乙肝病毒蛋白和基因在肝內和肝外膽管癌組織中的檢測及意義

吳旖琦 劉 穎 趙 麗 金曉明

乙肝病毒蛋白和基因在肝內和肝外膽管癌組織中的檢測及意義

吳旖琦1劉 穎2趙 麗3金曉明1

目的研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染與膽管癌(Cholangiocarcinoma，CC)的關系，并明確其與肝內膽管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)發(fā)生的關系。方法 采用免疫組化、巢式PCR對52例CC(21例肝內膽管癌和31例肝外膽管癌)石蠟包埋組織進行HBV相關蛋白及基因的檢測。結果 21例ICC組織中HBsAg陽性表達率為23.8%(5/21)，HBcAg陽性表達率為19.0%(4/21)，HBV X 基因檢出率為33.3%(7/21)。在31例ECC組織中均未檢出HBsAg、HBcAg及HBV X基因。結論 HBV感染與ICC發(fā)生關系密切，但可能非ECC發(fā)生的危險因素。HBV X基因的整合可能參與肝內膽管上皮細胞的癌變過程。

膽管癌；乙型肝炎病毒；肝內膽管癌；肝外膽管癌

膽管癌(Cholangiocarcinoma，CC)是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，根據其在肝內發(fā)生的部位不同可以分為肝內膽管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和肝外膽管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)[1]。ICC和ECC在流行病學、臨床表現及治療等方面均存在差異[2-3]。既往研究認為CC的發(fā)生與原發(fā)性硬化性膽管炎、肝吸蟲病、肝內膽管結石等相關[4-5]。最近國內外相繼有報道指出乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染也是ICC發(fā)生的危險因素[6-8]，但其是否與ECC發(fā)生相關的研究卻很少。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，HBV作為肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生的危險因素已得到廣泛認可。然而，HBV感染是否與ICC、ECC發(fā)生相關，其可能的機制如何，尚未得到深入研究。本研究通過檢測肝內外膽管癌組織中HBV蛋白及基因，明確HBV感染與ICC和ECC發(fā)生的關系以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 52例CC(21例ICC和31例ECC)組織標本，為哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院及黑龍江省醫(yī)院2002—2008年間行手術切除的標本。臨床資料顯示52例CC患者中，男性31例，女性21例，平均年齡57.59歲。血清HBsAg陽性者16例(ICC為11例，占68.8%；ECC為5例，占31.3%，其中1例伴HBV和HCV的混合感染)，HBsAg陰性者36例。全部標本均經病理檢查證實。腫瘤位置：肝內21例(5例為HCC和ICC的混合型)，肝外31例；隨機選取同期住院的非肝病患者49例作為對照組進行臨床資料分析。

1.1.2 主要實驗試劑 鼠抗HBsAg單克隆抗體、兔抗HBcAg多克隆抗體及S-P免疫組化二抗試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司；PCR擴增試劑盒購自TAKARA公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HBsAg及HBcAg蛋白的檢測 52例CC標本常規(guī)切成4～5 μm厚石蠟切片，采用免疫組織化學SP法檢測HBsAg及HBcAg蛋白的表達，檢測方法按試劑盒說明操作，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，微波抗原修復；山羊血清封閉后，滴加一抗(HBsAg 1∶100稀釋，HBcAg 1∶50稀釋)4℃ 16 h；滴加二抗室溫30 min后，滴加過氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封固。

免疫組化檢測結果判定：陽性表達位于細胞核或/和細胞漿呈棕黃色顆粒狀。無棕黃色顆粒為陰性。

1.2.2 石蠟包埋組織HBV DNA 提取 52例CC組織無菌操作常規(guī)切片，切取10 μm厚切片，每2～4片放入一個1.5 mL滅菌EP管中。使用TAKARA公司DNA提取試劑盒，方法參照操作說明進行。滴加0.57 mL DEXPAT到裝有石蠟包埋組織的EP管，100℃加熱處理10 min。加熱后立即12 000 r/min，4℃離心10 min。移液器吸取水層。吸取的水層直接作為PCR反應模板。

1.2.3 巢式PCR擴增HBV X基因 HBV X基因PCR引物：外套上游引物W1：5′-TGCCAACTGGATCCT TCGCGGGACGTCCTT-3′；外套下游引物W2：5′-GTTCACGGTGGT CTCCATG-3′；內套上游引物N1：5′-GTCCCCTTCTTCATCTGCCGT-3′；內套下游引物N2：5′-ACGTGCAGAGGTGAAGCGAAG-3′。預計內套引物擴增片段為233 bp。引物由上海生工公司合成。第一輪PCR反應體系：去離子水34.75 μL、PCR反應緩沖液5 μL、dNTPs 4 μL、DNA模板5 μL、外引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL。反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸25 s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。取第一輪產物2 μL作模板，用內套引物進行第二輪擴增，反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性20 s，58℃退火30 s、72℃延伸25 s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結果。預計內套引物擴增片段為117 bp。PCR對照組：陽性對照選取已證實的HBV X基因為陽性的肝炎組織。選取血清HBV標志物檢測結果均為陰性的11例肝臟組織作為陰性對照。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，所有數據都是以率(%)的方式表示。兩組間的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CC組與對照組的臨床資料和危險因素分析

52例CC組和49例對照組的臨床資料分析結果顯示，CC組HBsAg血清學陽性病例為16例(30.8%)，對照組為2例(4.1%)，CC組高于對照組，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表1)。兩組間在年齡、性別、病史(肝硬化、肝吸蟲及慢性膽囊炎)方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 CC組織中HBsAg、HBcAg的免疫組化檢測

免疫組化結果顯示，52例CC中，有5例ICC組織HBsAg陽性表達，其中4例同時伴有HBcAg陽性表達。HBsAg陽性表達位于胞漿，呈棕黃色顆粒。HBcAg陽性表達主要位于胞核，胞漿僅有少量表達(圖1)。

2.3 CC組織中HBV X基因的檢測

巢式PCR檢測結果顯示，52例CC組織中HBV X基因檢出率為13.5%(7/52)，且均為ICC。X基因第一輪擴增產物為233 bp；第二輪擴增產物在117 bp處可見陽性條帶(圖2)。31例肝外膽管癌及11例陰性對照肝組織均未檢出HBV X 基因。

表1 CC組與對照組臨床資料和危險因素的比較Table 1 Comparison of the clinical data and risk factors between CC and control cases

圖1 免疫組織化學檢測CC組織中HBsAg、HBcAg表達Figure 1 Immunohistochemistry assay for HBs antigens，HBc antigens in CC tissues

圖2 巢式PCR檢測膽管癌組織中HBV X基因Figure 2 Nested-PCR detected HBV X gene in CC tissues

2.4 ICC與ECC臨床資料及HBV X基因和蛋白檢測結果的比較

21例ICC中，血清學和組織中HBsAg檢測陽性分別為11例和5例，HBV X基因檢測陽性為7例；31例ECC中，HBsAg血清學陽性有5例，組織中HBV蛋白和基因的檢測均為陰性，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表2)。ICC組和ECC組在性別、年齡和病史(肝吸蟲病史，慢性膽囊炎病史、肝硬化)方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 肝內膽管癌和肝外膽管癌HBV感染和危險因素的比較Table 2 Comparison of HBV infection and risk factors between ICC and ECC

3 討論

目前研究認為，CC的發(fā)生與原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性膽石病、肝吸蟲病密切相關，但是，大部分CC的發(fā)生卻缺乏上述危險因素[9-10]。近年來，國內外相繼有研究表明，HBV和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染也與CC的發(fā)生關系密切[11-14]。日本的一項研究顯示，600名HCV相關性肝硬化患者中，有2.3%的人可在7年后發(fā)展為膽管癌[15]。意大利Donato等的研究顯示，HCV感染為ICC發(fā)生的危險因素，而HBV感染與ICC發(fā)生無相關性[16]。而美國的一項Meta分析結果表明，HBV感染是ICC發(fā)生的獨立危險因素[17]。Peng等中國學者的研究認為HBV與ICC的發(fā)生密切相關[18]。在本研究中，52例CC患者中血清學HBsAg陽性有16例(30.8%)，而HCV陽性僅有1例(1.5%)，且同時合并HBV感染，提示HBV而非HCV與CC的發(fā)生密切相關。我國是HBV的高流行地域，而HCV的流行率則相對較低。因此，造成上述研究結果的不一致可能與不同國家肝炎病毒流行類型的差異有關。

為了進一步證實HBV的感染是否與ICC和ECC的發(fā)生都有關系，我們分別對21例ICC和31例ECC組織采用免疫組化和巢式PCR方法進行HBV蛋白及X基因的檢測。免疫組化檢測結果發(fā)現，21例ICC組織中有4例HBsAg、HBcAg蛋白均為陽性表達，1例僅HBsAg蛋白表達陽性；然而在31例ECC組織中則無此兩種蛋白的表達?；驒z測結果顯示，21例ICC有7例檢出HBV X 基因，而31例ECC組織未檢出X基因。上述結果證實，ICC組織中確實有HBV蛋白及基因的表達，這與Perumal等一些學者的研究結果一致[19-20]。而在ECC組織中既無HBV蛋白又無X基因的表達，這說明HBV感染可能是ICC發(fā)生的危險因素。由于膽管上皮細胞與肝細胞在胚胎發(fā)生上有同源性[21]，肝內膽管癌細胞無論從形態(tài)學以及免疫組化特征上均與肝干細胞相類似[22]。因此現在普遍認為HBV與ICC的發(fā)生可能與其致肝細胞癌的機制相似。本研究中，在ICC組織中檢測到HBV蛋白和X基因的表達，表明持續(xù)的HBV感染引起膽管上皮炎癥過程可能最終導致ICC的發(fā)生。此外，HBV X蛋白在體內外都可抑制p53 基因介導的細胞凋亡，它還可使原癌基因激活[23]；HBV X基因還可通過順式激活hTERT 的mRNA引起膽道上皮細胞的增殖、分化和癌變[24]。上述機制可能都在HBV感染導致ICC發(fā)生過程中發(fā)揮作用。

本研究中，有6例血清學陽性膽CC組織中未檢測到HBV蛋白，4例未檢測出HBV X基因，這種HBV表達在血清學和組織中檢測結果不一致的原因一方面可能由于HBV蛋白和基因在肝內分布較局限，而手術切除標本有限，未能取到具有代表性的組織；另一方面可能因為肝臟體積較大，即使每個肝細胞分泌極少量病毒顆粒也能引起持續(xù)的毒血癥，但是組織中HBV蛋白的表達量很少，因而出現血清學HBV蛋白檢測結果陽性而組織中蛋白表達為陰性。此外，7例HBV DNA陽性ICC中有2例血清學HBsAg檢測為陰性，這部分患者可能為HBV隱匿性感染，即HBsAg的檢測為陰性，但肝臟組織中HBV DNA陽性的個體[25]。上述HBV表達在血清學和組織中檢測結果不一致的具體機制仍需進一步研究證實。

通過對HBV DNA陽性ICC患者臨床資料進行分析發(fā)現，7例ICC患者除2例有肝硬化病史，1例有吸煙飲酒史及1例有肝吸蟲病史外，其余3例均無其他疾病史，進一步說明HBV感染可能是ICC發(fā)生的獨立危險因素。

綜上所述，本研究發(fā)現HBV感染與ICC的發(fā)生密切相關，而與ECC無相關性，HBV感染可能是ICC發(fā)生的獨立危險因素。但是，由于本研究樣本數量有限，HBV感染與ICC發(fā)生的關系仍有待更進一步研究證實。面對CC的高死亡率，需要更深入的研究HBV感染在ICC發(fā)生發(fā)展過程中的作用。也許有效控制HBV感染能從根本上預防CC的發(fā)生。

1 Sempoux C，Jibara G，Ward SC，et al.Intrahepatic cholangiocarcinoma：new insights in pathology[J].Semin Liver Dis，2011，31(1)：49-60.

2 Khan SA，Thomas HC，Davidson BR，et al.Cholangiocarcinoma[J].Lancet，2005，366(9493)：1303-1314.

3 Lazaridis KN，Gores GJ.Cholangiocarcinoma[J].Gastroenterology，2005，128(6)：1655-1667.

4 Khan SA，Davidson BR，Goldin RD，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma：an update[J].Gut，2012，61(12)：1657-1669.

5 Tyson GL，El-Serag HB.Risk factors for cholangiocarcinoma[J].Hepatology，2011，54(1)：173-184.

6 Tanaka M，Tanaka H，Tsukuma H，et al.Risk factors for intrahepatic cholangiocarcinoma：a possible role of hepatitis B virus[J].J Viral Hepat，2010，17(10)：742-748.

7 Palmer WC，Patel T.Are common factors involved in the pathogenesis of primary liver cancers? A meta-analysis of risk factors for intrahepatic cholangiocarcinoma[J].J Hepatol，2012，57(1)：69-76.

8 Ralphs S，Khan SA.The role of the hepatitis viruses in cholangiocarcinoma[J].J Viral Hepat，2013，20(5)：297-305.

9 Shaib YH，El-Serag HB，Davila JA，et al.Risk factors of intrahepatic cholangiocarcinoma in the United States：a case control study[J].Gastroenterology，2005，128(3)：620-626.

10 Khan SA，Emadossadaty S，Ladep NG，et al.Rising trends in cholangiocarcinoma：is the ICD classification system misleading us?[J].J Hepatol，2012，56(4)：848-854.

11 Chaiteerakij R，Yang JD，Harmsen WS，et al.Risk factors for intrahepatic cholangiocarcinoma：association between metformin use and reduced cancer risk[J].Hepatology，2013，57(2)：648-655.

12 Matsumoto K，Onoyama T，Kawata S，et al.Hepatitis B and C virus infection is a risk factor for the development of cholangiocarcinoma[J].Intern Med，2014，53(7)：651-654.

13 Wu ZF，Yang N，Li DY，et al.Characteristics of intrahepatic cholangiocarcinoma in patients with hepatitis B virus infection：clinicopathologic study of resected tumours[J].J Viral Hepat，2013，20(5)：306-310.

14 Zhou HB，Wang H，Li YQ，et al.Hepatitis B virus infection：a favorable prognostic factor for intrahepatic cholangiocarcinoma after resection[J].World J Gastroenterol，2011，17(10)：1292-1303.

15 Kobayashi M，Ikeda K，Saitoh S，et al.Incidence of primary cholangiocellular carcinoma of the liver in Japanese patients with hepatitis C virus-related cirrhosis[J].Cancer，2000，88(11)：2471-2477.

16 Donato F，Gelatti U，Tagger A，et al.Intrahepatic cholangiocarcinoma and hepatitis C and B virus infection，alcohol intake，and hepatolithiasis：a case-control study in Italy[J].Cancer Causes Control，2001，12(10)：959-964.

17 Palmer WC，Patel T.Are common factors involved in the pathogenesis of primary liver cancers? A meta-analysis of risk factors for intrahepatic cholangiocarcinoma[J].J Hepatol，2012，57(1)：69-76.

18 Peng NF，Li LQ，Qin X，et al.Evaluation of risk factors and clinicopathologic features for intrahepatic cholangiocarcinoma in Southern China：a possible role of hepatitis B virus[J].Ann Surg Oncol，2011，18(5)：1258-1266.

19 Perumal V，Wang J，Thuluvath P，et al.Hepatitis C and hepatitis B nucleic acids are present in intrahepatic cholangiocarcinomas from the United States[J].Hum Pathol，2006，37(9)：1211-1216.

20 Zhou YM，Cao L，Li B，et al.Expression of HBx protein in hepatitis B virus-infected intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2012，11(5)：532-535.

21 Komuta M，Govaere O，Vandecaveye V，et al.Histological diversity in cholangiocellular carcinoma reflects the different cholangiocyte phenotypes[J].Hepatology，2012，55(6)：1876-1888.

22 Theise ND，Yao JL，Harada K，et al.Hepatic ′stem cell′ malignancies in adults：four cases[J].Histopathology，2003，43(3)：263-271.

23 Gouasda V，Ortizcuar S.TP53R249S mutation，genetic variations in HBX and risk of hepatocellular carcinoma in The Gambia[J].Carcinogenesis，2012，33(6)：1219-1224.

24 Qu ZL，Zou SQ，Cui NQ，et al.Upregulation of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression by in vitro transfection of hepatitis B virus X gene into human hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma cells[J].World J Gastroenterol，2005，11(36)：5627-5632.

25 Assar S，Arababadi MK，Ahmadabadi BN，et al.Occult hepatitis B virus(HBV)infection：a global challenge for medicine[J].Chin Lab，2012，58(11/12)：1225-1230.

(收稿：2016-09-19)

Detection of hepatitis B virus protein and gene in intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma tissue

WUYiqi1，LUIYing2，ZHAOLi3，JINXiaoming1

1.Department of Pathology，Basic Medical Science College，Harbin Medical University，Harbin 150081，China；2.Department of Burn，Heilongjiang Province Hospital；3.Intensive Medicine，Harbin Children′s Hospital

Objective To investigate the importance of hepatitis B virus(HBV)infection in the pathogenesis of cholangiocarcinoma(CC)and further clarify the correlation between the occurrence of intrahepatic and extrahepatic cholangiocarcinoma.Methods HBV protein and gene of 52 formalin fixed，paraffin embedded tissues with CC were detected by immunohistochemistry and nest PCR.Results Hepatitis B virus X gene was detectable in 33.3%(7/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.Hepatitis B surface antigen(HBsAg)was detectable in 21.7%(5/21)and hepatitis B core antigen(HBcAg)was detectable in 19.0%(4/21)of 21 intrahepatic cholangiocarcinoma cases.In contrast，no HBsAg，HBcAg and hepatitis B virus X gene were detected in any of the 31 extrahepatic cholangiocarcinoma cases.Conclusion HBV infection is a significant risk factor for intrahepatic cholangiocarcinoma，but not for extrahepatic cholangiocarcinoma，in Northeast of China.The integration of HBV gene may be involved in the carcinogenesis of intrahepatic bile duct epithelial cells.

Cholangiocarcinoma；Hepatitis B virus；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Extrahepatic cholangiocarcinoma

黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目(12541361)

1.哈爾濱醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室(哈爾濱 150081)；2.黑龍江省醫(yī)院燒傷科；3.哈爾濱市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學科

吳旖琦，女，(1977-)，博士，副教授，從事消化系統(tǒng)腫瘤的研究。

金曉明，E-mail：jinxm55@163.com

R730.43

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.002