寄生蟲蛋白質(zhì)磷酸化修飾及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

趙 彬，唐亞蘭，陸 珂，曹曉丹，韓 倩，呂 超，王 濤，傅志強(qiáng)，林矯矯, 3，洪 煬*

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241;3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

文獻(xiàn)綜述

寄生蟲蛋白質(zhì)磷酸化修飾及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

趙 彬1，唐亞蘭2，陸 珂2，曹曉丹2，韓 倩2，呂 超2，王 濤2，傅志強(qiáng)2，林矯矯2, 3，洪 煬2*

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241;3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生命體內(nèi)一種重要的且普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是一種動(dòng)態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程，在生命過程中起著重要的作用。論文介紹了蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究進(jìn)展及其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用，并對(duì)其研究前景進(jìn)行了展望。

磷酸化;寄生蟲;磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)一種重要的并且普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。它是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)上的過程，也是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一。真核生物細(xì)胞中主要的磷酸化氨基酸為酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸[1]。其中，磷酸化的絲氨酸最多，蘇氨酸次之，而酪氨酸最少，三者的比例約為1 800∶200∶1[2]。大多數(shù)磷酸化蛋白都有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，并且發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)是可變的，因此，一種蛋白可能有多種磷酸化的形式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動(dòng)物基因組中，2%～5%基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸酶[3-4]。磷酸化修飾本身所具有的簡(jiǎn)單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團(tuán)的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾成為真核細(xì)胞中一種最普遍的調(diào)控方式。蛋白質(zhì)在蛋白激酶作用下發(fā)生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化，這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及肌肉收縮等過程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)，因此被形象地描述為細(xì)胞生理活動(dòng)的分子開關(guān)[5]。目前已知許多代謝過程異常與蛋白質(zhì)的磷酸化修飾相關(guān)，鑒于其在生命活動(dòng)中的重要作用，近年來，探索蛋白質(zhì)磷酸化的奧秘及其對(duì)蛋白功能的影響已成為眾多生物學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容，在寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域也已有一些關(guān)于磷酸化蛋白質(zhì)功能研究的相關(guān)報(bào)道。

1 寄生蟲蛋白質(zhì)磷酸化修飾

真核起始因子2B(eIF2B)是參與真核翻譯起始的重要蛋白，也是鳥苷酸交換因子。其在翻譯起始過程中將eIF2上結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，使eIF2可以重新參與翻譯起始，而eIF2α亞基的磷酸化修飾能夠抑制真核起始因子2B的功能。Joyce B R等[6]發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲磷酸化的eIF2α對(duì)于應(yīng)激反應(yīng)具有保守的調(diào)控作用，如果將該蛋白第71位的絲氨酸這一保守的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變后，該位點(diǎn)便不會(huì)發(fā)生磷酸化修飾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變蟲株在生活史中的宿主細(xì)胞外階段會(huì)受到影響，并且在體內(nèi)試驗(yàn)中，突變蟲株所引起的急性弓形蟲病在發(fā)病時(shí)間上會(huì)發(fā)生明顯地延遲，表明該位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化修飾對(duì)蟲體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。如果在速殖子的裂解周期中，特別是蟲體在宿主細(xì)胞外的這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，將eIF2α及其所在的應(yīng)激反應(yīng)通路作為藥物靶標(biāo)，對(duì)于抵抗急性和慢性弓形蟲病的發(fā)生可以產(chǎn)生多重治療效果。Avila C C等[7]對(duì)布氏錐蟲eIF2α的磷酸化修飾進(jìn)行了相關(guān)研究顯示，將196位可發(fā)生磷酸化修飾的蘇氨酸突變?yōu)楸彼岷螅淞姿峄揎検艿接绊?，但是突變后的蟲株仍然可以在小鼠和采采蠅中正常發(fā)育。因此，eIF2α亞基第169位的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)對(duì)蟲體的生長(zhǎng)發(fā)育不是必須的。

Leykauf K等[8]發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的頂端膜抗原1(AMA1)是否被磷酸化在蟲體的入侵過程中具有重要作用。研究顯示該蛋白第610位絲氨酸的磷酸化受環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)調(diào)節(jié)的蛋白激酶A(PKA)控制，如果將該位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼岫鹪撐稽c(diǎn)無法進(jìn)行磷酸化修飾，結(jié)果會(huì)嚴(yán)重影響蟲體的入侵過程，提示PKA對(duì)瘧原蟲裂殖子的入侵過程具有重要作用。

Mandal G等[9]發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲LmjAQP1蛋白的活性受有絲分裂原活化蛋白激酶2(MAPK2)調(diào)節(jié)。這兩種蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí)與只有LmjAQP1單獨(dú)表達(dá)時(shí)相比，蟲體在低滲的條件下能較快的恢復(fù)形態(tài)。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)LmjAQP1蛋白197位的蘇氨酸是該蛋白的磷酸化位點(diǎn)，將該位點(diǎn)的氨基酸突變之后，蟲體恢復(fù)形態(tài)的速度要明顯變慢。LmjAQP1蛋白的磷酸化修飾能夠使其代謝速度降低進(jìn)而延長(zhǎng)該蛋白活性的發(fā)揮。

Tang Q等[10]發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲蟲體外緣的肌球蛋白A是一類非傳統(tǒng)的單體肌球蛋白，控制著蟲體運(yùn)動(dòng)以及侵入和逸出宿主細(xì)胞。小分子化合物130038能夠增強(qiáng)蟲體的運(yùn)動(dòng)及入侵，使蟲體內(nèi)鈣離子的水平增加，進(jìn)一步引起鈣依賴性的肌球蛋白A磷酸化修飾增強(qiáng)。如果將該蛋白中的主要磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變后，蟲體在小分子化合物130038作用后的運(yùn)動(dòng)能力受到抑制，突變蟲株即使在較高的鈣離子水平下，逸出宿主細(xì)胞的速度會(huì)明顯減慢。顯示剛地弓形蟲鈣離子依賴的肌球蛋白A磷酸化修飾在蟲體的運(yùn)動(dòng)以及侵入和逸出宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作。Bonilla-Moreno R等[11]發(fā)現(xiàn)，溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的肌球蛋白輕鏈(EhMLCI)能夠結(jié)合重鏈形成有收縮性的肌動(dòng)球蛋白，進(jìn)而使阿米巴原蟲具有運(yùn)動(dòng)活性。EhMLCI羧基端酪氨酸殘基的磷酸化能夠負(fù)調(diào)控肌球蛋白的活性。如果將該酪氨酸用苯丙氨酸進(jìn)行替換，那么蟲體的運(yùn)動(dòng)能力會(huì)受到影響，因此EhMLCI羧基端酪氨酸的磷酸化/去磷酸化能夠直接影響肌球蛋白的功能。

在血吸蟲中，蛋白的磷酸化修飾對(duì)蟲體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)同樣具有重要作用。Davies S J等[12]認(rèn)為蟲體表面存在有蛋白激酶，這些激酶的活性與信號(hào)傳導(dǎo)的受體有重要聯(lián)系。他們對(duì)曼氏血吸蟲表膜蛋白中蛋白激酶的活性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在蟲體被提取物中存在許多酪氨酸磷酸化的蛋白，但蟲體表膜蛋白只具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的活性，而沒有明顯的酪氨酸激酶的活性。

酪氨酸蛋白激酶(TK)在信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用，它能引起許多生物進(jìn)程的發(fā)生，如細(xì)胞的代謝、增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等，在人類癌癥治療的研究中，也將其作為一種有潛力的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行研究。早期研究發(fā)現(xiàn)，TK與血吸蟲配對(duì)后蟲體的分化有關(guān)，如雌蟲卵黃腺和卵巢的發(fā)育。阻斷該蛋白的作用可以減緩蟲體的發(fā)育，降低蟲體的產(chǎn)卵能力，進(jìn)而緩解病理?yè)p傷[13-14]。因此該蛋白也被作為潛在的藥物或疫苗靶標(biāo)。曼氏血吸蟲TK3和TK5都屬于Src家族成員，它們都具有Src特異性激酶的活性而且在蟲體繁殖過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。TK3在雌雄蟲的性腺中都有表達(dá)，通過藥物對(duì)其抑制可以降低有絲分裂的活性以及雌蟲的產(chǎn)卵能力[17]。TK4屬于Syk激酶家族成員，它主要存在于睪丸和卵巢等生殖器官中。TK4所在的信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)血吸蟲性腺細(xì)胞的增殖和分化。TK6是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的Src家族激酶，它能與TK4相互作用并且是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活蛋白[13]。

Yan Y等[18]對(duì)曼氏血吸蟲Ste-20樣激酶進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以激活人胚胎腎細(xì)胞和爪蟾卵母細(xì)胞的Jun N末端激酶(JNK)通路和MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，它是生發(fā)中心激酶家族的新成員。免疫組化分析結(jié)果顯示，該蛋白在成蟲體中含量豐富，在宿主與寄生蟲的相互作用中，其能夠參與宿主MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化。

Walker A J等[19]將曼氏血吸蟲的毛蚴分別暴露于對(duì)蟲體具有抗性和適宜性的中間宿主光滑雙臍螺的血淋巴中，然后對(duì)毛蚴中酪氨酸的磷酸化情況進(jìn)行相關(guān)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露在適宜性的光滑雙臍螺血淋巴中的毛蚴中，一個(gè)56 ku的酪氨酸磷酸化蛋白顯著地增加了5倍，而暴露在抗性的光滑雙臍螺血淋巴中的毛蚴中，該蛋白基本沒有變化。使用酪氨酸激酶的抑制劑染料木黃酮處理毛蚴后發(fā)現(xiàn)，蟲體的發(fā)育情況受到明顯的影響，表明該酪氨酸磷酸化的抑制可以影響毛蚴的發(fā)育。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該蛋白的磷酸化主要發(fā)生在體被。

Ludtmann M H等[20]發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲蛋白激酶C(PKC)在毛蚴向母胞蚴轉(zhuǎn)變的前24 h內(nèi)被磷酸化，在經(jīng)過31 h和48 h的發(fā)育后，該蛋白的磷酸化分別降低了72%和86%。將PKC去磷酸化后，可以加速毛蚴向胞蚴階段的轉(zhuǎn)化。提示PKC的磷酸化能夠抑制毛蚴向母胞蚴的轉(zhuǎn)化。磷酸化的PKC主要分布在神經(jīng)塊、分泌囊泡、體被、纖毛板以及胚細(xì)胞中。

Long T等[21]對(duì)曼氏血吸蟲的一種有絲分裂激酶-Polo樣激酶(SmPlk1)的功能進(jìn)行了相關(guān)研究，該蛋白在有絲分裂過程中具有保守功能，在爪蟾的卵母細(xì)胞模型中，其182位的蘇氨酸被磷酸化后可以引起有絲分裂的發(fā)生。該基因在原胚細(xì)胞中的表達(dá)量較高，原位雜交的結(jié)果顯示，該基因存在于雌蟲的卵母和卵黃細(xì)胞中以及雄蟲的精原細(xì)胞中。體外使用Plk的抑制劑BI2536作用于蟲體后，蟲體的性腺發(fā)生了改變，并且影響到卵細(xì)胞和精子的生成。

Swierczewski B E等[22]發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲cAMP依賴的蛋白激酶催化亞基(SmPKA-C)對(duì)蟲體的生存活力具有重要影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因在尾蚴和雌性的成蟲中高表達(dá)，在體外用PKA的抑制劑H-89或PKI 14-22酰胺酶對(duì)尾蚴進(jìn)行處理后，可以導(dǎo)致尾蚴的活力降低，而對(duì)成蟲進(jìn)行處理后，能夠抑制蟲體的產(chǎn)卵能力并且該過程具有劑量依賴性。在小鼠模型中，曼氏血吸蟲產(chǎn)卵量的減少也與蟲體內(nèi)該基因的表達(dá)下降以及PKA酶活力的降低有關(guān)，并且在該基因的表達(dá)恢復(fù)正常和PKA酶活力恢復(fù)正常后，蟲體的產(chǎn)卵量也恢復(fù)正常。

Ressurreicao M等[23]對(duì)曼氏血吸蟲p38 MAPK在毛蚴向母胞蚴轉(zhuǎn)化過程中所起的作用進(jìn)行了相關(guān)研究。他們發(fā)現(xiàn)在體外發(fā)育的前4 h，該蛋白的磷酸化水平比較低，當(dāng)培養(yǎng)了19 h和28 h后，該蛋白的磷酸化水平顯著增加了2.7倍和3.7倍。免疫組化顯示該蛋白主要分布在蟲體體被、神經(jīng)塊和胚細(xì)胞中。用抑制劑SB203580抑制該蛋白的活性后，能夠顯著增加毛蚴向母胞蚴轉(zhuǎn)化的比例。反之，如果用茴香霉素增加該蛋白的活性，則會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果。

2 寄生蟲磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)

由于生物體中磷酸化蛋白所涉及到的生物進(jìn)程通常都是錯(cuò)綜復(fù)雜的，例如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)等，傳統(tǒng)地針對(duì)單條信號(hào)傳導(dǎo)通路以及單個(gè)磷酸化蛋白分子的研究策略存在一定的局限性，因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)的理念和分析方法研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，可以從整體上觀察細(xì)胞或組織中蛋白磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化，進(jìn)而分析特定磷酸化修飾對(duì)生命過程的調(diào)控作用及分子機(jī)制，由此派生出磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(phosphoproteomics)的概念。其研究?jī)?nèi)容主要包括：①磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的檢測(cè)；②磷酸化位點(diǎn)的鑒定；③磷酸化蛋白質(zhì)的定量。通過該研究，可以揭示蛋白激酶和磷酸酶分別對(duì)蛋白磷酸化和去磷酸化的作用。

細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的豐度較低，因此在規(guī)?；淖R(shí)別和鑒定生物體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)及其變化之前，首先需要對(duì)磷酸化蛋白及其酶解肽段進(jìn)行富集。目前常用的方法為固相金屬親和層析法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)、金屬氧化親和層析法(metal oxide affinity chromatography,MOAC)、強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(strong cation exchange chromatography,SCX)、免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)、氨基磷酸酯化學(xué)衍生法(phosphoramindate chemistry,PAC)等。近年來，在寄生蟲研究領(lǐng)域，已經(jīng)有不少學(xué)者利用上述的純化方法對(duì)不同蟲體的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了相關(guān)研究。

Nakayasu E S等[24]利用SCX的富集法對(duì)克氏錐蟲的短膜期蟲體進(jìn)行了磷酸化蛋白組學(xué)的研究，一共鑒定到了237個(gè)磷酸化肽段，隸屬于119種不同的蟲體蛋白。其中明確匹配上的220個(gè)磷酸化位點(diǎn)中有148個(gè)是絲氨酸，57個(gè)是蘇氨酸，8個(gè)是酪氨酸。免疫沉淀法和免疫印跡法確認(rèn)了至少7個(gè)磷酸化的酪氨酸蛋白。這些鑒定到的磷酸化蛋白主要與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)性、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、致病機(jī)制、DNA/RNA/蛋白代謝和信號(hào)通路等相關(guān)。

Hem S等[25]對(duì)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的磷酸化蛋白組進(jìn)行了分析，通過IMAC法對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行富集和質(zhì)譜分析，共鑒定到445個(gè)磷酸化蛋白，這些蛋白主要參與蛋白的代謝、應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。又利用二氧化鈦(MOAC法)對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行富集和質(zhì)譜鑒定，在157個(gè)特異的磷酸化肽段中發(fā)現(xiàn)了181個(gè)特異的磷酸化位點(diǎn)，這些肽段來源于126個(gè)不同的蛋白中。在對(duì)錐蟲以及高等真核生物的磷酸化位點(diǎn)的保守區(qū)進(jìn)行多序列比對(duì)和聚類分析后發(fā)現(xiàn)，杜氏利什曼原蟲特異的磷酸化蛋白殘基與人的同系物具有較高的相似性，但是特異的磷酸化位點(diǎn)有明顯的不同，這對(duì)設(shè)計(jì)新的抗寄生蟲干預(yù)措施具有重要意義。

Treeck M等[26]通過IMAC法對(duì)惡性瘧原蟲的裂殖體和剛地弓形蟲的速殖子的磷酸化蛋白組進(jìn)行了相關(guān)研究，分別鑒定到5 000個(gè)和10 000個(gè)未知的磷酸化蛋白位點(diǎn)，提示蛋白的磷酸化修飾是這兩種寄生蟲中廣泛存在的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)該修飾在蟲體的體內(nèi)和體外蛋白中都存在，這可能與蟲體的排泄分泌活動(dòng)有關(guān)。兩種蟲體中都發(fā)現(xiàn)了磷酸化的酪蛋白，惡性瘧原蟲具有不一樣的磷酸化基序，它主要是由基因組中的高A/T形成的。

Panichaku T等[27]利用IMAC方法對(duì)感染及未感染間日瘧原蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)的紅細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)埃茲蛋白、輔肌動(dòng)蛋白1和Rho激酶這3個(gè)磷酸化蛋白發(fā)生了顯著得變化。其中生長(zhǎng)紅細(xì)胞的埃茲蛋白在與感染紅細(xì)胞裂解無接觸48 h～72 h后，磷酸化修飾減弱甚至消失。結(jié)果表明，間日瘧原蟲可通過下調(diào)埃茲蛋白的磷酸化水平來抑制紅細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致瘧疾引起的貧血癥狀。

Solyakov L等[28]結(jié)合磷酸化蛋白組和激酶組學(xué)的信息，通過反向遺傳學(xué)的方法驗(yàn)證了惡性瘧原蟲無性繁殖期蛋白磷酸化的重要作用。他們將IMAC法和二氧化鈦富集相結(jié)合，最終發(fā)現(xiàn)了存在于650個(gè)蟲體蛋白上的1 177個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些蛋白主要參與DNA合成、轉(zhuǎn)錄、代謝、免疫逃避以及細(xì)胞吸附等生物進(jìn)程。許多蟲體蛋白激酶能在自身的調(diào)節(jié)殘基上磷酸化，例如糖原合成激酶3和CDK-樣激酶3。其中CDK-樣激酶3第526位氨基酸的磷酸化對(duì)于該酶整體活性的發(fā)揮具有重要影響。該試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)36個(gè)寄生蟲蛋白激酶對(duì)于惡性瘧原蟲的無性繁殖階段具有重要作用。

Lasonder E等[29]利用二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對(duì)惡性瘧原蟲胞外的裂殖子進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組分析，試驗(yàn)共鑒定到1 765個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中有785個(gè)磷酸化位點(diǎn)在裂殖體中檢測(cè)不到。生物信息學(xué)分析顯示，這些差異的磷酸化蛋白主要與入侵過程有關(guān)。裂殖子磷酸化蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，119個(gè)蛋白具有與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及入侵相關(guān)的潛在作用，這些蛋白受到PKA、CDPK、PI3K及elF2激酶參與的翻譯過程的調(diào)節(jié)。這些磷酸化蛋白的差異可能是由于惡性瘧原蟲在從胞內(nèi)的裂殖體向胞外的裂殖子轉(zhuǎn)變過程中，蟲體不能通過降解血紅蛋白來獲得氨基酸而處于“饑餓”狀態(tài)造成的。

Tsigankov P等[30]利用二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對(duì)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體和前鞭毛體的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析鑒定，共鑒定到627種發(fā)生磷酸化修飾蛋白中的1 614個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸化模體“SF”在無鞭毛體中顯著富集，鑒定到的一些酪氨酸磷酸化蛋白主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路中。在鑒定到的磷酸化蛋白中，超過半數(shù)的蛋白具有期別特異性或者在無鞭毛體和前鞭毛體中是呈現(xiàn)顯著性差異的。

在日本血吸蟲磷酸化蛋白質(zhì)組的研究中，Luo R等[31]通過IMAC法對(duì)14 d童蟲和35 d的日本血吸蟲蟲體蛋白中的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化蛋白進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲體中的92種蛋白含有127個(gè)不同的磷酸化位點(diǎn)。將14 d童蟲和35 d的日本血吸蟲蟲體蛋白中的磷酸化肽段進(jìn)行比較分析后，在兩個(gè)階段蟲體中找到30種共有的磷酸化蛋白。這些蛋白包括一些信號(hào)分子和酶類，例如14-3-3蛋白、熱休克蛋白90、肽基脯氨酰異構(gòu)酶G、磷酸果糖激酶、胸苷酸激酶等。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)這些蛋白磷酸化位點(diǎn)的基序在生物進(jìn)化上是比較保守的。

Cheng G等[32]通過二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對(duì)日本血吸蟲14 d和35 d的雌雄蟲體內(nèi)的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析，一共鑒定到180個(gè)磷酸化肽段，代表了148個(gè)蛋白，進(jìn)一步的分析顯示，熱休克蛋白90在這兩個(gè)階段的蟲體和雌雄蟲體中都能檢測(cè)到，因此推測(cè)該蛋白能夠直接或間接的與其他檢測(cè)出的信號(hào)分子相互作用，并在調(diào)節(jié)蟲體的發(fā)育過程中具有重要作用。同時(shí)，對(duì)一些檢測(cè)到的性別特異性的磷酸化蛋白通過免疫組化或?qū)崟r(shí)定量PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。

通過之前的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲體內(nèi)同樣存在大量參與其生命活動(dòng)的磷酸化蛋白、肽段以及磷酸化位點(diǎn)，這些信息為我們深入研究蛋白的磷酸化修飾和寄生蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及調(diào)控機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

3 展望

蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程在生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的作用，使蛋白質(zhì)磷酸化的相關(guān)研究成為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的熱點(diǎn)。大量試驗(yàn)表明，一些關(guān)鍵蛋白或者重要氨基酸位點(diǎn)的磷酸化修飾或去磷酸化，或者蛋白激酶/磷酸酶的活性受到抑制/過表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)的磷酸化過程會(huì)發(fā)生紊亂并嚴(yán)重影響寄生蟲正常的生理狀態(tài)，如寄生蟲的入侵與逸出、自身信號(hào)通路的異常等。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的磷酸化修飾進(jìn)行深入的研究對(duì)了解寄生蟲磷酸化修飾蛋白在蟲體寄生和生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用具有重要意義，也可為篩選抗寄生蟲病的候選疫苗分子和新藥靶提供試驗(yàn)依據(jù)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)已成為一門新的交叉學(xué)科和研究熱點(diǎn)，它可以為我們提供大量可供深入分析研究的磷酸化、去磷酸化相關(guān)蛋白的數(shù)據(jù)。但前期研究在技術(shù)上還存在一定的局限性，例如蛋白質(zhì)的磷酸化是一個(gè)不穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)過程，磷酸化蛋白的豐度較低，其磷酸基團(tuán)容易在分離過程中丟失等。因此，對(duì)磷酸化蛋白特異、高效的分離、富集技術(shù)及無損、高靈敏度的檢測(cè)鑒定技術(shù)的開發(fā)會(huì)推動(dòng)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)展。

近年來，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入定量磷酸化蛋白質(zhì)組和比較磷酸化蛋白質(zhì)組分析階段。其不僅能檢測(cè)磷酸化蛋白及其位點(diǎn)，還能對(duì)磷酸化蛋白的差異進(jìn)行定量分析，進(jìn)而可以找到可能是生物體處于不同狀態(tài)的關(guān)鍵磷酸化蛋白分子或磷酸化位點(diǎn)，經(jīng)定量分析后得到的差異磷酸化蛋白或磷酸化位點(diǎn)可能是造成生物體處于不同狀態(tài)的重要分子，目前已經(jīng)有學(xué)者開始采用該技術(shù)方法開展相關(guān)研究。

目前定量的磷酸化蛋白組分析策略可以依賴穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)氨基酸的穩(wěn)定同位素進(jìn)行標(biāo)記(stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SILAC)。該技術(shù)將含有輕、重同位素型的氨基酸培養(yǎng)液分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白被同位素穩(wěn)定標(biāo)記，提取細(xì)胞蛋白并將其等量混合，酶切后結(jié)合磷酸化肽段的富集技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，通過分析不同同位素標(biāo)記的磷酸化肽段的相對(duì)量而確定磷酸化蛋白的相對(duì)量。此外，美國(guó)ABI公司開發(fā)了一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)——同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。iTRAQ試劑由報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)標(biāo)記試劑基團(tuán)組成，形成4種或8種相對(duì)分子質(zhì)量均為145的等量異位標(biāo)簽，與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，帶不同同位素標(biāo)簽的同一多肽產(chǎn)生質(zhì)量不同的報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的豐度進(jìn)行不同樣品間相同肽段的定量。

隨著定量磷酸化蛋白質(zhì)組的出現(xiàn)，許多科學(xué)家開始嘗試?yán)蒙鲜龇椒▉韺ふ矣绊懮矬w的關(guān)鍵磷酸化蛋白。

Kruger M等[33]利用SILAC的方法對(duì)胰島素信號(hào)通路中所有酪氨酸磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的變化情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了40個(gè)胰島素誘導(dǎo)的效應(yīng)因子及胰島素信號(hào)通路中的7個(gè)新蛋白，揭示了胰島素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)磷酸化等翻譯后修飾和下游靶蛋白的改變與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化之間的關(guān)系3。Rinschen M M等[34]通過SILAC對(duì)腎集合管細(xì)胞中的磷酸化蛋白組的差異進(jìn)行了比較分析，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加壓素能夠降低JNK1/2和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化作用，而這兩種蛋白的磷酸化又都可以進(jìn)一步調(diào)控水通道蛋白-2第261位氨基酸的磷酸化，因此證明加壓素是通過降低該位點(diǎn)的磷酸化作用而發(fā)揮作用的。Chen C等[35]通過SILAC法對(duì)不同細(xì)菌毒力因子誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組的差異進(jìn)行了相關(guān)研究。生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示，兩者的差異主要體現(xiàn)在與免疫相關(guān)的信號(hào)通路中，包括Erk1/2信號(hào)通路、，Jak/Stat信號(hào)通路、Jnk信號(hào)通路等。Batista M等[36]在研究中發(fā)現(xiàn)，布氏錐蟲有絲分裂原活化蛋白激酶樣激酶(MAPKLK1)對(duì)蟲體的增殖具有重要作用，如果利用RNA干擾技術(shù)對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行敲除，蟲體的生長(zhǎng)會(huì)明顯減慢。鑒于該蛋白可能在蟲體蛋白的磷酸化過程中發(fā)揮著重要作用，作者利用二氧化鈦富集磷酸化肽段的方法并結(jié)合SILAC對(duì)干擾前后蟲體磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，一共鑒定到1 756個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中384個(gè)之前沒有報(bào)道。雖然該蛋白對(duì)蟲體具有重要作用，但是在磷酸化蛋白及位點(diǎn)上并沒有發(fā)現(xiàn)太大差異。

迄今為止，寄生蟲磷酸化蛋白組學(xué)上的研究大都還是從整體上分析蟲體中磷酸化蛋白、肽段及其磷酸化位點(diǎn)，而通過比較磷酸化蛋白組的方法尋找影響蟲體的關(guān)鍵磷酸化蛋白研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，相信在不久的將來這一方法會(huì)在寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

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ProgressonProteinPhosphorylationandPhosphoproteomicsofParasites

ZHAO Bin1, TANG Ya-lan2, LU Ke2, CAO Xiao-dan2, HAN Qian2, Lü Chao2, WANG Tao2, FU Zhi-qiang2, LIN Jiao-jiao2,3, HONG Yang2

(1.JiangsuVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Jurong,Jiangsu,212400,China;2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai,200241,China;3.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

Protein phosphorylation is one of the most important and widespread post-translational modifications in many cellular processes.Some key regulatory functions such as phospho-signalling cascades are regulated via protein phosphorylation/dephosphorylation in a complex and dynamic manner.The research progresses of protein phosphorylation and its applications in parasitology were reviewed,and the prospect of this study was also discussed in this paper.

phosphorylation;parasite;phosphoproteomics

2017-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31402192)

趙 彬(1982-)，男，黑龍江人，講師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*

S852.7;S852.33

A

1007-5038(2017)10-0092-06