肝癌細(xì)胞外泌體蛋白組成分析

宋蕙晨，李偉利，褚丹萍，李大蒙，李菁，張玉婧

（醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)生命科學(xué)合作創(chuàng)新中心，江蘇省小核酸生物學(xué)和生物技術(shù)工程研究中心，南京大學(xué)生命科學(xué)高等研究院，生命科學(xué)學(xué)院，南京大學(xué)，仙林大道163號(hào)，江蘇南京，210023，中國(guó)）

肝癌細(xì)胞外泌體蛋白組成分析

宋蕙晨，李偉利，褚丹萍，李大蒙，李菁，張玉婧

（醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)生命科學(xué)合作創(chuàng)新中心，江蘇省小核酸生物學(xué)和生物技術(shù)工程研究中心，南京大學(xué)生命科學(xué)高等研究院，生命科學(xué)學(xué)院，南京大學(xué)，仙林大道163號(hào)，江蘇南京，210023，中國(guó)）

外泌體是細(xì)胞分泌的一種大小40-130nm的雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡。近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶蛋白質(zhì)，DNA，RNA，miRNA和脂類物質(zhì)等，通過對(duì)這些物質(zhì)的運(yùn)輸，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間，組織與組織之間的相互作用，成為新的信號(hào)傳遞載體。并且最近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以率先改變靶組織的微環(huán)境，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移，實(shí)現(xiàn)癌癥的轉(zhuǎn)移。因此對(duì)腫瘤細(xì)胞的外泌體蛋白分析非常重要，本文首次分析了肝癌細(xì)胞的外泌體蛋白組成，為研究肝癌細(xì)胞外泌體的作用和機(jī)制，以及肝癌轉(zhuǎn)移打下基礎(chǔ)。

外泌；蛋白質(zhì)；肝癌；HEPG2 細(xì)胞

引言

外泌體是一種直徑為30-100nm的內(nèi)含體起源的囊泡，其內(nèi)部包含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA和DNA。它最早被發(fā)現(xiàn)于1987年，Johnstone等人在網(wǎng)織紅細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)了它們?cè)诙嗯蒹w（MVB）的融合過程中被從細(xì)胞質(zhì)膜里釋放出來[1]。十年以后，在B淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了這種內(nèi)含體來源的小泡[2,3]。接下來越來越多的研究者在不同的細(xì)胞中都觀察到外泌體的分泌。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在生理病理過程中起著重要的作用，外泌體可以通過表面的蛋白或和有生物活性的脂質(zhì)配體與受體細(xì)胞相互作用以配受體結(jié)合的方式直接激活細(xì)胞表面受體，也可以將其表面的受體或內(nèi)含的效應(yīng)物質(zhì)（包括轉(zhuǎn)錄因子、原癌基因和感染性顆粒）運(yùn)送至受體細(xì)胞內(nèi)。此外，被包裹在EV內(nèi)的包括mRNA和小調(diào)控RNA（例如miRNA和其他非編碼RNA）在內(nèi)的多種RNA分子也會(huì)被遞送至受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而影響受體細(xì)胞的活性與功能[4-9]。對(duì)外泌體進(jìn)行高通量蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示外泌體表面含有細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面蛋白（如膠原蛋白，整合素以及半乳糖凝集素）、細(xì)胞表面受體（如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）），其內(nèi)包含各種信號(hào)通路中的蛋白、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架成分、代謝相關(guān)的酶以及G蛋白[10,11]。除此以外，外泌體還含有一些特異性的蛋白質(zhì)與其來源細(xì)胞相關(guān)，這些蛋白也參與對(duì)靶細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，此外對(duì)這些蛋白的檢測(cè)還可以用于臨床上對(duì)疾病發(fā)生的檢測(cè)。最近，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體表面的整合素可以和靶細(xì)胞相互作用，通過改變靶組織的微環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[12]。因此，研究外泌體的蛋白質(zhì)組成對(duì)研究細(xì)胞、組織、器官之間的相互作用至關(guān)重要。

在《全球癌癥報(bào)告2014》顯示，中國(guó)新增癌癥病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。目前，我國(guó)肝癌的發(fā)病率約為25.7/10萬，成為死亡率僅此于胃癌、肺癌的第三大惡性腫瘤，但是肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。外泌體在癌癥的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)免疫系統(tǒng)的激活，腫瘤免疫逃逸，以及腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過程都發(fā)揮著重要的作用。目前，肝癌細(xì)胞的外泌體蛋白結(jié)構(gòu)和組成尚未明確，本課題通過對(duì)但癌細(xì)胞的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，研究肝癌細(xì)胞外泌體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成，分析其可能的成分與功能，為外泌體在肝癌發(fā)病過程和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法

HEPG2細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS），1%雙抗(PS)的高糖DMEM培養(yǎng)液中，其培養(yǎng)條件為37℃，5%二氧化碳的環(huán)境。約兩天傳代一次，按貼壁細(xì)胞的傳代方法進(jìn)行傳代。

當(dāng)需要從細(xì)胞培液中收集外泌體時(shí)，細(xì)胞傳代后待其密度至80%后，棄去之前的培養(yǎng)液，用溫?zé)岬腍BSS清洗細(xì)胞2次，更換培液為含1%FBS(exosome free)的OPTI-MEM培養(yǎng)液，37℃，5%二氧化碳的環(huán)境培養(yǎng)24-36小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞狀態(tài)而定。

1.2 去除FBS中的外泌體

為避免FBS中的外泌體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，使用差速離心的方法將FBS中的外泌體去除，分別通過3000g 30分鐘，10000g 1小時(shí)，110000g 2小時(shí)離心去除沉淀后使用0.22μm的濾器過濾，除菌以及除去可能殘留的大顆粒雜質(zhì)，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 從細(xì)胞培液中提取外泌體

本實(shí)驗(yàn)使用購(gòu)買自Invitrogen公司的從細(xì)胞培液中分離外泌體的試劑盒（exosome isolation kit for culture medium）對(duì)HEPG2 培液中的外泌體進(jìn)行分離，通過3000g 30分鐘，10000g 1小時(shí)，離心去除沉淀，再使用110000g 2小時(shí)棄去上清，用HBSS緩慢輕柔的清洗沉淀2至3次即得到較為純凈的外泌體。根據(jù)用途，用適量HBSS重懸沉淀用于納米顆粒計(jì)數(shù)或RNA的提取。加入適量RIPA裂解液用于提取外泌體蛋白。加入8M的尿素裂解液用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。

1.4 外泌體的計(jì)數(shù)

將分離得到的外泌體重懸后，測(cè)定蛋白濃度調(diào)整至5μg/ ml,再稀釋100至500倍后加入儀器中檢測(cè)。

1.5 外泌體中蛋白質(zhì)的抽提

在冰上向離心得到的外泌體沉淀中加入適當(dāng)?shù)牧康谋涞腞IPA裂解液或8M的尿素裂解液，充分吹打并轉(zhuǎn)移至新的EP管中，并在冰上靜置20分鐘后12000g，4℃離心5分鐘，取上清，得到裂解的蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，樣品保存在-20℃或-70℃中。

1.6 LC-MS/MS

LC-MS/MS是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，是一種高通量的蛋白定性分析方法。它的原理是將樣品中的蛋白都消化成一定長(zhǎng)度的肽段，經(jīng)過液相色譜的純化分離并在兩級(jí)色譜中通過肽段以及氨基酸間的分子量差異計(jì)算得到肽段序列。得到的肽段序列與已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)比對(duì)從而鑒定出樣本中所含的蛋白質(zhì)種類。由于近幾年LC-MS/MS技術(shù)發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為一種常用的高通量的蛋白定性分析手段。具體方法如下：

1.6.1 蛋白的消化與脫鹽

蛋白混合物在被還原和烷基化后在37℃下使用Lys-C消化6小時(shí)。使用25 mM 的碳酸氫銨將蛋白裂解液中的尿素濃度調(diào)整為1M。按1:50的比例向調(diào)整過的蛋白溶液中添加測(cè)序級(jí)別的胰蛋白酶，37℃下消化過夜。使用蟻酸進(jìn)行終止消化使其終濃度為0.1%。消化后的肽段混合物20000g離心10分鐘，收集上清液準(zhǔn)備進(jìn)行脫鹽。

使用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽。先用1ml的甲醇和ml的乙腈過柱，然后連續(xù)3次使用1ml的0.1%的蟻酸過柱，接下來將樣品分3次上柱。連續(xù)三次使用1ml 0.1%的蟻酸過柱子進(jìn)行脫鹽。使用連續(xù)濃度的乙腈對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，依次為：0.5 ml 40%乙腈/0.1%的蟻酸和0.5 ml 60%乙腈/0.1%的蟻酸，將合并的洗脫物減壓離心濃縮。

1.6.2 在線高pH值分級(jí)分離

濃縮的樣品被溶解在高pH分級(jí)緩沖液A中（98%水/ 2%乙腈，用氨水調(diào)節(jié)pH為10），將樣品載入XBridge C18基礎(chǔ)反相液相色譜柱中。蛋白肽段在Rigol L-3000液相色譜系統(tǒng)中用AB緩沖液體系分離（緩沖液B梯度的步驟如下：5-8%5分鐘，8-18% 35分鐘，18-32% 22分鐘，32-95% 2分鐘和95% 4分鐘）。每90秒收集一次洗脫液，總共可以得到42份洗脫液。這42份洗脫液被按1、15、29和2、16、30依次類推的順序整合為14個(gè)組分。這些組分接下來被用于質(zhì)譜分析。

1.6.3 LC-MS/MS分析

樣品使用反相液相色譜系統(tǒng)EASY-nLC 1000偶聯(lián)納米電噴霧源鏈接Q Exactive質(zhì)譜。蛋白肽段使用buffer A(0.1%蟻酸)和Buffer B（乙腈/0.1%蟻酸）緩沖液體系線性梯度分離78分鐘，流速為280nL/min。洗脫的肽段被直接被電噴霧離子化，然后進(jìn)入質(zhì)譜分析，電噴霧參數(shù)為2.0kV，毛細(xì)管溫度320°C。質(zhì)譜按照數(shù)據(jù)相關(guān)模式工作，采集調(diào)查掃描分辨率為70000, AGC目標(biāo)為3E6個(gè)離子，最大離子注入時(shí)間60ms。隨后，選取前20個(gè)含量最豐富的峰碎片化后進(jìn)入2級(jí)質(zhì)譜，碎片化所需的校正后的碰撞解離碰撞能為27。二級(jí)譜的分辨率為17500，目標(biāo)值為5E4個(gè)離子，最大離子注入時(shí)間60ms。為了最大限度地減少肽段的重測(cè)序，動(dòng)態(tài)排除窗口時(shí)間被設(shè)置為50秒。

1.6.4 原始MS數(shù)據(jù)的分析

原始數(shù)據(jù)的分析采用Proteome Discoverer結(jié)合SEQUEST作為搜索引擎。MS/MS質(zhì)譜信息的搜索數(shù)據(jù)庫(kù)為UniprotKB人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（下載于2015年5月11日）并使用已知的常見外源蛋白污染物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。半胱氨酸的末端甲基化修飾被設(shè)置作為固定修飾，N-末端乙?；图琢虬彼嵫趸辉O(shè)為可變修飾。肽段分子量和碎片分子量的容差分別設(shè)定為10 ppm和20 mDa，序列匹配的容差為最大2個(gè)錯(cuò)誤的切割位點(diǎn)。肽段的鑒定通過1%FDR篩選。

1.7 基因的GO分析和KEGG通路分析

為了對(duì)鑒定到的基因進(jìn)行基因本體功能聚類以及信號(hào)通路的功能聚類，我們對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行GO分析和KEGG分析。使用的工具是DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery Bioinformatics Resources 6.7)。網(wǎng)站地址：http://david.abcc.ncifcrf.gov/。詳細(xì)信息和具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13,14]。

2 結(jié)果

2.1 利用LC-MS/MS鑒定HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)

為了鑒定HEPG2細(xì)胞來源的外泌體中的蛋白質(zhì)組成，我們使用外泌體分離試劑盒從HEPG2細(xì)胞培養(yǎng)液中分離外泌體。將外泌體重懸浮于HBSS后，用0.22μm的PVDF膜濾器除去可能存在的污染物。然后將純化的外泌體用外泌體分離試劑盒重新離心并制樣，隨后使用LC-MS/MS對(duì)HEPG2來源的外泌體的蛋白進(jìn)行定性鑒定。我們準(zhǔn)備了3份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，三個(gè)外泌體樣本分別檢測(cè)出2858,2537和2928種蛋白質(zhì)。如文氏圖中所示（圖1），三次實(shí)驗(yàn)的交集被認(rèn)為是最終的鑒定結(jié)果。因此，共1610種蛋白在HEPG2細(xì)胞的外泌體中被檢測(cè)出。

圖1 LC-MS/MS鑒定HEPG2來源外泌體的蛋白質(zhì)

2.2 HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)GO分析

為了分析HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)的功能，我們利用PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.pantherdb.org/)對(duì)外泌體來源的蛋白進(jìn)行GO分析，按照蛋白質(zhì)分類、細(xì)胞組成、生物學(xué)過程和分子功能對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類（圖2）。通過對(duì)HEPG2外泌體蛋白進(jìn)行分類，我們發(fā)現(xiàn)HEPG2外泌體蛋白種類非常豐富，達(dá)25種，其中最豐富的為核酸結(jié)合蛋白（17%），酶調(diào)節(jié)因子（11%），水解酶（10%），轉(zhuǎn)移酶（8%），細(xì)胞骨架蛋白（6%），氧化還原酶（6%），受體（6%）等（圖2A）。為了進(jìn)一步分析這些蛋白可能來自于細(xì)胞的什么部位，我們進(jìn)行了細(xì)胞組成分析（圖2B），我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要來自細(xì)胞部分（39%），細(xì)胞器（25%），大分子復(fù)合體（20%），細(xì)胞外區(qū)（6%）與細(xì)胞膜（6%）以外，還有少量存在于細(xì)胞外基質(zhì)（2%）。為了進(jìn)一步分析HEPG2外泌體蛋白的功能，我們進(jìn)行了生物學(xué)功能分析（圖2C），我們發(fā)現(xiàn)HEPG2外泌體蛋白主要參與細(xì)胞過程（30%）與代謝過程（26%），此外還有部分蛋白質(zhì)參與定位（9%），細(xì)胞組分的組織或生物學(xué)合成（9%），刺激應(yīng)激反應(yīng)（6%）與生物調(diào)控（6%）等。對(duì)這些蛋白自身的功能聚類之后（圖2D），我們發(fā)現(xiàn)，這些蛋白中有42%的蛋白是具有催化活性，34%的蛋白是與結(jié)合相關(guān)的，11%的蛋白具有分子活性，除此以外，還有少量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（5%），受體活性（4%），翻譯調(diào)節(jié)因子活性（2%），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（1%）與抗氧化活性（1%）。所有的結(jié)果說明HEPG2外泌體蛋白質(zhì)組成非常豐富，有可能參與靶器官多種生物學(xué)過程的調(diào)控。

圖2 HEPG2來源外泌體的蛋白質(zhì)GO分析

2.3 HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)KEGG Pathway分析

為了進(jìn)一步分析HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)可能參與那些信號(hào)通路的調(diào)控，我們?cè)贒AVID(http://david.abcc.ncifcrf. gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)外泌體來源的蛋白進(jìn)行KEGG Pathway分析，對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類（圖3），聚類結(jié)果用-log10（P值）表示，數(shù)值越高說明鑒定的蛋白質(zhì)在該條目富集的越顯著。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)核糖體（57.41）和蛋白酶體（55.26）相關(guān)信號(hào)通路的蛋白質(zhì)富集程度很高，其次與ECM-受體相互作用（23.08）， 黏著斑（22.95），補(bǔ)體和凝結(jié)級(jí)聯(lián)作用（20.34），氨基糖和核苷酸糖代謝（16.58），氨酰tRNA生物合成（13.95）與糖酵解和肝糖異生（11.49）等。這表明HEPG2來源的外泌體可能參與調(diào)節(jié)DNA，RNA和蛋白質(zhì)的合成，加工和降解，以及一些組織相互作用，和糖代謝等。這個(gè)結(jié)果與生物學(xué)過程分析的結(jié)果是一致的。

圖3 HEPG2來源外泌體的蛋白質(zhì)KEGG Pathway分析

圖4 HEPG2來源外泌體的蛋白質(zhì)ECM-受體相互作用分析

2.4 HEPG2分泌的外泌體蛋白質(zhì)ECM-受體相互作用分析

在圖3中，我們發(fā)現(xiàn)HEPG2外泌體蛋白質(zhì)中ECM-受體相互作用較為富集。最近有研究報(bào)道，外泌體上的整合素和靶細(xì)胞的相互作用可以介導(dǎo)外泌體的靶向性，因此分析HEPG2外泌體蛋白ECM-受體相互作用對(duì)研究肝癌細(xì)胞外泌體的靶向性至關(guān)重要。我們通過使用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，如圖4所示，HEPG2外泌體中包含了多種ECM-受體相互作用的蛋白，可以根據(jù)外泌體上整合素的種類，推測(cè)外泌體有可能靶向哪些細(xì)胞。

近年來，外泌體由于其能夠介導(dǎo)細(xì)胞、組織之間的相互作用，受到越來越多的關(guān)注。外泌體可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等物質(zhì)，這些“貨物”可以被運(yùn)輸?shù)桨薪M織發(fā)揮作用。也可以通過檢測(cè)蛋白質(zhì)、核酸等水平的變化來檢測(cè)疾病的發(fā)生。尤其最近研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞分泌的外泌體表面的蛋白質(zhì)整合素能夠介導(dǎo)外泌體的靶向性，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，因此研究癌細(xì)胞分泌的外泌體的蛋白質(zhì)組成，對(duì)于研究癌細(xì)胞與周圍組織細(xì)胞的相互作用，以及癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移都具有至關(guān)重要的作用。本文主要研究了肝癌細(xì)胞的外泌體的蛋白質(zhì)組成并進(jìn)一步分析它可能具有的功能。

首先，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的外泌體蛋白，并不是細(xì)胞內(nèi)蛋白的隨即包裹。因?yàn)槌四さ鞍缀图?xì)胞內(nèi)蛋白等根據(jù)外泌體的生成機(jī)制推測(cè)確實(shí)會(huì)存在的蛋白以外，外泌體中還含有細(xì)胞器蛋白，細(xì)胞外區(qū)域蛋白等。也就是說外泌體在分泌過程中，并不是細(xì)胞本身隨機(jī)的包裹了一些細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離蛋白質(zhì)，而是一種自主的有序的過程。

其次，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的外泌體蛋白功能雖然豐富多樣，但是相對(duì)集中在代謝和相互作用上。代謝方面，26%的蛋白都參與代謝過程，并且這些過程主要集中在糖代謝，核酸代謝，核酸糖代謝上。而相互作用方面則體現(xiàn)在34%蛋白的具有結(jié)合活性，4%蛋白在多細(xì)胞機(jī)體中發(fā)揮作用，3%的蛋白參與生物粘附，1%蛋白參與細(xì)胞粘結(jié)，這些結(jié)果都提示了肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中有較多的蛋白參與細(xì)胞之間相互作用。而且信號(hào)通路分析也提示了有較多的蛋白參與ECM受體相互作用的通路。

最后，發(fā)現(xiàn)了可能的介導(dǎo)肝癌細(xì)胞靶向性的分子。由于最新發(fā)現(xiàn)整合素介導(dǎo)外泌體與靶組織的靶向性，而肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中ECM-受體相互作用的蛋白異常富集?？梢酝ㄟ^分析能夠與肝癌細(xì)胞外泌體中的整合素發(fā)生相互作用的靶組織來分析肝癌細(xì)胞可能的靶向性，這方面還需要更進(jìn)一步的研究和確認(rèn)，這將為研究肝癌組織的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及預(yù)測(cè)肝癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供新的檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

本文研究了肝癌細(xì)胞分泌的外泌體的蛋白質(zhì)的組成，以及其功能進(jìn)行了全面的分析。這將為研究肝癌細(xì)胞通過外泌體跟其他組織細(xì)胞相互作用，以及靶向性的研究提供基礎(chǔ)。

[1] Johnstone R M, Adam M, Hammond J R,et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J]. J Biol Chem, 1987, 262(19): 9412-9420.

[2] Raposo G, Nijman H W, Stoorvogel W,et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles[J]. J Exp Med, 1996, 183(3): 1161-1172.

[3] Zitvogel L, Regnault A, Lozier A,et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cellderived exosomes[J]. Nat Med, 1998, 4(5): 594-600.

[4] Valadi H, Ekstr?m K, Bossios A,et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(6): 654-659.

[5] Baj-Krzyworzeka M, Szatanek R, Weglarczyk K,et al. Tumourderived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes[J]. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55(7): 808-818.

[6] Zhang Y, Liu D, Chen X,et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration[J]. Mol Cell, 2010, 39(1): 133-144.

[7] Ratajczak J, Miekus K, Kucia M,et al. Embryonic stem cellderived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery[J]. Leukemia, 2006, 20(5): 847-856.

[8] Camussi G, Deregibus M C, Bruno S,et al. Exosome/ microvesicle-mediated epigenetic reprogramming of cells[J]. Am J Cancer Res, 2011, 1(1): 98-110.

[9] Lee Y, El A S, Wood M J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy[J]. Hum Mol Genet, 2012, 21(R1): R125-134.

[10] Simpson R J, Jensen S S, Lim J W. Proteomic profiling of exosomes: current perspectives[J]. Proteomics, 2008, 8(19): 4083-4099.

[11] Kim H S, Choi D Y, Yun S J,et al, Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells[J]. J Proteome Res, 2012, 11(2): 839-849.

[12] Hoshino A, Costa S B, Shen T L,et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Natur, 2015, 19, 527(7578): 329-335.

[13] Kiss D L, Hou D, Gross R H,et al. Dis3- and exosome subunit-responsive 3' mRNA instability elements[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 423(3): 461-466.

[14] Vlassov A V, Magdaleno S, Setterquist R,et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820(7): 940-948.

Identi fi cation and Characterization of HEPG2 Cell-derived Exosomes by Pro fi ling the Protein Components

Song Huichen, Li Weili, Chu Danping, Li Dameng, Li Jing, Zhang Yujing
(State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology. Collaborative Innovation Center of Chemistry for Life Sciences, Jiangsu Engineering Research Center for MicroRNA Biology and Biotechnology, NJU Advanced Institute for Life Sciences (NAILS), School of life sciences, Nanjing University, 163 Xianlin Road, Nanjing, Jiangsu, 210023, china)

Exosomes were lipid bylayer and ranging from 40 to 130 nm released by a variety of cells. It’s reported that the exosomes bear proteins, lipids, and RNAs, mediating intercellular communication between different cell types in the body, and thus affecting normal and pathological conditions. Recently, it was found that tumor derived exosomes uptaken by organ-specific cells prepare the pre-metastatic niche. Therefore, analysis of protein components of tumor exosomes was very important. In this paper, we were the first to characterize the protein components of liver cancer cell HEPG2 exosomes and this work will be the basis to study the intercellular communication of liver cancer cells with other tissues and the organ-specific metastasis.

exosome; protein; liver cancer; HEPG2 cell

Q291

A

10. 11967/ 2017150106

Q291

ADOI:10. 11967/ 2017150106

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)（20120091120044）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31200969）

宋蕙晨（1993-），女，碩士研究生，分子生物學(xué)

張玉婧（1983-），女，副教授，生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:yjzhang@nju.edu.cn.