鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA的分子特征及種類(lèi)分析

李 欣，田守龍，何柳芬，劉百?gòu)?qiáng)，賈 佳，任邵娜，蒲文珺，張浩吉

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山 528231)

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鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA的分子特征及種類(lèi)分析

李 欣，田守龍，何柳芬，劉百?gòu)?qiáng)，賈 佳，任邵娜，蒲文珺，張浩吉*

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山 528231)

為探究從廣東省清遠(yuǎn)的鵝體內(nèi)采集的蛔蟲(chóng)(Ascaridiaanseris)的種類(lèi)，對(duì)臨床采集的鵝蛔蟲(chóng)樣品，在形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，用保守引物NC5和NC2擴(kuò)增鵝蛔蟲(chóng)的ITS rDNA基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序后，獲得大小為1 009 bp的鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA基因序列(GenBank登錄號(hào)為KC905082)。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，鵝蛔蟲(chóng)5.8 S rRNA基因與GenBank 收錄的雞蛔蟲(chóng)(登錄號(hào)為AJ001508)同源性為96%，而與不同地理株的鴿蛔蟲(chóng)的同源性在91%～96%之間；禽蛔科的雞蛔蟲(chóng)、鴿蛔蟲(chóng)和鵝蛔蟲(chóng)同一進(jìn)化分支，鵝蛔蟲(chóng)、雞蛔蟲(chóng)和鴿蛔蟲(chóng)處于各自的獨(dú)立進(jìn)化分支。上述證明，鵝蛔蟲(chóng)是不同于鴿蛔蟲(chóng)的一個(gè)獨(dú)立有效種，在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與雞蛔蟲(chóng)更親近。

鵝蛔蟲(chóng)；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核糖體DNA；聚合酶鏈反應(yīng)；序列分析

鵝蛔蟲(chóng)(Ascaridiaanseris)隸屬于禽蛔科(Ascarididae)禽蛔屬的一種大型線蟲(chóng)，蟲(chóng)體寄生于鵝的小腸，主要分布于我國(guó)和前蘇聯(lián)的一些地區(qū)[1]。鵝感染后主要癥狀為食欲不振、精神沉郁、羽毛松亂、下痢、消瘦，對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)一定的危害。蟲(chóng)體種類(lèi)鑒定是寄生蟲(chóng)病診斷和防控的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的寄生蟲(chóng)鑒定方法主要是依據(jù)蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，此法簡(jiǎn)單通用，但是對(duì)形態(tài)相近的蟲(chóng)體、蟲(chóng)卵以及幼蟲(chóng)，形態(tài)學(xué)鑒定具有一定局限性[2-3]。隸屬于禽蛔科的雞蛔蟲(chóng)(A.galli)、鴿蛔蟲(chóng)(A.columbae)和鵝蛔蟲(chóng)(A.anseris)各自寄生的宿主不同，但蟲(chóng)體形態(tài)差異很小，尤其是鵝蛔蟲(chóng)，在臨床上鮮有感染和發(fā)病的報(bào)道，而且對(duì)鵝蛔蟲(chóng)種類(lèi)的有效性也存在爭(zhēng)議[4]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將PCR擴(kuò)增和序列分析技術(shù)相結(jié)合，可以在基因水平揭示物種間的差異和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[5]。其中ITS rDNA是最常選用的遺傳標(biāo)記[6]。ITS是核糖體DNA中介于18 S和28 S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括 ITS1、5.8S和ITS2三段序列[7]。由于其兩端為小亞基和大亞基，不會(huì)像rRNA基因那樣受到功能上的限制。 ITS區(qū)域傾向于比較高的進(jìn)化速率，在核苷酸序列和長(zhǎng)度上導(dǎo)致了很大的變異性[8]。ITS rDNA在物種進(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征，在種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是最廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)種間分類(lèi)鑒定的理想遺傳標(biāo)記[9-10]。本試驗(yàn)對(duì)采集自廣東鵝小腸的鵝蛔蟲(chóng)在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因組DNA抽提，用能擴(kuò)增蟲(chóng)體ITS區(qū)的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，以期為鵝蛔蟲(chóng)的分子鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 試驗(yàn)所用的蟲(chóng)體均為2012年9月從廣東省清遠(yuǎn)鵝場(chǎng)的臨床病鵝的小腸里收集的鵝蛔蟲(chóng)，樣本標(biāo)注為A.anseris-1和A.anseris-2，經(jīng)生理鹽水清洗干凈后保存于750 mL/L的酒精溶液中備用。

1.1.2 主要試劑 LB Broth，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Amp、IPTG、X-Gal、Agar、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker DL 2 000、DL 5 000、ExTaqDNA聚合酶、pMD-18T載體、DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)體DNA抽提 從保存于750 mL/L酒精中取出單個(gè)的成蟲(chóng)，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次，稱(chēng)重10 mg，將蟲(chóng)體組織置于1.5 mL EP管中，用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過(guò)的微型剪刀將蟲(chóng)體組織剪碎，根據(jù)DNA提取試劑盒推薦的步驟提取蟲(chóng)體DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，置-20℃冰箱保存。

1.2.2 蟲(chóng)體ITS rDNA的PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]的擴(kuò)增寄生蟲(chóng)ITS rDNA的引物，引物序列為NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用時(shí)加入滅菌雙蒸水稀釋成10 μmol/mL，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系為50 μL， 其中ExTaqDNA聚合酶25 μL，引物NC5和NC2各2 μL(10 μmol/mL)，蟲(chóng)體DNA模板 4 μL，加入滅菌雙蒸水至50 μL。以實(shí)驗(yàn)室保存的鴿蛔蟲(chóng)基因組DNA為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為模板作為陰性對(duì)照。輕微振蕩并離心之后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，于12℃終止。

取6 μL 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳儀設(shè)置電壓150 V，100 mA，紫外透射儀觀察結(jié)果，并拍照記錄。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆鑒定和序列測(cè)定 將膠回收純化的基因片段連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/Amp/X-gal/IPTG平板培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h～24 h，從每個(gè)平板上隨機(jī)挑選單個(gè)白色菌落，再使用 LB/Amp+培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h～16 h。按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)將菌體中的質(zhì)粒提取，再將質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，選出陽(yáng)性質(zhì)粒，取10 μL質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ，37℃ 4 h，雙酶切檢驗(yàn)重組質(zhì)粒，挑選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)測(cè)序獲得序列進(jìn)行拼接，除去頭尾載體通用引物部分序列，截取完整NC引物擴(kuò)增序列全長(zhǎng)，將檢測(cè)的序列提交至NCBI進(jìn)行Blast比較和分析。用Clustal X 2.1[13]對(duì)獲得的序列分別進(jìn)行比對(duì)分析，用DNA Star 7.0軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank收錄的對(duì)不同種類(lèi)的蛔蟲(chóng)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，構(gòu)建種系關(guān)系進(jìn)化樹(shù)，確定鵝蛔蟲(chóng)的種類(lèi)分子特征和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

登錄NCBI網(wǎng)站，從GenBank下載蛔目的代表性種類(lèi)的ITS rDNA序列。包括蛔科(Ascaridae)蛔屬(Ascaris)的人蛔蟲(chóng)(A.lumbricoides)和豬蛔蟲(chóng)(A.suum)，禽蛔科(Ascarididae)禽蛔屬(Ascaridia)的雞蛔蟲(chóng)(A.galli)和鴿蛔蟲(chóng)(A.columbae)，弓首科(Toxocaridae)弓首屬(Toxocara)的犬弓首蛔蟲(chóng)(T.canis)、貓弓首蛔蟲(chóng)(T.cati)以及弓蛔屬的獅弓蛔蟲(chóng)(Toxascarisleonina)，進(jìn)行進(jìn)行同源性分析以及種系進(jìn)化樹(shù)的繪制(表1)。

2 結(jié)果

2.1 蟲(chóng)體ITS rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

用保守引物NC5/NC2對(duì)蟲(chóng)體的ITS rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果采自清遠(yuǎn)某鵝場(chǎng)的2個(gè)樣品和以鴿蛔蟲(chóng)作為陽(yáng)性對(duì)照，均擴(kuò)增出大小約1 100 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小相符，無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照；3.A.anseris-1；4.A. anseris-2

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將膠回收純化的目的片段連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中。對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到和蟲(chóng)體DNA條帶大小相同的片段。用限制酶EcoRⅠ單酶切，再用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，雙酶切結(jié)果得到3條大小750 bp～800 bp、250 bp～350 bp和2 000 bp～3 000 bp的條帶，根據(jù)載體的酶切位點(diǎn)，限制酶EcoRⅠ和HindⅢ將目的片段切割成2個(gè)大小不同的片段(圖2)。

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1.A.anseris-1；2.A.anseris-2

2.3 DNA序列的比對(duì)分析

2.3.1 序列測(cè)定比對(duì)以及同源性分析 核苷酸同源性分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鵝蛔蟲(chóng)與蛔蟲(chóng)代表性樣品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性分析

對(duì)試驗(yàn)獲得的鵝蛔蟲(chóng)2個(gè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)測(cè)序后除去特異性引物和前后端載體的通用引物片段，均得到一段長(zhǎng)度為1 009 bp的鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA序列，該序列C+G含量為39.06%，包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全長(zhǎng)5.8 S rRNA基因的序列，2個(gè)鵝蛔蟲(chóng)樣品ITS rDNA的序列同源性為100%，該序列提交至GenBank收錄登錄號(hào)為KC905802。與禽蛔科的其他蛔蟲(chóng)一樣，試驗(yàn)獲得的鵝蛔蟲(chóng)5.8 S rRNA基因長(zhǎng)度為157 bp的序列，ITS1長(zhǎng)為475 bp，ITS2長(zhǎng)為377 bp。在NCBI網(wǎng)站基于5.8 S rRNA基因的禽蛔科多種蛔蟲(chóng)的Blast分析顯示，試驗(yàn)獲得的鵝蛔蟲(chóng)5.8 S rRNA基因與GenBank收錄的雞蛔蟲(chóng)(登錄號(hào)為AJ001508)和鴿蛔蟲(chóng)的(登錄號(hào)為：JQ995321)5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性均為96%，與鴿蛔蟲(chóng)(登錄號(hào)為：AJ001509)的同源性為93%。與本實(shí)驗(yàn)室采集自佛山鴿蛔蟲(chóng)(登錄號(hào)為：KF147909)[14]的同源性為91%。

使用DNA Star7.0軟件，通過(guò)Clustal W方法，將試驗(yàn)獲得序列與GenBank收錄的蛔目不同科、屬的蛔蟲(chóng)代表性樣品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性比較結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 ITS rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 試驗(yàn)獲得的鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA序列包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全長(zhǎng)5.8 S rRNA基因的序列，基于5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2繪制的蛔蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分別見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 基于5.8 S rRNA基因的鵝蛔蟲(chóng)與其他相關(guān)蛔蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖4 基于ITS1+5.8 S+ITS2序列的鵝蛔蟲(chóng)與其他相關(guān)蛔蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

據(jù)陳淑玉等主編的《禽類(lèi)寄生蟲(chóng)學(xué)》記載，禽蛔科的雞蛔蟲(chóng)(A.galli)可寄生于雞、鷓鴣、針尾鴨和番鴨的腸道，其特征是尾乳突10對(duì)，交合刺長(zhǎng)度為0.65 mm～1.95 mm；鴿蛔蟲(chóng)(A.columbae)可寄生于鴿、孔雀和山斑鳩，尾乳突為14對(duì)～15對(duì)，交合刺長(zhǎng)度為1.76 mm～2.04 mm；前兩種是非常普遍的禽蛔蟲(chóng)種類(lèi)。而鵝蛔蟲(chóng)寄生于鵝的小腸，尾乳突為13對(duì)～14對(duì)，交合刺長(zhǎng)度約為0.82 mm，僅報(bào)道于我國(guó)和前蘇聯(lián)[1]。而對(duì)鵝蛔蟲(chóng)種類(lèi)的有效性，尚存在爭(zhēng)議。國(guó)外有學(xué)者認(rèn)為鵝蛔蟲(chóng)不是一個(gè)有效種，而是鴿蛔蟲(chóng)的同物異名[4]。因此，在我們將試驗(yàn)獲得鵝蛔蟲(chóng)(A.anseris)ITS rDNA序列提交GenBank后，被認(rèn)定為鴿蛔蟲(chóng)(A.columbae)，登錄號(hào)為KC909582。一般認(rèn)為，5.8 S rRNA基因具高度的保守性。試驗(yàn)從鵝蛔蟲(chóng)樣品擴(kuò)增獲得的5.8 S rRNA基因與GenBank收錄的雞蛔蟲(chóng)(登錄號(hào)為AJ001508)同源性為96%，而與不同地理株的鴿蛔蟲(chóng)5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性在91%～96%之間，這表明鵝蛔蟲(chóng)是不同于鴿蛔蟲(chóng)的一個(gè)獨(dú)立有效種，在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與雞蛔蟲(chóng)更親近。

林輝環(huán)[15]首次在我國(guó)廣東報(bào)道了鵝蛔蟲(chóng)的感染，認(rèn)為鵝蛔蟲(chóng)的形態(tài)跟雞蛔蟲(chóng)相似，雄蟲(chóng)體長(zhǎng)65 mm，雌蟲(chóng)體長(zhǎng)91 mm，但其肛前吸盤(pán)周?chē)鷽](méi)有輻射狀的結(jié)構(gòu), 翼較小, 肛后乳突只有2對(duì)，這些特征可與雞蛔蟲(chóng)區(qū)別之。目前，在除廣東外，在貴州、浙江、湖南等地也有鵝感染蛔蟲(chóng)(Ascaridia)的報(bào)道，但由于缺乏種類(lèi)的詳細(xì)觀察，往往都稱(chēng)之為禽蛔蟲(chóng)或雞蛔蟲(chóng)(A.galli)[16-18]。本試驗(yàn)從廣東清遠(yuǎn)鵝腸道采集的蛔蟲(chóng)的形態(tài)特征與林輝環(huán)所描述的相似，初步確定為鵝蛔蟲(chóng)。在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上獲得了具有分類(lèi)鑒定意義的鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA序列，并藉此與蛔目的多個(gè)代表性蛔蟲(chóng)種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，不論是5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2都獲得了相近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)形圖，證明禽蛔科的3種蛔蟲(chóng)處于同一進(jìn)化支，而鵝蛔蟲(chóng)形成了相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支。序列比對(duì)分析也發(fā)現(xiàn)，鵝蛔蟲(chóng)、雞蛔蟲(chóng)和鴿蛔蟲(chóng)的ITS1序列相對(duì)保守，不同種類(lèi)間的差異性小，種間同源性高達(dá)98%～100%。試驗(yàn)獲得的鵝蛔蟲(chóng)ITS rDNA序列資料反映了蟲(chóng)種分子遺傳特征，為鵝蛔蟲(chóng)的分子鑒定提供了依據(jù)。

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Species Analysis and ITS rDNA Molecular Characteristics ofAscaridiaanseris

LI Xin，TIAN Shou-long，HE Liu-fen，LIU Bai-qiang，JIA Jia，REN Shao-na，PU Wen-jun，ZHANG Hao-ji

(DepartmentofVeterinaryMedicine，F(xiàn)oshanUniversity，F(xiàn)oshan，Guangdong,528231，China)

In order to explore the species of theAscaridiaanseriscollected from the geese of Qingyuan,Guangdong provience,the conserved primers NC5 and NC2 were used to amplify the ITS rDNA of specimen ofAscaridiaanseriscollected from intestine of infected geese,and the recombinant plasmids were identified by polymerase chain reaction(PCR) and the products were sequenced.A 1 009 bp sequence in length of ITS rDNA ofA.anseris(KC905082) was obtained.Sequence Blast and phylogenetic analysis showed that the 5.8 S rDNA sequence ofA.anseriswas 96% identical with the same gene ofAscaridiagalli(AJ001508),and similarity was between 91% and 96% compared with specimens ofAscaridiacolumbaefrom different areas available in GenBank.TheA.anseris,A.galliandA.columbaerespectively grouped into each solitary clade.The results showed that theA.anserisis a independent valid species,which appeared to be closely related toA.gallion the phylogenetic relationship.

Ascaridiaanseris；ITS rDNA； PCR；sequence analysis

2016-08-25

廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目 (2013KJCX0187)

李 欣(1992-)，女，福建三明人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疾病防控研究。

S852.731;S858.33

A

1007-5038(2017)04-0019-05

*通訊作者