復(fù)方中草藥制劑抗氧化及抗腫瘤作用的研究

路子佳，黨磊，張美姿，謝瑤＊

（1.北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司；2.航天神舟生物科技集團(tuán)有限公司，北京100190）

復(fù)方中草藥制劑抗氧化及抗腫瘤作用的研究

路子佳1，黨磊2，張美姿2，謝瑤1＊

（1.北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司；2.航天神舟生物科技集團(tuán)有限公司，北京100190）

目的研究以靈芝、紅景天、蝙蝠蛾擬青霉菌粉為主要原料制成的復(fù)方中草藥膠囊的抗氧化及抗腫瘤作用。方法以不同濃度的復(fù)方中草藥膠囊進(jìn)行總抗氧化能力試驗(yàn)（ABTS）、羥自由基清除試驗(yàn)、Hacat細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平試驗(yàn)、Jurkat細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)以及Jurkat細(xì)胞凋亡試驗(yàn)。結(jié)果該復(fù)方中草藥膠囊具有顯著的抗氧化能力，在2 μg/ml劑量下，羥自由基清除率可達(dá)35.64%±0.32%，并能夠顯著降低UVB引起的Hacat細(xì)胞內(nèi)的ROS水平（P＜0.01）；在0.1 μg/ml劑量下，可以有效地抑制Jurkat細(xì)胞增殖，抑制率可達(dá)30%以上，并具有顯著的促凋亡作用（P＜0.01）。結(jié)論該復(fù)方中草藥膠囊具有一定的抗氧化及抗腫瘤的作用。

靈芝；紅景天；蝙蝠蛾擬青霉菌粉；抗氧化；抗腫瘤

伴隨著人們收入的增加、健康意識的提高，越來越多的人更加關(guān)注自身的健康，由此衍生了巨大的健康市場的需求，消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)型、老齡化的困境、政策的規(guī)范等多重因素助力著保健品行業(yè)整體規(guī)模的提升。2009年至今，保健食品行業(yè)進(jìn)入了有序發(fā)展的新時期，2015年中國保健品市場銷售額為1851億元，同比增長10.5%，但我國現(xiàn)階段保健品人均消費(fèi)水平還相對較低，2015年同期，美國、日本的人均消費(fèi)分別為140美元、105美元，均超過中國人均23.8美元水平的近5倍，提升空間大。目前，國內(nèi)缺乏具有全國知名度的保健品品牌，而國際品牌的大量涌入必將帶來國內(nèi)保健品產(chǎn)業(yè)改革，而以傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)為基礎(chǔ)的，依據(jù)中醫(yī)“治未病”理論，開發(fā)研制中草藥類保健品也將成為中國保健食品的獨(dú)特優(yōu)勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年中草藥類保健品增速僅次于運(yùn)動營養(yǎng)類（16.29%），達(dá)到12.51%。

有一部分中藥既可用于治病，又是很好的食物，即藥食同源中藥；還有一部分中藥雖不作為一般食物食用，但可作為保健食品的原料，這兩部分中藥使用安全且具有明顯功能，為研制具有顯著優(yōu)勢特色的中國保健品奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將為國際市場提供前所未有的功能獨(dú)特或優(yōu)勢顯著的產(chǎn)品，也將為人類健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出前所未有的貢獻(xiàn)[1]。中藥保健品對人體功能失調(diào)有明顯調(diào)整作用，且食用安全[2]，在公眾日常生活中扮演越來越重要的角色[3]。

靈芝（Ganoderma）為多孔科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體，性甘平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘等作用。靈芝子實(shí)體中共含有多糖類、三萜類、甾類、酸脂類、生物堿等物質(zhì)共150余總，具有提高免疫調(diào)節(jié)能力[4-5]、抑制腫瘤[6-7]、抑制氧自由基[8-9]、保肝解毒[10]等作用。紅景天（Rhodiola）為景天科大花紅景天的干燥根和根莖，性甘苦平，歸肺、心經(jīng)，具有益氣活血，通脈平喘等作用。紅景天中含有紅景天苷、酪醇、黃酮、沒食子酸乙酯、維生素C等化學(xué)成分，具有抗疲勞[11]、耐缺氧[12]、調(diào)節(jié)免疫力[13]、抑制腫瘤等作用[14-15]。蝙蝠蛾擬青霉菌（Paecilomyces hepialid）粉的化學(xué)成分主要包括蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷等核苷類物質(zhì)以及蟲草多糖、甾醇類、氨基酸、維生素和微量元素等[16-17]，具有抗疲勞、抗炎、抗癌、降糖、調(diào)節(jié)免疫力等作用[18-20]。

以紅景天、靈芝、蝙蝠蛾擬青霉菌粉為主要原料，研制出一種具有增強(qiáng)免疫力功能的復(fù)方中草藥膠囊。通過Hacat細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平試驗(yàn)、羥自由基清除試驗(yàn)、總抗氧化能力試驗(yàn)（ABTS）、Jurkat細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)以及Jurkat細(xì)胞凋亡試驗(yàn)研究該復(fù)方中草藥膠囊的抗氧化及抗腫瘤作用，為中藥復(fù)方保健制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為消費(fèi)者提供更加安全有效的保健食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

以紅景天、靈芝、蝙蝠蛾擬青霉菌粉為主要原料的復(fù)方中草藥膠囊規(guī)格為0.45 g/粒，每100g中含紅景天苷620 mg，腺苷44 mg。

靈芝，產(chǎn)地山東，采購于北京峰順康醫(yī)藥有限公司，按干燥品計(jì)算，含靈芝多糖以無水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)，不得少于0.90%；按干燥品計(jì)算，含三萜及甾醇以齊墩果酸（C30H48O3）計(jì)，不得少于0.50%，符合《中華人民共和國藥典》2015版一部中對靈芝的要求。

紅景天，產(chǎn)地西藏，采購于北京峰順康醫(yī)藥有限公司，按干燥品計(jì)算，含紅景天苷（C14H20O7）不得少于0.50%，符合《中華人民共和國藥典》2015版一部中對紅景天的要求。

蝙蝠蛾擬青霉菌粉，來源于江蘇神華藥業(yè)有限公司，其多糖（以無水葡萄糖計(jì)）≥4.0%，腺苷≥2 mg/g。

其制備方法為：將符合中國藥典質(zhì)量要求的靈芝、紅景天進(jìn)行粉碎，按1:0.7質(zhì)量比混合，加10倍量水煎煮提取2次（第一次煎煮前先浸泡30 min），每次2 h，過濾獲得水提取液，進(jìn)行減壓濃縮、真空干燥獲得干浸膏，粉碎過篩后，按2.62:1.0:0.85質(zhì)量比與蝙蝠蛾擬青霉菌粉、糊精混合，混合20 min得混合粉A，按配方投料量的0.67%加入硬脂酸鎂混合20 min后，得總混合粉，進(jìn)行填充膠囊、拋光、包裝檢驗(yàn)等工序制成復(fù)方中草藥膠囊。

1.2 主要試劑

人體永生化上皮細(xì)胞（Hacat細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞） 北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；羥自由基測試盒、Annexin-FITC試劑盒 南京建成生物工程研究所；CCK-8檢測試劑盒 DOJINDO公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、Antibiotic-antimycotic、0.25% Trypsin Life Technologies 公司。

1.3 主要儀器

THERMO細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、Bio-rad酶標(biāo)儀、THERMO熒光分析儀、THERMO生物安全柜、UVB輻射燈（波峰為312nm Spectroline）、BT25S型十萬分之一電子分析天平等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理及細(xì)胞培養(yǎng)

取50 μg復(fù)方中草藥膠囊內(nèi)粉末，加入1 mL75%的乙醇，超聲處理2 h，取上清液，0.2 μm濾膜過濾后備用。

Hacat細(xì)胞培養(yǎng)：使用DMEM培養(yǎng)基，含10%的FBS及1%的抗細(xì)菌和真菌的抗生素，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)：使用RPMI1640培養(yǎng)基，含10%的FBS及1%的抗細(xì)菌和真菌的抗生素，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 活性氧（ROS）試驗(yàn)

建立紫外線（UVB）照射的HacaT細(xì)胞損傷模型，通過樣品對UVB照射后Hacat細(xì)胞中ROS濃度的影響，從而驗(yàn)證樣品對人體上皮細(xì)胞的UVB氧化損傷的防護(hù)作用。

Hacat細(xì)胞以4×104/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%以上時進(jìn)行UVB輻照處理。設(shè)5個試驗(yàn)組：陰性對照組（-UVB）、UVB組、UVB+樣品組（樣品濃度分別為0.1、0.2、0.4 μg/mL）。細(xì)胞接種24 h后，吸去培養(yǎng)液，加入PBS洗一遍后，再把PBS去除干凈，將細(xì)胞放入紫外輻照箱中進(jìn)行UVB處理，輻照劑量為10 mJ/cm2（輻照時間：5 s），陰性對照組不進(jìn)行輻照。取出細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，UVB+樣品組加入含不同濃度的樣品溶液的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后使用ROS檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測。熒光信號使用熒光分析儀進(jìn)行，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm。同時，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白含量，從而對結(jié)果進(jìn)行校正。

1.4.3 羥自由基清除試驗(yàn)

羥自由基是活性氧中最活潑的自由基之一，它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)，可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)解聚、聚合，核酸斷裂和多糖裂解等生化過程，引發(fā)組織細(xì)胞病變，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。減少此類自由基，可達(dá)到預(yù)防衰老，心血管疾病及抗癌等作用。使用羥自由基測試盒進(jìn)行樣品羥自由基清除能力的檢測，設(shè)置5個試驗(yàn)組：空白組（0.4 mL ml蒸餾水）、標(biāo)準(zhǔn)組（0.2 mL蒸餾水+0.2 mL 0.03% H2O2標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液）、對照組（0.2 mL蒸餾水+0.2 mL底物應(yīng)用液）、樣品組（0.2 mL樣品溶液+0.2 mL底物應(yīng)用液、樣品液濃度分別為0.5、1.0、2.0 μg/mL），具體操作方法參見羥自由基測試盒的說明書，酶標(biāo)儀540 nm波長測定光吸收。

1.4.4 總抗氧化能力試驗(yàn)

按總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法）要求配置ABTS工作液及過氧化氫酶工作液，trolox為陽性對照組，各樣品組濃度分別為0.5、1.0、2.0 μg/mL。按試劑盒說明書要求將ABTS工作液、過氧化氫酶工作液、樣品及trolox濃度梯度樣品加入到96孔板中，室溫孵育6 min后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，檢測波長為405 nm。

1.4.5 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

Jurkat細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板中，加入含有不同濃度樣品溶液的培養(yǎng)基（樣品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1 μg/mL），分別處理48 h、96 h后，離心去除上清液，加入200 μL含10% CCK-8的新培養(yǎng)液，37 ℃溫水浴30 min左右，取上清于96孔板中，使用酶標(biāo)儀450 nm波長檢測上清液的OD值。

1.4.6 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

Jurkat細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板中，加入含有不同濃度樣品溶液的培養(yǎng)基（樣品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1 μg/mL），處理48 h后，使用Annexin-FITC試劑盒進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀（FACS）進(jìn)行檢測分析。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±SD表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行齊性檢驗(yàn)，并作t檢驗(yàn)和方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品對Hacat細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

Hacat細(xì)胞內(nèi)ROS水平試驗(yàn)結(jié)果詳見表1。

表1 復(fù)方中草藥膠囊對Hacat細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響( ±SD)Table 1 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the level of ROS in Hacat cells ( ±SD)

外部環(huán)境可引起體內(nèi)ROS水平的增加，如UV、抽煙以及身體衰老等原因。由表1可知，使用UVB對Hacat細(xì)胞進(jìn)行照射處理，與-UVB組比較，UVB照射使細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，加入樣品溶液后的各組細(xì)胞中ROS含量明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05），且與樣品劑量有一定的相關(guān)性，當(dāng)劑量達(dá)到0.2 μg/mL或更高時，加入樣品的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平與不加樣品的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平相比，其差異具有極其顯著性（P＜0.01）。表明該復(fù)方中草藥膠囊可以有效降低UVB引起的細(xì)胞中ROS的水平。

2.2 樣品的羥自由基清除能力

羥自由基清除試驗(yàn)結(jié)果詳見圖1。

圖1 復(fù)方中草藥膠囊對羥自由基清除能力的影響( ±SD)Figure 1 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the hydroxy radical scavenging capacity ( ±SD)

由圖1可知，該復(fù)方中草藥膠囊具有一定的羥自由基清除能力，并且表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。在2.0 μg/mL劑量下，羥自由基清除率可達(dá)到35.64%±0.32%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥自由基活性能力。

2.3 樣品的總抗氧化能力

總抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果詳見圖2

圖2 復(fù)方中草藥膠囊的總抗氧化能力( ±SD)Figure 2 The total antioxidant capacity of the compound Chinese herbals capsule ( ±SD)

在正常代謝或光老化過程中細(xì)胞會產(chǎn)生大量活性氧，如不能及時清除，會引起皮膚細(xì)胞下游一系列的放映，最終引起皮膚老化。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產(chǎn)生會被抑制。Trolox是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相近的抗氧化能力，可用作其它抗氧化物總抗氧化能力的參照品，其它物質(zhì)的抗氧化能力用其抗氧化能力與Trolox相比的倍數(shù)來表示。

由圖2可知，加入樣品后，ABTS+的產(chǎn)生明顯被抑制，樣品的抗氧化能力與濃度呈線性關(guān)系。在2.0 μg/mL劑量下，樣品抗氧化能力可達(dá)到Trolox的2.07±0.03倍。表明該復(fù)方中草藥膠囊具有顯著的抗氧化能力。

2.4 樣品對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

Jurkat細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

表2 復(fù)方中草藥膠囊對Jurkat細(xì)胞增殖率的影響( ±SD)Table 2 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the proliferation inhibition rate of the Jurkat cell

由表2可知，0.025、0.05、0.1 μg/mL三個劑量組對Juarkat細(xì)胞具有增值抑制作用，且隨濃度的增高，抑制作用也相應(yīng)增強(qiáng)。在0.1 μg/mL濃度下，作用96 h，高劑量組與陰性對照組相比，抑制率可高達(dá)30%以上。表明該復(fù)方中草藥膠囊可以有效抑制Jurkat細(xì)胞的增殖。

2.5 樣品對Jurkat細(xì)胞凋零的影響

Jurkat細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果詳見圖3。

圖3 復(fù)方中草藥膠囊對Jurkat細(xì)胞增殖率的影響( ±SD)Figure 3 Effect of the compound Chinese herbals capsule on the apoptosis rate of the Jurkat cell ( ±SD)

由圖3可知，當(dāng)達(dá)到一定濃度時，樣品對Juarkat細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，且隨濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率也隨之增高。在0.1 μg/mL濃度下，作用48 h，細(xì)胞早期凋亡率由對照組的10.42%增加至14.29%，具有極其顯著性差異（P＜0.01）。表明該復(fù)方中草藥膠囊可以有效促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的增殖凋亡。

3 結(jié)論

本文從細(xì)胞試驗(yàn)方面對以紅景天、靈芝、蝙蝠蛾擬青霉菌粉為主要原料的復(fù)方中草藥膠囊進(jìn)行抗氧化作用、抗腫瘤作用的研究。以0.1、0.2、0.4 μg/mL劑量的該復(fù)方中草藥膠囊處理經(jīng)UVB照射的Hacat細(xì)胞，能顯著降低由UVB引起的細(xì)胞內(nèi)ROS含量的水平，當(dāng)劑量達(dá)到0.2 μg/mL或更高時，UVB+樣品組與UVB組比較，其差異具有極其顯著性（P＜0.01）；以0.5、1.0、2.0 μg/mL劑量的該復(fù)方中草藥膠囊進(jìn)行羥自由基清除率檢測及總抗氧化能力檢測，在2.0 μg/ mL劑量下，羥自由基清除率可達(dá)到35.64%±0.32%，總抗氧化能力可達(dá)到Trolox的2.07±0.03倍；以0.025、0.05、0.1 μg/ mL劑量的該復(fù)方中草藥膠囊處理Jurkat細(xì)胞，在0.1 μg/mL濃度下，作用48 h，細(xì)胞早期凋亡率由對照組的10.42%增加至14.29%，具有極其顯著性差異（P＜0.01），作用96 h，細(xì)胞增殖抑制率可高達(dá)30%以上。由此可見，復(fù)方中草藥膠囊在細(xì)胞水平具有顯著地抗氧化作用及抗腫瘤作用，且隨濃度的增加，作用也逐漸越強(qiáng)。本研究為中藥復(fù)方保健制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為消費(fèi)者提供更加安全有效的保健食品具有重要意義。

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Study on anti-oxidation e ff ect and anti-tumor e ff ect of the compound Chinese herbals

Lu Zijia1, Dang Lei2, Zhang Meizi2, Xie Yao1*
(1.Beijing dawn Aerospace Bio-Tech Co. Ltd; 2. Shenzhen Space Biotechnology Group, Bejing 100190, China)

ObjectiveTo study the anti-oxidation effect and anti-tumor effect of the compound Chinese herbals capsule, the capsule was made up of ganoderma, rhodiola, paecilomyces hepialid powder and other materials.MethodsWith different concentrations of t the compound Chinese herbals capsule, total antioxidant capacity test (ABTS), hydroxy radical scavenging test, the level test of reactive oxygen species (ROS) in Hacat cells, Jurkat cell proliferation inhibition test and Jurkat cell apoptosis test were conducted respectively in order to assess the anti-oxidation effect and anti-tumor effect.ResultsThe compound Chinese herbals capsule has obvious antioxidant ability，under the dose of 2 μg/ml, the scavenging rate of hydroxyl radical was 35.64%±0.32%, and could significantly reduce the level of ROS induced by UVB in Hacat cells(P＜0.01); under the dose of 0.1 μg/ml, the proliferation of Jurkat cells could be inhibited effectively, the inhibition rate could more than 30%, and the compound Chinese herbals capsule could significantly promote the apoptosis of the Jerkat cell (P＜0.01).ConclusionThe compound Chinese herbals capsule has the function of anti-oxidation and anti-tumor.

Ganoderma; Rhodiola; Paecilomyces hepialid powder; Anti-oxidation; Anti-tumor

R284

A

10. 11967/ 2017150113

R284

A DOI：10. 11967/ 2017150113

路子佳(1985-)，女，工程師，碩士，研究方向：保健食品研究與開發(fā)。

?通信作者：謝瑤(1982-)，女，工程師，博士，研究方向：保健食品研究與開發(fā)。Email：30993444@qq.com.