磁珠分離結合質譜分析黏多糖?、裥突颊吣蛞憾嚯淖V

苑曉舟，孟巖，梁爽，姜文燦，葛素君，段晉燕，王成彬

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床檢驗科，北京，100853；2. 中國人民解放軍總醫(yī)院兒童醫(yī)學中心， 北京，100853）

磁珠分離結合質譜分析黏多糖?、裥突颊吣蛞憾嚯淖V

苑曉舟1，孟巖2，梁爽1，姜文燦1，葛素君1，段晉燕1，王成彬1

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨床檢驗科，北京，100853；2. 中國人民解放軍總醫(yī)院兒童醫(yī)學中心， 北京，100853）

目的研究黏多糖?、裥停∕PSⅠ）患者尿液小分子多肽譜，尋找對MPSⅠ型診斷的新方法。方法利用弱陽離子磁珠純化（magnetic beads based weak cation exchange chromatography，MB-WCX）系統(tǒng)結合基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）的方法，檢測8例于解放軍總醫(yī)院兒童醫(yī)學中心確診的MPSⅠ型患者（疾病組）和10例本院查體人員（健康對照組）的尿液標本，獲得尿液小分子多肽譜，應用ClinProtTM軟件進行數(shù)據(jù)分析，找出差異多肽峰，并繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），對比曲線下面積(AUC)、敏感度和特異性。結果質荷比1000-10000之間，兩組尿液標本共篩選出7個具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）多肽差異峰。其中在疾病組中表達上調的有4個峰，表達下調的3個峰。AUC面積大于0.9的多肽質荷比為：1069.6（0.982）和3217.3（0.946），兩者的特異性均為87.4%，敏感性均達到100%。結論MB-WCX聯(lián)合MALDITOF-MS檢測技術可獲得MPSⅠ型患者和健康人的尿液差異多肽譜，為MPSⅠ型輔助診斷提供了一種無創(chuàng)的新方法。

黏多糖?、裥?；弱陽離子磁珠；基質輔助激光解析電離-飛行時機質譜；多肽；尿液

粘多糖貯積癥（mucopolysaccharidosis,MPS）屬溶酶體貯積?。╨ysosomal storage disease，LSD）中最常見的一種類型，是由于溶酶體內(nèi)水解酶缺陷，導致粘多糖（glycosaminoglycans，GAGs）在各組織器官累積而致病的遺傳代謝性疾病[1]。其中粘多糖?、裥褪俏覈^常見的類型，發(fā)病原因是由于α-L-艾杜糖苷酶（IDUA）活性缺乏，致使其底物硫酸皮膚素（DS）和硫酸肝素（HS）貯積無法降解[2]。由于早期診斷的不及時，會導致不可逆的發(fā)育、神經(jīng)、生理的改變。但是，該病現(xiàn)有的檢測方法存在一些不足：尿液中GAG含量檢測準確性較低，不能鑒別疾病類型[3]；酶活性檢測和基因檢測不便于常規(guī)開展。因此，亟需探索新的生物標記物幫助對黏多糖貯積癥進行早期診斷。本研究旨在利用弱陽離子磁珠（weak cation exchange magnetic beads，MBWCX）純化試劑和基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF），對MPSⅠ型患者尿液中小分子多肽譜作初步研究，尋找差異多肽峰，為診斷MPSⅠ型尋求新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 對象

選取2015年3月～2016年4月在解放軍總醫(yī)院小兒內(nèi)科遺傳咨詢門診就診的粘多糖病Ⅰ型患者8例納入疾病組，其中男性5例，女性3例，平均年齡（11±5.0）歲。全部患者均符合粘多糖病的診斷標準，即具有特殊面容，骨骼發(fā)育畸形，肝脾腫大，角膜混濁等臨床表現(xiàn)，且患者白細胞中IDUA活性顯著低于正常參考值，以及基因檢測發(fā)現(xiàn)相關突變位點，可確診。選取同期健康體檢兒童10例作為對照組，其中男性6例，女性4例，平均年齡（10.3±4.5）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及健康對照人員均簽署知情同意書。

1.1.2 儀器和試劑

弱陽離子納米磁珠試劑盒及其緩沖體系、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid, HCCA)、點樣靶均購自北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司；丙酮、甲醇、異丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等購自美國Sigma公司，均為進口HPLC 級；其他材料購自德國Eppendorf 公司。Milli-Q 超純水系統(tǒng)，為美國Millipore 公司產(chǎn)品；MicroCL 21高速離心機，由美國Thermo Fisher科技公司生產(chǎn)，MALDI-TOF-MS儀，由毅新博創(chuàng)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 尿液收集和處理

收集受試者清晨中段尿50ml，然后4℃ 3 000r ／min 離心5 min， 將分離的上清尿標本分裝于離心管中，置-80℃冰箱保存待用。

1.2.2 尿液多肽提取

-80℃冰箱中取出尿標本，4℃ 12 000 r ／min離心3 min，取上清液用MB-WCX 磁珠處理，步驟如下：① 4℃冰箱取出磁珠試劑盒，手動上下顛倒，使磁珠混勻。取200 ul 八連排樣品管置于孔板上，依次加入10 ul 磁珠、 95 ul 磁珠結合緩沖液（CB）和10 ul 尿液樣本，用排槍上下緩慢吸打混勻，避免氣泡產(chǎn)生，在室溫靜置5min。② 將樣品管在磁珠分離器上靜置1min，磁珠富集到管底并貼壁，與懸浮的液體分離，液體應該變?yōu)槌吻濉Ｎド锨宓囊后w，槍頭接觸磁珠對側管底，避免吸走磁珠。③ 將樣品放入孔板中，加入100 ul磁珠清洗液緩沖液（CW），用排槍上下緩慢吸打混勻，避免氣泡產(chǎn)生，靜置2min。然后將樣品管在磁珠分離器上靜置1min，吸去上清液體。④ 重復步驟③一次，最后多吸一次剩余少量上清液體，保證上清液體完全被吸走。⑤ 將樣品放置于孔板上，加入10 ul磁珠洗脫液（CE）反復吸打十次以上，吸打過程嚴格避免氣泡。放置5min，使磁珠和洗脫液混懸均勻。⑥ 將樣品放置于磁珠分離器上，靜置1min ，使磁珠與懸浮液充分分離，將上清液移出到已標記的0.2ml 樣品管。⑦取1μl上清液與5μl基質(0．6 g／L)混勻，用0．5μl點靶，每個樣品點3個靶點。

1.2.3 尿液多肽譜檢測與數(shù)據(jù)采集

上述樣品室溫干燥后，放入MALDI—TOF質譜儀進行檢測。具體參數(shù)設置如下: 選擇方法LP-Clinprot． par，靶MTPAnchorchip800/384，N2激光源，激光能量在60% 左右，正離子線性模式和自動采集數(shù)據(jù)的模式，檢測相對分子量范圍為1000～ 10000 m/z;

1.2.4 生物信息學軟件處理

質譜數(shù)據(jù)采集后，應用Autoflex analysis 對圖譜進行基線的平滑、衰減、標峰及用Excel 表格進行數(shù)據(jù)輸出。質譜數(shù)據(jù)采集后通過Flex Analysis 3．0(德國Bruker)進行基線的平滑、衰減、標峰及數(shù)據(jù)輸出，其基本功能如下：

調出所有質譜圖、基線平滑、基線衰減、選定蛋白質相對分子質量1000～10 000的標峰方法(信噪比大于5)進行自動標峰，將譜圖結果用Excel表格輸出。

1.2.5 統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理采用ClinPro Tools 軟件進行處理

計量資料用均數(shù)± 標準差（x ± s）表示，對疾病組和健康組進行比較采用LSD-t 檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用SPSS19.0繪制ROC曲線，計算曲線下面積（AUC）以及敏感度和特異度。

2 結果

2.1 MPSⅠ組與正常組尿液多肽譜比較

兩組共分析出46個峰，見圖1、圖2。統(tǒng)計分析后顯示7個多肽峰差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05) ，分子量分別是1069.6、2752.7、2223.8、2374.9、1657.5、5492.9、3217.3，見表1。其中疾病組中高表達的4個，低表達的3個。

圖1 疾病組尿液多肽譜圖

圖2 對照組尿液多肽譜圖

表1 MPSⅠ組與正常組差異多肽峰的比較

2.2 ROC曲線

分別繪制分子量為1069.6、2752.7、2223.8、2374.9、1657.5、5492.9、3217.3的多肽診斷MPSⅠ型的ROC曲線（見圖3），并計算曲線下面積以及靈敏度和特異度（見表2）。7種多肽診斷MPSⅠ型的AUC分別為0.982、0.893、0.795、0.768、0.786、0.714、0.946；其中分子量為1069.6和3217.3的多肽，具有100%的敏感度和87.5%的特異度。

圖3 7種多肽診斷MPSⅠ型的ROC曲線

表2 7種多肽診斷MPSⅠ型的AUC、敏感度和特異度

討論

粘多糖?、裥褪怯捎诨颊唧w內(nèi)α-L-艾杜糖苷酶活性降低或失活，導致DS、HS在各組織器官累積，從而致病的一種罕見遺傳代謝性疾病。臨床表現(xiàn)主要包括智力缺陷、心瓣膜疾病、粗糙面容、肝脾腫大和角膜混濁等。根據(jù)病情輕重分為三個亞型，其中癥狀最嚴重的稱為Hunler綜合征，癥狀較輕的稱為Scheieor綜合征，介于兩者之間的是Hurler/Scheieor綜合征[4,5]。粘多糖病患兒出生時一般無明顯顏面特征，可能有臍疝和腹股溝疝，病情隨著年齡增長而呈進行性加重。如果延誤診斷，疾病所造成的機體改變是不可逆的，所以對于該病的早期診斷、早期干預非常必要。

目前針對該粘多糖病的實驗室檢查包括尿液粘多糖定量和電泳、外周血白細胞α-L-艾杜糖苷酶活性測定和IDUA基因突變檢測。尿液粘多糖定量是采用晨尿，經(jīng)染料染色后發(fā)生顏色變化，電泳后可顯示硫酸皮膚素和硫酸類肝素條帶，但由于多糖不穩(wěn)定，且染料與多糖的結合特異性不足，所以該法準確性較低，僅用于初篩[6]；酶活性檢測通常采用熒光免疫法檢測外周血白細胞中α-L-艾杜糖苷酶活性，患者酶活性顯著低于正常人，該法步驟較繁瑣，易受手工操作者的影響；IDUA基因突變檢測有助于病因確診及產(chǎn)前診斷，但該病呈現(xiàn)復雜的分子異質性，給檢測帶來難度，不便于實驗室常規(guī)開展。并且現(xiàn)有的檢測方法均不能解釋“粘多糖在體內(nèi)累積是如何造成各組織器官功能受損”這一臨床亟待解決的問題。同時，由于粘多糖病的致病原因尚未完全明確，所以針對該病的治療依賴于造血干細胞移植和酶替代治療。但以上治療方法均價格昂貴，多數(shù)患兒家庭僅能負擔對癥支持治療，并不能延緩疾病進程[7]。所以，針對粘多糖致病機制的研究也可以為尋找新的治療手段提供思路。

蛋白質組研究不僅能為生命活動規(guī)律提供物質基礎，也能為眾多種疾病機理的闡明提供理論根據(jù)和解決途徑。尿液蛋白約30%來源于血漿蛋白，包含多種生物標志，可以間接反映血漿蛋白的組成[8]。采用尿液作為蛋白質組學的研究對象具有以下優(yōu)點：首先尿液收集是非侵入性，患者一般都愿意多次提供樣品，因此尿液適合監(jiān)測疾病進展和對治療的反映；其次尿液中包含的小分子蛋白和多肽不需過多的處理步驟便可直接分析，避免了由蛋白水解所帶來的變異性與復雜性，這不僅節(jié)省了時間，也降低了實驗的變異性；并且尿液是一種穩(wěn)定的樣本，因其儲存在膀胱的過程中已被蛋白水解酶水解完全，所以合理凍存后蛋白成分不會發(fā)生太大改變[9,10]。因此，利用蛋白質組學技術來檢測患者尿液中的各種特異性生物學指標具有較強的可行性與可操作性。

近二十年來，尿液蛋白質組學的研究技術也在不斷發(fā)展。1979年，Anderson最早采用雙向電泳的方法對正常尿液樣本中的蛋白進行分析，但是雙向電泳低通量，且對疏水蛋白和復雜樣本的分析能力有限，這使其現(xiàn)在運用較少。之后發(fā)展的液相色譜分離聯(lián)合質譜技術，具有高效性、高靈敏度和高分辨率的特性，從而倍受青睞。近幾年，MALDI-MS技術也廣泛應用于尿液蛋白質組學研究，由此得到蛋白質指紋圖譜可以檢測到幾百個峰值信號[11,12]。但傳統(tǒng)的雙向電泳結合MALDI-TOF MS或者毛細管電泳聯(lián)用電離飛行時間質譜的方法，操作復雜，限制其應用。磁珠是近年發(fā)展起來并在生物醫(yī)學領域廣泛應用的一種新型多功能試劑，同時具有載體和分離功能[13,14]，并且磁珠分離結合質譜法尚未應用于黏多糖病患者尿液多肽譜分析，故本研究采用此方法，以期找出差異多肽峰。

由于近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，分子量在1 000 ～ 40 000 d 之間的尿蛋白峰值比較有意義[15,16]，所以本研究也主要關注相對分子質量在1000-10000m/z之間的小分子多肽。本研究結果顯示，在MPSⅠ型和對照組中，多肽譜出峰主要集中在6500m/z以下分子量較小的區(qū)域，共出峰48個。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后，具有顯著性差異的有7個，其中疾病組中高表達的4個，m/z分別為2223.8、1657.5、5492.9、3217.3，疾病組中低表達的3個，m/z分別為1069.6、2752.7、2374.9。其中分子量為1069.6和3217.3的蛋白，AUC在0.9以上，且具有100%的敏感度和87.5%的特異度。所以兩個多肽峰有望作為MPSⅠ型患者的診斷模板，幫助疾病篩查。并且，在進一步的實驗中，我們將對差異多肽峰進行種類鑒定，從而尋找疾病的生物標志物，為其早期診斷、預后監(jiān)測和尋求新的治療方法提供線索。但由于此病為罕見病，本實驗中疾病組例數(shù)較少，接下來我們將收集更多的標本，從中進行驗證，確定診斷模板的敏感度和特異度。

本研究表明，運用MB-WCX聯(lián)合MALDI-TOF MS技術，可以有效地檢測正常人與MPSⅠ患者的尿液多肽譜，并且尋找在疾病組中存在差異的多肽峰，以作為潛在的生物標志物，為MPSⅠ型的鑒別診斷及疾病機制的探索提供研究依據(jù)。

[1] Kubaski F, Osago H, Mason R W,et al. Glycosaminoglycans detection methods: Applications of mass spectrometry[J]. Molecular genetics and metabolism, 2017, 120(1-2):67-77.

[2] 江雨, 周裕林. 粘多糖貯積癥I型分子生物學及產(chǎn)前診斷研究進展 [J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2007, 03: 113-114.

[3] Lawrence R, Brown J R, Lorey F,et al. Glycan-based biomarkers for mucopolysaccharidoses [J]. Molecular genetics and metabolism, 2014, 111(2): 73-83.

[4] Clarke L A, Atherton A M, Burton B K,et al. Mucopolysaccharidosis Type I Newborn Screening: Best Practices for Diagnosis and Management[J]. The Journal of pediatrics, 2016, doi: 10.1016/j.jpeds.2016.11.036. [Epub ahead of print].

[5] Mishra S R, Shastri M, Rrmesh J. Role of rehabilitation in Hurler's syndrome[J]. Journal of back and musculoskeletal rehabilitation, 2016

[6] Zampini L, Padella L, Marchesiello R L,et al. Importance of the combined urinary procedure for the diagnosis of Mucopolysaccharidoses[J]. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 2016, 464: 165-169.

[7] Hendriksz C J, Berger K I, LAMPE C,et al. Health-related quality of life in mucopolysaccharidosis: looking beyond biomedical issues[J]. Orphanet journal of rare diseases, 2016, 11(1): 119.

[8] Mischak H, Kolch W, Aivaliotis M,et al. Comprehensive human urine standards for comparability and standardization in clinical proteome analysis[J]. Proteomics Clinical applications, 2010, 4(4): 464-478.

[9] Thomas S, Hao L, Ricke W A,et al. Biomarker discovery in mass spectrometry-based urinary proteomics[J]. Proteomics Clinical applications, 2016, 10(4): 358-370.

[10] An M, Gao Y. Urinary Biomarkers of Brain Diseases[J]. Genomics, proteomics & bioinformatics, 2015, 13(6): 345-354.

[11] Cantley L G, Colangelo C M, Stone K L,et al. Development of

Analysis of Urinary Polypeptide Pattern of MucopolysaccharidosisⅠby Magnetic Beads based Weak Cation Exchange Separation Technology and Matrix-assisted Laser Desorption-inoization Time of Flight Mass Spectrometry Technology

Xiaozhou Yuan1, Yan Meng2, Shuang Liang1,Wencan Jiang1, Sujun Ge1, Jinyan Duan1, Chengbin Wang1
(1, Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853; 2, Pediatric Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853)

ObjectiveTo analyse the urinary polypeptide pattern of mucopolysaccharidosis Ⅰ(MPS Ⅰ)Methods8 patients with MPS Ⅰ(MPS Ⅰ group) and 10 healthy people(healthy control group)were enrolled and detected urinary polypeptide pattern by magnetic beads based weak cation exchange separation（MB-WCX） technology and matrix-assisted laser desorption-inoization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) technology. ClinProtTM software was used to profile and screen the differential polypeptides in urine, and ROC curve were draw, the area under the curve(AUC), contrast sensitivity and specificity were analyzed.ResultFrom 1000 and 10000 Da of relative molecular mass, 7 significant different(P＜0.05) polypeptide were detected between MPS Ⅰ group and healthy control goup . Two peptides(m/z:3217.3,1069.6) can be potential biomarker to clarify two groups with a specificity of 87.4%and a sensitivity of 100%.ConclusionMALDI-TOF-MS combined with WCX kit technology is a convenient and high throughput method to selected polypeptide biomarker of MPS Ⅰ, providing a noninvasive new way for screening and diagnosis MPS Ⅰ.

mucopolysaccharidosis Ⅰ; magnetic beads based weak cation exchange; matrix-assisted laser desorption-inoization time of flight mass spectrometry; polypeptide, urine

R392.12

A

10. 11967/ 2017150108

R392.12

ADOI：10. 11967/ 2017150108

國家自然科學基金（No.81601852）。

苑曉舟，1993年生，女，碩士研究生，研究方向：遺傳代謝性疾病實驗室診斷。Email：yuanxiaozhou123@sina.com.

王成彬，1961年生，男，主任醫(yī)師，教授，研究方向：感染性炎癥發(fā)生機制及實驗室早期診斷。Email：wangchengbin301301@126.com.段晉燕， 1982年生，女，主管技師，研究方向：臨床檢驗相關方面。Email：cathyduanjinyan@126.com.