concentrations after cold exposure for 1.0 h,1.5 h and 2 h were significantly increased (P<0.05).Changes of above indexes were not found by intravenously injecting ghrelin after 2 h of cold exposure (P>0.05).These results indicated that lambs in the fasting and low temperature conditions can adjust their activities to maintain the body homeostasis,and ghrelin may not be involved in the process.

fasting; cold exposure; ghrelin; lamb; blood glucose

2016-08-01

國家自然科學(xué)基金項目(31560684；31201872)

王 琴(1989-)，女，新疆塔城人，碩士研究生，主要從事動物生理學(xué)研究?！魍蓉暙I作者。

S852.21

A

1007-5038(2017)04-0040-06

*通訊作者