A群牛輪狀病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

李 凡,周 芳, 岳 華,湯 承

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

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A群牛輪狀病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

李 凡,周 芳, 岳 華,湯 承*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

牛輪狀病毒(Bovine rotavirus, BRV)是犢牛腹瀉的重要病原之一，了解病毒的分子結(jié)構(gòu)和功能以及遺傳進(jìn)化，對該病毒的檢測方法和防控具有重要意義。論文對近年來在A群BRV的重要結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的分子特征和功能的研究進(jìn)展做一綜述。

牛輪狀病毒；分子特征；遺傳進(jìn)化

牛輪狀病毒(Bovine rotavirus, BRV)是犢牛腹瀉的重要病原之一。1968年Mebus等首次發(fā)現(xiàn)了BRV，并證實(shí)BRV是引發(fā)新生犢牛腹瀉的主要病原，并將其定名為NCDV標(biāo)株毒株[1]。1980年福建畜牧獸醫(yī)研究所研究證實(shí)BRV也存在我國牛群中[2]。牛輪狀病毒與其他輪狀病毒一樣，屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，無囊膜雙鏈RNA病毒，直徑大約60 nm～80 nm，是一個對稱的20面體，電鏡下觀察可以看到典型的“車輪狀”。RV由3層衣殼構(gòu)成，分為11個基因階段，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6、VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中VP1～VP3被認(rèn)為是RV的核心蛋白,是基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中不可缺少的一種蛋白[3-4]；VP6被稱為內(nèi)衣殼蛋白，是決定RV分組的特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，是RV感染血清抗體檢測的重要候選抗原；VP7和VP4蛋白決定RV的G型與P型以及它的毒力；NSP1～NSP6非結(jié)構(gòu)蛋白在輪狀病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組成病毒復(fù)制酶、出芽、等過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，BRV感染在全球范圍內(nèi)流行，嚴(yán)重威脅著全世界養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展[5-6]，因此有必要加強(qiáng)對BRV的及時監(jiān)測和防治。本文重點(diǎn)闡述A群BRV的幾個重要結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的分子特征及分子檢測方法的研究進(jìn)展。

1 牛輪狀病毒重要蛋白的功能及分子特征

2008年Matthijnssens J科研小組通過分析比對GenBank中眾多已知的不同RV毒株的每個基因節(jié)段編碼區(qū)核苷酸同源性，為每個基因節(jié)段對應(yīng)的基因型的序列同源性定臨界值從而來確定每個毒株的基因型。不同基因節(jié)段對應(yīng)不同的基因型，按照下面的排列順序?qū)群輪狀病毒進(jìn)行新的分類和命名VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5，每個基因節(jié)段相對應(yīng)的基因型為Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx，其中x表示被命名的輪狀病毒相應(yīng)的基因型，通過此方法命名RV可直觀的觀察到病毒基因的重組。而通常以輪狀病毒VP4和VP7所決定的基因型來表示其毒株的基因型。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的G型有27個，P型有37個[7]。其中12個G型(G1～G3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21和G24)和 11個P型(P[1]、P[3]、P[5-7]、P[11]、P[14]、P[17]、P[21]、P[29]和P[33])在牛輪狀病毒中被發(fā)現(xiàn)。其中G6、G8、G10和P[1]、P[5]、P[11]基因型被研究證實(shí)在BRV中最常見[8]。

隨著牛輪狀病毒不斷在世界各地被發(fā)現(xiàn)，BRV對養(yǎng)牛業(yè)的危害越發(fā)嚴(yán)重，近年來，對于BRV的研究也不斷深入。為了加強(qiáng)對牛輪狀病毒的診斷和防治，目前很多學(xué)者研究開發(fā)預(yù)防牛輪狀病毒的疫苗，其中VP4 、VP6、VP7這3種結(jié)構(gòu)蛋白成為研究的熱點(diǎn)[9]。因?yàn)檫@3種結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性與輪狀病毒的抗原特性有重要的關(guān)系。由第4節(jié)段基因編碼的外殼敏感蛋白VP4是輪狀病毒的血凝素抗原；由第6節(jié)段基因編碼的內(nèi)殼蛋白是輪狀病毒的群組抗原；由第7、8或9節(jié)段的基因編碼的外殼糖蛋白VP7是輪狀病毒的中和抗原[10]。另外，NSP4非結(jié)構(gòu)蛋白的一些抗原特性，也為RV疫苗的研制開辟了新的思路和方向[11]。目前，疫苗的研究還處在對RV的主要保護(hù)性抗原的結(jié)構(gòu)和功能的研究[12]。

1. 1 VP4結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特征

1. 1.1 VP4結(jié)構(gòu)蛋白的功能 VP4蛋白由輪狀病毒第4節(jié)段基因編碼，位于成熟的病顆粒表面，可以被胰酶裂解成長度不等的帶羧基端的VP5和帶氨基末端的VP8兩個片段。VP4裂解后能提高輪狀病毒的感染能力和穿入細(xì)胞的能力，增強(qiáng)輪狀病毒的繁殖能力，在胰酶的作用下，就能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞的空斑的形成。當(dāng)輪狀病毒入侵宿主細(xì)胞時，病毒顆粒必須失去由VP4和VP7形成的雙層衣殼，形成轉(zhuǎn)錄活性較大的DLP，才能進(jìn)入到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。VP4蛋白還可以決定病毒的毒力，被認(rèn)為是輪狀病毒連接宿主細(xì)胞受體的病毒蛋白。牛輪狀病毒的VP4外殼蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗原，是病毒的重要保護(hù)性抗原之一， 具有良好的免疫原性，能使某些幼齡動物和人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，在不同的型之間還存在交叉保護(hù)，是疫苗研究最有前途的蛋白之一[13]。但目前用于BRV的基因工程亞單位疫苗還沒有被研制出來。

1.1.2 VP4基因的分子特征及遺傳進(jìn)化分析 VP4的氨基酸序列84-180位點(diǎn)之間為VP8亞單位，是VP4亞型和血清型特異性位點(diǎn)，是VP4基因的主要中和反應(yīng)位點(diǎn)，并且只需對這一區(qū)域測序就可斷定VP4所決定的P型[14]。目前已發(fā)現(xiàn)的P型達(dá)37種，在牛輪狀病毒中最常見的P型是[P[1]、P[5]和P[11][8]。在我國BRV分離毒株中，其基因型主要為P[1]、P[11]和P[6]。GenBank中登錄的BRV VP4全基因序列共有36個，未明確P型的有7個，確定P型的有29個分為7 種，分別為P[1]型5個、P[5]型6個、P[7]型2個、P[11]型10個、P[14]型4個、P[29]型1個、P[33]型1個。系統(tǒng)發(fā)育顯示，不同P型分為不同支，相同P型但不同G型的在同一獨(dú)立的小支上。VP4結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)層次與核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹一樣。把VP4核苷酸序列進(jìn)行同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，不同P型之間的VP4基因序列的同源性在58.3%～74.6%之間，相同的P型之間的同源性為85.5%～98.5%；氨基酸序列比對分析表明，不同P型的VP4氨基酸序列的同源性在53.8%～70.6%之間，相同的P型之間的同源性為94.6%～97.8%之間。由此可知，不論核苷酸序列還是氨基酸序列，相同基因型之間高度保守，但不同P型之間VP4的序列卻發(fā)生了很大的變異。

1. 2 VP6結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特性

1. 2.1 VP6結(jié)構(gòu)蛋白的功能 根據(jù)VP6結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性和PAGE電泳圖的差異，可以將輪狀病毒分為A～G7個群，其中A、B和C群RV易感染牛，A群BRV是引起牛腹瀉最常見的一種病毒[15]，對養(yǎng)牛業(yè)危害最大。根據(jù)VP6蛋白是否存在2個不同的非重疊抗原特異性抗原表位，可以將A組輪狀病毒分為4個亞群，分別為SGⅠ亞群、SGⅡ亞群、SGⅠ/Ⅱ亞群和非SGⅠ/Ⅱ亞群。與SGⅠ亞群的抗體相關(guān)的抗原表位有172位點(diǎn)的Ala(Alanine，丙氨酸)、299位點(diǎn)的Asn(Asparaginate，天冬氨酸)、305位點(diǎn)的Ala、310位點(diǎn)的Asn。與SG Ⅱ亞群的抗體相關(guān)的抗原表位有248位點(diǎn)的Phe(Phenylalanine，苯丙氨酸)、305位點(diǎn)的Asn、306位點(diǎn)的Ala、310位點(diǎn)的Gln(Glutamine，谷氨酰胺)、315位點(diǎn)的Gln。亞群抗原決定簇的氨基酸序列被認(rèn)為是非連續(xù)的，它依賴于蛋白的空間結(jié)構(gòu)[16]。利用VP6蛋白與單克隆抗體的反應(yīng)性及肽掃描技術(shù)合成連續(xù)7肽，可以確定A組哺乳動物輪狀病毒的VP6蛋白的4個免疫優(yōu)勢位點(diǎn)(32-64、155-167、208-274、380-397)，這是輪狀病毒A組共同的抗原決定簇，是由連續(xù)的線性氨基酸位點(diǎn)組成，不受蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響[17]。輪狀病毒VP6蛋白的氨基酸序列在不同血清型或基因型間高度保守，其功能性區(qū)域位于105-328位點(diǎn)之間，其中122-147位點(diǎn)的氨基酸為主要聚合區(qū)域。2013年，Aiyebo等研究發(fā)現(xiàn)，VP6上存在高密度帶電的殘疾識別位點(diǎn)，這些位點(diǎn)是四聚體的抗原表位肽，當(dāng)該位點(diǎn)的負(fù)電荷區(qū)域與輪狀病毒單克隆抗體結(jié)合后，復(fù)制活躍的病毒顆粒通道Ⅰ，在空間上會造成封閉，從而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA就不能從通道Ⅰ通過，進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)而阻斷自代病毒顆粒的形成。這種特殊的病毒中和反應(yīng)機(jī)制與傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)不同，這或許在機(jī)體發(fā)揮免疫的過程中占有重要地位，同時也為疫苗的研制提供了新的方向。

1. 2.2 VP6基因的分子特征及遺傳進(jìn)化分析 VP6基因序列是輪狀病毒11個基因節(jié)段中最保守的，目前已成為多種檢測方法的首選靶基因[18]。依據(jù)分類命名標(biāo)準(zhǔn)，VP6基因決定病毒的I型。GenBank中登錄的BRV VP6全基因序列共有30個，未明確Ⅰ型的有15個，確定Ⅰ型的共15個分2種，分別為I2型13個、I5型2個。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，I5基因型的BRV單獨(dú)的聚為一大支，I2基因型的BRV單獨(dú)的聚為一大支。相同I2型BRV的VP6核苷酸序列的同源性在86.3%～98.1%；相同I5型BRV的VP6核苷酸序列的同源性為100%；I2型與I5型之間的同源性為77.8%～79.9%。I2型BRV的VP6氨基酸序列的同源性在97.2%～99.5%；I5型之間的同源性為100%；I2和I5型之間的同源性為90.4%～91.4%。由以上的分析可知，VP6作為最保守的靶基因，序列間也存在堿基變異，故我們應(yīng)加強(qiáng)對VP6基因的實(shí)時檢測，以便及時更新檢測引物，提高檢出率。

1. 3 VP7結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特征

1. 3.1 VP7結(jié)構(gòu)蛋白的功能 輪狀病毒VP7因毒株的不同，可由第7、8或9基因節(jié)段編碼，全長297或326個氨基酸[19]。作為輪狀病毒的主要中和抗原，VP7同VP4一樣已被深入研究。Dormitzer等研究表明，VP7是一種鈣離子結(jié)合蛋白，鈣離子結(jié)合的必要位點(diǎn)是VP7氨基酸序列上第75和279位點(diǎn)的脯氨酸。Ca2+對輪狀病毒VP7外殼蛋白的穩(wěn)定性和成熟病毒顆粒的形成有至關(guān)重要的意義。Ningguo等研究發(fā)現(xiàn)，稀釋Ca2+濃度將會導(dǎo)致具有3層顆粒結(jié)構(gòu)的輪狀病毒丟失外殼蛋白VP4和VP7，形成沒有感染性的病毒的顆粒，而且只能通過脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染來感染易感細(xì)胞。在研究輪狀病毒與細(xì)胞受體的相互作用時發(fā)現(xiàn)，在輪狀病毒吸附細(xì)胞以后，VP7能夠與整合素、和相互作用，體外、和單克隆抗體可以有效的阻止輪狀病毒侵入宿主細(xì)胞，但是不能抑制輪狀病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。

1. 3.2 VP7基因的分子特征及遺傳進(jìn)化分析 VP7的氨基酸序列中有9個高變區(qū)域，這些高變區(qū)域在相同的血清型中相對保守，但在不同的血清型間卻是高度變異的[20]。VP7的高變區(qū)涉及抗原位點(diǎn)的形成，根據(jù)其抗原性決定G血清型，目前已發(fā)現(xiàn)的G型達(dá)27種，其中G6、G8和G10型在牛輪狀病毒中最常見[8],我國牛輪狀病毒主要流行的G型是G6和G10型[6]。GenBank中登錄的BRV VP7全基因序列共有209個，未明確G型的有44個，確定G型的共165個分9 種，分別為G1型1個、G3型14個、G5型9個、G6型81個、G8型17個、G10型39個、G15型2個、G21型1個、G24型1 個。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，每種G基因型的毒株有單獨(dú)的聚成不同的小支，G10基因型與G8基因型的BRV遺傳進(jìn)化關(guān)系較近，共同聚為一個支，這兩種基因型有著相同的起源。核苷酸序列同源性比對顯示， 相同G基因型VP7的核苷酸序列同源性在84.7%～99.1%之間，不同基因型之間同源性在66.9%～78.2%之間；VP7氨基酸序列同源性比對顯示，相同G基因型VP7的氨基酸序列同源性在82.8%～95.9%之間，不同的G基因型同源性在68.0%～73.1%之間。由此可知，與VP4基因一樣，不論核苷酸序列還是氨基酸序列，相同基因型之間高度保守，但不同G型之間VP7的序列卻發(fā)生了很大的變異。

1.4 NSP4非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特征

1. 4.1 NSP4非結(jié)構(gòu)蛋白的功能 NSP4非結(jié)構(gòu)蛋白是輪狀病毒重要的毒力因子，是第一種被發(fā)現(xiàn)的腸毒素。在輪狀病毒的復(fù)制和致病性中鈣離子發(fā)揮著重要的作用，病毒顆粒的物理裝配需要鈣離子，而NSP4則可以選擇性的使細(xì)胞外的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，提高細(xì)胞漿中鈣離子的濃度[21]。細(xì)胞中鈣離子濃度升高可導(dǎo)致氯離子的分泌，從而引發(fā)腹瀉。所以進(jìn)一步加深對NSP4的功能的研究，有助于尋找到輪狀病毒新的治療方案及研發(fā)有效的疫苗。

1. 4.2 NSP4基因的分子特征及遺傳進(jìn)化分析 NSP4是由第10或11個基因節(jié)段編碼，基因全長為750 bp，只有一個開放閱讀框架，編碼175個氨基酸。Kirkwood等研究發(fā)現(xiàn)，NSP4可分為3個基因型，且每個基因型之間核苷酸同源性均大于90%。GenBank中登錄的BRV NSP4全基因序列共有82個，未明確E型的有66個，確定E型的共16個分2 種，分別為E1型3個、E2型13個。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，這兩種不同的基因型分別聚為不同的兩大支。同源性分析比對發(fā)現(xiàn)，相同E型的NSP4基因序列同源性為86.7%～99.9%，不同E型的同源性為80.6%～82.9%，與之前報(bào)道的不同基因型間同源性高達(dá)90%以上有所不同。

2 小結(jié)與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，針對BRV的研究也在不斷深入。BRV作為公認(rèn)的犢牛腹瀉病毒之一，對牛養(yǎng)殖業(yè)的危害很大，因此制定出更好的預(yù)防措施尤為重要?，F(xiàn)在最為常用的預(yù)防措施是疫苗注射，所以對BRV的分子特征及蛋白功能的了解有助于安全高效的疫苗的研發(fā)。就BRV而言，由VP6基因編碼的VP6蛋白在不同血清型或基因型之間高度保守，是亞單位疫苗的首選，且有連續(xù)抗原表位，具有研制合成肽疫苗的潛力，但免疫原性仍然需要大量的驗(yàn)證，此外，即使VP6是最保守的基因，仍有堿基變異，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)VP6基因在牦牛上變異很大，影響了現(xiàn)有的PCR方法的檢出[22]，所以對VP6基因的實(shí)時檢測，及時更新檢測引物，對提高檢出率很重要； VP4和VP7外殼蛋白一直以來被認(rèn)為具有免疫保護(hù)作用，是最主要的中和抗體，但是在不同型之間不具有交叉保護(hù)，作為疫苗的候選蛋白需要進(jìn)一步的研究。此外，VP4基因和VP7基因是BRV分型的依據(jù)，現(xiàn)有的分型方法主要是套式PCR,最為經(jīng)典的是Gouvea等建立的用來確定牛和豬輪狀病毒G型和P型的RT-nested PCR方法，至今仍被很多研究者采用,但是仍有許多樣本無法使用現(xiàn)有的方法分型，可見 VP4和VP7也有變異，未來的疫苗的研制也需加強(qiáng)監(jiān)測力度；NSP4蛋白是BRV的重要毒力因子，在疫苗的研發(fā)中具有很大的潛力。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)， BRV作為引起犢牛腹瀉的重要病因之一，也可能導(dǎo)致人腹瀉，在此基礎(chǔ)上對于從人腹瀉病料中分離到的RV進(jìn)行全基因組分析后發(fā)現(xiàn)，BRV與人源RV之間有明顯的重組現(xiàn)象[23]，因此重組后的RV可能對人和牛都具有感染力，其公共衛(wèi)生學(xué)意義值得關(guān)注，但目前國內(nèi)并沒有對于BRV與人RV的關(guān)系和基因重組的研究，我們應(yīng)加強(qiáng)對病毒的變異和重組的研究和監(jiān)測， 為研究RV的更好的預(yù)防措施奠定基礎(chǔ)。

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Progress on Molecular Biology Characteristics of Group A Bovine Rotaviruses

LI Fan ,ZHOU Fang ,YUE Hua,TANG Cheng
(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu，Sichuan,610041,China)

Bovine rotavirus (BRV) is one of the important pathogens of calf diarrhea.Therefore, it is very important to realize the molecular structure, function and genetic evolution of virus for control, prevention and detection method of BRV. The molecular characteristics and function of several important structural proteins and non-structural proteins of group A BRV were summarized in this review.

Bovine rotavirus；molecular characteristics；genetic evolution

2016-10-26

李 凡(1992-)，女(壯族)，云南文山人，研究生，主要從事動物病原分子生物學(xué)研究。 *通訊作者

S852.653

A

1007-5038(2017)06-0082-04