植物病毒檢測及脫毒方法的研究進展

遲惠榮 毛碧增

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院，杭州 310058）

技術與方法

植物病毒檢測及脫毒方法的研究進展

遲惠榮 毛碧增

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院，杭州 310058）

病毒是人們所知的自然界最小的生物之一，其形態(tài)大小要借助電鏡放大到幾萬甚至幾十萬倍才能觀察得到。病毒具有嚴格的寄生性，必須在宿主細胞內(nèi)才能生長繁殖。植物病毒是病毒科的一個重要組成部分，這一類病原物所引起的病害正逐年加重，影響了植物的生長和發(fā)育，降低了產(chǎn)量和品質。因病毒種類多，危害機制復雜，所以病毒病的防治也存在一定的困難。闡述了植物病毒的檢測方法，詳述了脫毒的技術方法及其近幾年的應用情況，討論了在脫毒過程中要注意的問題，并對今后的研究方向進行展望，以期為相關研究提供一些參考和理論依據(jù)。

植物病毒；檢測技術；脫毒方法

自1892年發(fā)現(xiàn)第一種植物病毒病——煙草花葉?。?］，至今已報道了 600 種以上的病毒種類［2］。植物病毒病給世界各地帶來重大經(jīng)濟損失，據(jù)統(tǒng)計，全世界僅糧食作物每年因病毒病導致的損失高達200億美元，經(jīng)濟作物因病毒病造成的損失，每年高達600億美元［3］。常見的病毒有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）［4］。植物病毒分布廣、繁殖快、防治難，有植物“癌癥”之稱。病毒可通過螨類、線蟲［5］和真菌［6］等介體傳染和嫁接、汁液等無介體傳染，尤其是近年來由褐飛虱（Nilaparvata lugens）傳播的水稻矮縮病毒（Rice dwarf virus，RDV）［7，8］和由煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播的TYLCV［9］危害更為嚴重。病毒侵入寄主植物，在寄主細胞內(nèi)完成自我復制后轉運其他組織，最后使整株植物發(fā)病。病毒在植物體內(nèi)主要有兩個轉運途徑：通過胞間連絲在相鄰細胞間的短距離胞間運動（Cell-to-cell movement）和通過維管束組織的長距離轉運（Long-distacne systemic transport）［10］。病毒能破壞細胞的代謝活動，引起植物的生理變化，常常表現(xiàn)出變色、壞死、畸形、皺縮、蕨葉、曲葉、卷葉、縮節(jié)、不孕、植株矮小、節(jié)間短、密集和果實畸形等，嚴重時可影響植物的生長和發(fā)育，降低作物的產(chǎn)量和質量，甚至使植物死亡。在大田作物、十字花科植物、茄科植物和果樹上發(fā)生的病毒病逐年加重，并且有多種病毒復合侵染的現(xiàn)象。尤其對于百合、藏紅花［11，12］、草莓、甘薯及菊花［13，14］等無性繁殖的植物來說，植株體內(nèi)病毒隨著栽培時間的延長而不斷積累，導致品種退化、品質下降，嚴重影響經(jīng)濟效益。病毒病危害巨大，病毒的分離、鑒定及高效檢測尤為重要。本文總結了植物病毒的檢測方法、脫毒方法，認為傳統(tǒng)的檢測技術與當前的分子生物學技術結合能有效的檢測病毒種類，種苗脫毒體系的建立是推廣健康優(yōu)質種苗行之有效的方法。

1 植物病毒病檢測方法

1.1 生物學檢測方法

生物學檢測方法是根據(jù)寄主植物受病毒侵染后所產(chǎn)生的特異性癥狀來鑒定病毒病的一種方法［15］。指示植物主要有兩種：草本指示植物和木本指示植物。草本指示植物主要有藜科、茄科、豆科及葫蘆科，通常情況下采用汁液摩擦接種法［16］。吳凌娟等［17］用指示植物千日紅（Gomphrena globosa）、心葉煙（Nicotiana glutinosa）等鑒定PVX；李春敏［18］用黃瓜為指示植物鑒定核果壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）。木本指示植物有GF305桃苗、白普賢櫻花［18］，使用最多的是雙重芽接法［19］，蘋果潛隱病毒的常規(guī)檢測主要是木本指示植物檢測法［20］。在接種病毒時選擇健壯的指示植物，接種過程在防蟲網(wǎng)下進行。該法受檢測速度較慢，靈敏度較低，季節(jié)限制等因素影響，應用局限性較大。

1.2 電子顯微觀察法

1939年Kausche等［21］首次用電子顯微鏡觀察到了煙草花葉病毒的長形病毒粒子，開啟了植物病毒病研究的序幕。電子顯微觀察是直接通過掃描電鏡、透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)結構以及病毒侵染寄主所引起的細胞顯微結構的變化，檢測方便、快速。觀察病毒常用到的方法是負染色電鏡法、超薄切片法。韋石泉等［22］用負染色技術電鏡觀察，結果表明可檢測出線條狀和桿狀病毒，如蕪菁花葉病毒（TuMV）較為有效，但檢測球形和短桿狀病毒，如CMV甚為困難。謝禮等［23］選取病葉做超薄切片電鏡觀察，結果發(fā)現(xiàn)蠶豆葉肉細胞產(chǎn)生嚴重病理變化，病變細胞線粒體增生和聚集，形狀畸變，體積增大。不過近些年來建立了免疫吸附和修飾、免疫膠體金標記［24］、圖像分析等一整套病毒電鏡檢測研究方法，將免疫電鏡新技術應用于檢測蔬菜、花卉等作物的病毒病，首次報道了番茄花葉病毒（ToMV）的細胞病理學、葡萄扇葉病毒（GFLV）的細胞病理學［25］，以及運動蛋白細胞定位和TuMV破壞光合作用的機制［26］。

1.3 血清學方法

血清學方法現(xiàn)在被廣泛應用于植物病毒的檢測上，該法的原理是將抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用結合起來。血清學方法主要有沉淀反應、瓊膠擴散法、凝集反應、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、斑點免疫結合法等。其中酶聯(lián)免疫吸附法最早是由Clark和Adnm于1977年提出的，現(xiàn)在已廣泛應用到了各個領域，可檢測豆類植物上TMV、大豆花葉病毒（SMV）、CMV、苜蓿花葉病毒（AMV）4種不同形態(tài)、不同分類組群的病毒［27］。ELISA可以檢驗出單粒種子中攜帶的病毒，且能靈敏檢驗出種子不同部位如大豆的種皮、種胚、胚乳及胚根中的病毒。1982年，Hawkes等建立了點免疫結合測試技術（Dot immunobinding assay，DIA），用硝酸纖維素膜代替酶標板，使檢測更為簡便、快速、經(jīng)濟［28］。1985年，Hibi等［29］利用這種方法檢測TMV獲得了較為理想的結果。此后DIA進一步改良，發(fā)展了直接法、間接法及雙抗體夾心法等檢測方法，目前廣泛應用于TuMv、SMV、CMV［28］、斑豆花葉病毒（CpMV）、芋花葉病毒（DMV）、柑桔速衰病毒（CTV）［30］和TYLCV［31］等病毒的檢測。血清學檢測具有靈敏、快速、特異性強、分析率高、花費少等優(yōu)點，但對一些病毒含量低和含有干擾測定物質的樣品則不能做出準確的測定，容易出現(xiàn)假陽性的結果。同時也有一些病毒不能用血清學檢測，血清學檢測病毒是以病毒的外殼蛋白的抗原性進行檢測的，而類病毒沒有外殼蛋白，還有一些病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白，因此不能用血清學方法檢測［32］。

1.4 分子生物學檢測

通過分子生物學技術檢測樣品中是否有病原微生物的核酸，從而可以特異地判定采集樣品中是否有相應的病原微生物。常用的分子生物學診斷技術包括基因組電泳分析、DNA酶切圖譜分析、寡核苷酸指紋圖、核酸雜交、聚合酶鏈式反應。其中核酸雜交和PCR技術以特異、快速、敏感的優(yōu)點適用于樣品的檢測中，是當前應用較廣泛的技術。在果樹上，RT-PCR 已被用來檢測李痘病毒（PPV）、櫻桃壞死銹斑駁病毒（CNRMV）、櫻桃病毒A（CVA）［33］、蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）［34］和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）［35］等。高雅紅等［36］建立了PPV的熒光定量 RT-PCR 檢測方法。在RTPCR的基礎上衍生出一些新的技術如基因芯片、巢式RT-PCR、半巢式RT-PCR等。此外，陳定虎等［37］采用RT-PCR方法結合納米磁珠技術來檢測PPV，結果表明該技術不僅能夠檢測到極低濃度的病毒，而且操作簡單快速。逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技 術（Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）作為近幾年新發(fā)展的擴增方法，將反轉錄與核酸擴增同時進行，而且采用恒溫擴增的方法，不僅省去了反轉錄的時間，更縮短了核酸擴增所用時間，具有檢測速度快、靈敏度高及不需要昂貴的循環(huán)擴增儀器等優(yōu)點，應用于多種動物病毒［38］和植物病毒的檢測，張雯娜等［39］利用該技術快速檢測SMV，丁小蘭等［40］建立了馬鈴薯帚頂病毒（PMTV）的 RT-LAMP 檢測方法。從核酸的水平來檢測病毒比血清學方法靈敏度更高，特異性更強，檢測病毒的范圍更廣，可以克服血清學檢測法和其他檢測方法中的一些缺點，可以進行大批量的樣本檢測［32］。但是，對不同的寄主植物、不同的病毒種或株系（分離物），各種方法的檢測靈敏度各不相同，需在多次實驗過程中找到最佳的方法。

2 脫除植物病毒的方法

2.1 莖尖組織培養(yǎng)脫毒法

莖尖培養(yǎng)脫毒是利用病毒在植物組織內(nèi)分布不均勻的特點，在植物生長、分裂最為旺盛的地方，其含有的病毒顆粒相對較少，又因為病毒在植物體內(nèi)隨維管系統(tǒng)遷移，在莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng)，病毒通過胞間連絲傳遞比較慢，而細胞分裂速度快，所以莖尖生長點部位幾乎沒有病毒，并且植物分生組織內(nèi)含有較高的內(nèi)源激素，可能對病毒的復制起到抑制作用。因此，可選用莖尖作為脫毒培養(yǎng)的材料。1952年法國的Morel等［41］將帶病毒的大麗菊莖尖切離培養(yǎng)，獲得脫毒植株。1962年Belkengren 和 Miller［42］首先用組織培養(yǎng)的方法獲得了草莓無病毒苗，毛碧增等［43］采用“多重分步法”脫毒方法獲得了草莓脫毒苗，并建立了脫毒種苗的繁育體系，通過剝?nèi)?.5 mm的草莓苗莖尖，脫毒率可達到100%，脫毒原種苗繁殖系數(shù)為1∶375，抗病性提高，田間生長旺，增產(chǎn)顯著。高慧卿等［44］對初代培養(yǎng)的百合無菌苗進行莖尖脫毒實驗結果表明，CMV的脫毒率可達到82.29%。Kawarabayashi等［45］利用莖尖脫毒法獲取無LSV、CMV的植株和種球，有效的消除了病毒危害的現(xiàn)象，促進百合生長。平培元等［46］報道了利用莖尖脫毒方法獲得了杭白菊無毒苗的再生植株。同時，剝離莖尖的大小已成為脫毒是否成功的關鍵所在。切取莖尖的長度原則上是0.1-1 mm，若莖尖長度過小則不易成活，過大脫毒效果不好。何歡樂等［47］相關分析結果表明，在相同的培養(yǎng)基上，莖尖越小成活率越低，莖尖越大成活率越高，大小為0.2 mm的莖尖成活率為16.67%，電鏡下未檢測到病毒粒子；大小為1 mm的莖尖成活率為83.33%，電鏡下檢測到7個病毒粒子，試管苗出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。劉輝輝［14］選取0.3-0.5 mm杭白菊莖尖接種到適宜培養(yǎng)培養(yǎng)基中，結果發(fā)現(xiàn)脫毒的杭白菊的株高、莖粗、有效花朵數(shù)、分支數(shù)等性狀與未脫毒的杭白菊存在顯著差異。何新民等［48］研究表明，以‘紅姑娘2號’甘薯為材料，當剝?nèi)〉那o尖為0.3-0.5 mm時，脫毒率為100%；莖尖為0.6-0.8 mm時，脫毒率為93.3%。莖尖脫毒實驗中剝?nèi)〉那o尖大小也與病毒種類有關，馬鈴薯S病毒（PVS）和PVX病毒離生長點很近，莖尖剝?nèi)￠L度須在 0.2 mm 以下，PVY離生長點較遠，莖尖可切取 0.3-0.5 mm，通過剝?nèi)『线m的莖尖長度對提高脫毒效果有明顯作用。

不同材料的莖尖剝?nèi)∨c脫毒率有關，黃遠新等［49］對帶有甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）的‘渝薯2號’進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)切取葉原基處于突起態(tài)、半閉合態(tài)和閉合態(tài)0.22-0.35 mm大小的莖尖時，最終的脫毒效果差異顯著，獲得脫毒率分別為100%，83.9%和71.9%。趙軍良［50］發(fā)現(xiàn)選取0.2-0.5 mm帶有一個葉原基的莖尖，脫毒效果最好，成活率也最高，經(jīng)在田間用指示植物初步檢測得知，脫毒率達到95%以上。病毒的復合侵染也會影響脫毒效果，單一病毒侵染植株，采用莖尖組織培養(yǎng)法較容易獲得無毒的組培苗，若兩種或兩種以上的病毒復合侵染植株時，只采用莖尖脫毒法無法得到完全脫毒的組培苗。莖尖培養(yǎng)的過程中，會出現(xiàn)褐化、玻璃化、外植體污染等問題，選擇適宜的消毒時間、適宜的培養(yǎng)基都是獲得脫毒苗的關鍵。

2.2 熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒法

熱處理脫毒法是利用高溫可使蛋白質變性，從而使病毒鈍化的原理。熱處理的材料可以是已經(jīng)長芽的莖塊，也可以是組培瓶中長到約1 cm的小植株［51］，將其在一定的溫度下進行培養(yǎng)，使植株在此溫度下的生長速度快于病毒的復制速度，切取不含有病毒的莖尖接種到適宜的培養(yǎng)基中，最終獲得脫毒苗。熱處理時的溫度及處理時間的長短都應慎重選擇，時間過長，會殺死芽眼，還可能對植物組織造成不良影響；時間過短達不到預期的脫毒效果，且熱處理的溫度和時間要基于不同病毒的鈍化（致死）溫度，TSWV致死最低溫度為45℃，而TMV鈍化溫度超過90℃，大多數(shù)植物病毒的鈍化溫度在55-70℃之間［3］。唐菖蒲莖尖組織于42℃處理5 d，脫除病毒的效果最佳［52］。37℃恒溫熱處理30 d后ACLSV的脫除率為100%［53］。Previati等［54］用熱處理方法（20-30℃處理12 d或者在30℃處理18 d）去除菊花B病毒（CVB），采用ELISA方法進行檢測，得到10%的脫毒植株。王莉等［55］將草莓苗置于37-40℃ 培養(yǎng)4周，結果表明熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合可使草莓病毒脫除率達到72.7%-100%，效果穩(wěn)定，是較為理想的脫除技術。何歡樂等［38］通過二次脫毒法、改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法、冷處理+莖尖培養(yǎng)法進行草莓的脫毒，結果發(fā)現(xiàn)改良熱處理（40℃水浴處理4 h）+莖尖培養(yǎng)法，莖尖成活率高達47.37%，脫毒率達到了100%，試管苗沒有出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。趙霜［56］采用莖尖脫毒法、化學脫毒法和熱處理結合莖尖脫毒法對菊花體內(nèi)的3種病毒（CVB、CMV和TMV）進行脫毒，結果發(fā)現(xiàn)熱處理結合莖尖培養(yǎng)法的脫毒效果最佳，脫毒率達到94%。

近幾年還發(fā)展出了變溫處理結合莖尖培養(yǎng)來提高外植體成活率和脫毒率的方法。暗培養(yǎng)條件下變溫熱處理（38℃/32℃）適合大多數(shù)品種和砧木脫除蘋果潛隱性病毒［57］。經(jīng)變溫熱處理比恒溫熱處理脫毒率高。熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒法一方面不存在消毒問題，使莖尖培養(yǎng)的存活率上升，可較少污染率；另一方面，解決了常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫病毒所需的較小莖尖帶來的操作困難和成活率較低的問題。

2.3 化學脫毒法

化學脫毒法是選用一些抗病毒藥劑，通過將這些藥劑加入到培養(yǎng)基中去除病毒，可顯著提高無病毒植株的幾率。其作用機理主要為競爭寄主細胞表面受體、阻礙病毒穿入脫殼、阻礙病毒生物合成和提高寄主抗病能力4 種方式［11］。常用的病毒化學藥物有三氮唑核苷（病毒唑）、5-二氫尿嘧啶（DHT）、雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）、放線菌素、堿性孔雀綠及環(huán)乙酰胺等，其中病毒唑是廣譜性的抗病毒藥物。采用化學脫毒方法，較容易脫除多種病毒，并且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖長度可大于1 mm，易于分化出苗，提高存活率［58］。劉衛(wèi)平等［59］通過添加抗病毒藥劑成功地脫除PVX。謝嘉華等［60］研究表明，病毒唑對CMV、PVX、TMV等多種病毒的增殖有抑制作用，最終提高脫毒苗的產(chǎn)量。不同的抗病毒的藥劑所達到的脫毒效果不同。Sharmas等［61］采用化學脫毒與莖尖培養(yǎng)法脫除柑橘環(huán)斑病毒（ICRSV），結果發(fā)現(xiàn)25 mg/L的病毒唑脫毒率為37%，25 mg/L無環(huán)鳥苷（ACV）的脫毒率為20.8%，疊氮胸苷和DHT對ICRSV無脫毒效果。病毒脫除效果與抗病毒藥劑處理時間有關，20 mg/L病毒醚處理時間由30 d延長至40 d后進行超低溫處理，‘豐水’和‘美人酥’的ASGV脫除率分別由84.6%和60%提高至90%和80%［62］。

化學脫毒法使用方便，操作簡單，適用于病毒的大面積防治，對于病毒的復合侵染有明顯的抑制作用，可以同時去除多種病毒。不足之處是，化學試劑可能會對環(huán)境造成危害。

2.4 超低溫保存結合莖尖培養(yǎng)脫毒法

近年來，在植物超低溫保存的過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過處理的植株體內(nèi)的病毒量降低，甚至有些材料沒有發(fā)現(xiàn)病毒的存在，之后被人們作為一種脫除病毒的方法。該脫毒法原理是含有病毒的頂端細胞液泡內(nèi)含有大量的水分，在超低溫（-80℃以下）保存過程中易形成水晶致死，而增殖較快的分生組織細胞胞質濃，含水少，因而在低溫保存的過程中不易致死，最終能獲得脫毒的植株。常用液氮做冷源。Brison等［63］采用超低溫保存結合莖尖離體培養(yǎng)方法使李屬根狀莖上的PPV的脫毒率達到50%，比單純的莖尖培養(yǎng)的脫毒率多了近2倍，開創(chuàng)了超低溫脫毒法。王壯偉［64］采用超低溫玻璃化結合莖尖培養(yǎng)獲得了70%無蘋果潛隱性病毒的植株。白建明等［65］用超低溫保存法和常規(guī)方法（莖尖分生組織培養(yǎng)、溫熱療法以及溫熱療法結合莖尖分生組織培養(yǎng)）來去除馬鈴薯試管苗中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）和PVX，結果發(fā)現(xiàn)4種方法都可以去除PVX，其中超低溫保存法的脫毒率最高，為59.13%。

該法的顯著特點是脫毒率高，能同時處理大量材料，能夠排除切取莖尖過程的操作問題，不需要昂貴的儀器設備，短時間內(nèi)就可以生產(chǎn)出無毒植株，然而不足之處是其存活率較傳統(tǒng)脫毒方法低，具體操作步驟繁瑣，影響最終脫毒效果的因素較多。不同材料低溫保存的溫度仍需要通過大量的實驗的摸索，低溫引起的表觀遺傳現(xiàn)象尚需進一步研究。

2.5 組織培養(yǎng)脫毒法

2.5.1 愈傷組織培養(yǎng)脫毒法 愈傷組織培養(yǎng)脫毒法是通過選擇適宜的外植體來誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后愈傷組織再分化進而形成完整的再生植株。選擇愈傷組織脫毒法是因為愈傷組織內(nèi)病毒的復制速度慢于細胞的增殖速度，又或者是因為其中的有些細胞通過突變獲得了抗病毒能力［66］。該方法的外植體一般選為根、莖、葉等營養(yǎng)器官。許莉萍等［67］用甘蔗心葉愈傷組織培養(yǎng)，最終發(fā)現(xiàn)花葉病的發(fā)病率為0%。在剪切外植體時，一方面要保證愈傷高誘導率，又要注意傷口破壞程度最小，減少酚類物質流出，減輕褐化程度。

2.5.2 花藥培養(yǎng)脫毒法 該方法的外植體一般為花藥、花瓣、花軸、花萼、胚珠、果實等生殖器官。外植體需要一個脫分化形成愈傷組織的過程，愈傷組織經(jīng)過再分化，形成叢生芽或產(chǎn)生胚狀體，然后誘導長根，形成完整再生植株。覃蘭英等［68］最早通過花藥愈傷組織誘導再生植株的途徑，培育了‘因都卡’、‘達娜’等品種的花藥脫毒苗。曹有龍等［69］取4種供試品種4-5 mm花蕾誘導形成愈傷組織，最終結果表明花藥培養(yǎng)脫毒率平均為73.5%。利用花藥培養(yǎng)脫毒法，獲得的草莓脫毒苗長勢強，品質明顯提高，產(chǎn)量較未脫毒草莓提高 20%-45%［70］。高慶玉等［71］選取花藥、幼葉和莖尖愈傷組織作為外植體接種在培養(yǎng)基中，以獲得最終的完整植株，結果表明花藥培養(yǎng)獲得的植株脫毒效果最好，達到100%，而幼葉和莖尖愈傷組織培養(yǎng)的脫毒效果只有20%。花藥培養(yǎng)脫毒法提高了脫毒率，降低了脫毒苗生產(chǎn)成本。但與莖尖分生組織培養(yǎng)相比，花藥誘導分化成苗率低，培養(yǎng)周期長，不利于快速繁殖。

2.6 基因工程脫毒法

近些年來，選用基因工程技術來脫除植物體內(nèi)的病毒也較為流行。目前研究結果顯示，有效的抗病毒基因主要來源于病毒本身，如外殼蛋白（CP）基因、移動蛋白（MP）基因、復制酶（Replicase）基因、反義 RNA（Antisense RNA）、正義RNA（Sense RNA）、RNA 干擾（RNA interference，RNAi）等［72］。通過體外構建的外源基因轉化載體，轉錄后形成發(fā)夾結構RNA，有效誘導基因沉默，從而抵抗病毒的入侵和繁殖。Abel等［73］通過植物基因工程技術將TMV外殼蛋白基因轉入煙草，培育出能穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植株，由此開啟了抗病毒植物基因工程這一新的領域。Gargouri-Bouzid 等［74］將PVY的CP 基因通過農(nóng)桿菌介導法導入馬鈴薯中，轉基因馬鈴薯中表達的病毒CP可以介導馬鈴薯對PVY 產(chǎn)生抗性。目前，已克隆了TMV、CMV、SMV、苜?；ㄈ~病毒（ALMV）、PVX、PVY等在內(nèi)至少30種病毒的外殼蛋白基因，并成功地轉至煙草、番茄、大豆、馬鈴薯等作物［75］。反義 RNA 是指能與m RNA堿基互補配對的單鏈RNA，反義鏈RNA與其相應的m RNA互補，可使該基因的表達受到抑制。利用反義RNA作為抗病毒基因工程的策略有待于進一步完善［76］。另一策略是利用非病毒來源的基因如植物中自然存在的抗性基因，來獲得抗病毒植物。目前，用于植物抗病毒基因工程的非病毒來源的基因包括：植物、微生物的核糖體失活蛋白基因、α，β干擾素基因、PR蛋白基因、潛在自殺基因［77］。在基因工程這些方法中，利用病毒外殼蛋白基因獲得的轉基因植株，其獲得抗性效果最好，但一般只能延遲一年病害的發(fā)生，其他方法的機制仍需要進一步研究。

2.7 其他脫毒方法

除了上述脫毒方法，在實際生產(chǎn)中還常常用到嫁接脫毒法。嫁接脫毒法是將莖尖嫁接于無毒砧木上培養(yǎng)，可獲得無病毒植株，縮短育苗周期，保持母本的優(yōu)良性狀。莖尖嫁接技術是目前在柑橘苗木繁育中應用最廣的脫毒技術。莖尖嫁接成活率與砧木、接穗和莖尖大小等多種因素相關，在實際操作中可根據(jù)脫毒品種的具體情況進行選擇［78］。另外，也有研究者采用變溫、二氧化碳處理與組培結合脫毒法，具體操作是在變溫處理和組織培養(yǎng)的基礎上結合高濃度二氧化碳和高溫短期處理的方法脫去病毒，在葡萄上已初見成效［79］。

3 展望

目前，針對病毒的檢測技術有生物學檢測方法、電子顯微觀察法、血清學方法、分子生物學檢測，但實際對病毒進行檢測時，一般采用多種方法，使得到的結果更為準確、可靠。血清學方法常和其他學科相結合、生物測定與電鏡診斷結合，廣泛地應用于病毒的檢測中以提高檢測效率、檢測靈敏度。植物病毒病檢測技術正在向著快速、高敏感性、高特異性和高通量并行性及自動化的方向發(fā)展。

對多種植物脫毒方法研究發(fā)現(xiàn)，只采用莖尖脫毒不能完全除去侵染的復合病毒，一般可同時采用兩種或兩種以上的脫毒方法，達到較好的脫毒效果。其中，在采用莖尖脫毒法脫除病毒時，要注意切取莖尖的大小、時間、形態(tài)。對于熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒法，可多采取變溫的方法進行脫毒。由于化學藥劑的選擇范圍廣，對不同植物脫毒效果不同，且目前研究的報道較少，所以化學脫毒法還有待進一步的研究。傳統(tǒng)的防治方法都具有其局限性，隨著基因工程的發(fā)展，生物技術在植物病理學上得到應用，為防治植物病毒開辟了新途徑。在基因工程脫毒法中，可選擇多種抗性基因控制病毒或病毒復合侵染，制定抗病毒介體基因與抗病毒基因結合策略，更大程度的增加植物對病毒的抗性，減少病害的發(fā)生。在脫毒的過程中，需要考慮植物自身的性質與病毒的特質，這樣既不影響植物自身的生長，又能得到較高的脫毒率。

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（責任編輯 朱琳峰）

Research Advances on Plant Virus Detection and Virus-elimination Methods

CHI Hui-rong MAO Bi-zeng
（College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058）

Virus is known as one of the smallest creatures in nature，its morphology and size can only be observed and identified by electron microscopy enlarging it by tens of thousands or even hundreds of thousands of times. The virus is strictly parasitic so that its growth and reproduction depend on the host cell. Plant viruses are an important part of the virus family. The plant virus disease，which affects the growth and development of plants and decreases the yield and quality，is increasingly serious year by year. Due to the numerous varieties of viruses and complex damage mechanisms，it is difficult to prevent and control the viral diseases. This article reviews the major methods of detecting plant virus as well as the technologies of virus-elimination and its application in recent years. Further，the article discusses the issues which need to be paid attention to in the virus-elimination. Finally，the article forecasts the future research direction for providing references and theoretical basis for further study.

plant virus；plant disease detection；virus-elimination method

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0253

2017-03-31

浙江省農(nóng)業(yè)中藥材新品種選育重大科技專項（2016C02058）

遲惠榮，女，碩士研究生，研究方向：植物病理學；E-mail：21616114@zju.edu.cn

毛碧增，女，博士，研究員，研究方向：中藥材品種選育與品質改良；E-mail：maobz@zju.edu.cn