核桃葉片內(nèi)多酚黃酮類成分對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

宋靜武，殷德松，趙弟廣,齊貝貝，陳瑩瑩，周玲，彭磊

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院, 云南 昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院, 云南 昆明 650201；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所,河南 鄭州 450009)

核桃葉片內(nèi)多酚黃酮類成分對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

宋靜武1，殷德松1，趙弟廣3,齊貝貝1，陳瑩瑩1，周玲2，彭磊1

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院, 云南 昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院, 云南 昆明 650201；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所,河南 鄭州 450009)

作為植物體內(nèi)重要的次生代謝物,植物多酚對(duì)研究植物防御極端環(huán)境的基礎(chǔ)有重要作用。為了了解核桃內(nèi)多酚類成分對(duì)不同寒冷溫度響應(yīng)的含量變化，采用0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃幾個(gè)低溫進(jìn)行處理，研究了在不同時(shí)間核桃葉片多種成分(多酚、黃酮、花青素、還原型VC)對(duì)低溫脅迫響應(yīng)的規(guī)律。結(jié)果表明：核桃葉片黃酮、茶多酚、花青素含量在不同低溫脅迫下呈先降后升的變化規(guī)律，還原型VC含量在不同的低溫脅迫下呈先升后降的變化規(guī)律；黃酮含量在-8℃脅迫24 h后達(dá)最高值23.64 mg/g，多酚含量在-6℃脅迫72 h后達(dá)到最高值36.71%，花青素含量在-6℃脅迫48 h后達(dá)到最高值5.22 mg/g，還原型VC含量在-2℃脅迫72 h后達(dá)到最高值193.60 mg/100g。這些結(jié)果表明，核桃葉片內(nèi)源物質(zhì)含量和低溫脅迫有較強(qiáng)的相關(guān)性。

核桃葉片；低溫脅迫；黃酮；多酚；花青素；還原型VC

核桃(JuglansregiaL.)是我國(guó)重要的藥源植物，其青皮和葉在中藥方面均有重要價(jià)值。近些年來，關(guān)于核桃內(nèi)黃酮和多酚類物質(zhì)的研究一直在進(jìn)行。通過對(duì)核桃的全基因組測(cè)序，Martínez-García等發(fā)現(xiàn)了可以合成非結(jié)構(gòu)性多酚的基因， 并證實(shí)了這些基因的多樣性[1]。 S Eghbaliferiz 和M Iranshahi總結(jié)了黃酮、多酚這些物質(zhì)的良好的抗氧化機(jī)能及其分解金屬離子的機(jī)制[2]。

低溫是影響植物地理分布和生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要生態(tài)因子，低溫會(huì)影響植物的生理生化過程并且通過生理生化變化給予植物抗寒能力,低溫對(duì)植物抗寒性的影響要遠(yuǎn)大于其他環(huán)境因素[3]。在年度零點(diǎn)以下的天氣,植物的自然遷移并不受低溫脅迫的影響,但低溫仍然是寒冷氣候下造成植株直接傷害的最顯著的非生物脅迫影響因子[4]。低溫會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)抗逆基因表達(dá)，使細(xì)胞膜脂成分發(fā)生變化，激活活化抗氧化系統(tǒng)和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等，從而緩解低溫對(duì)其造成的機(jī)械損傷和生理傷害。核桃葉片中含有大量的黃酮、多酚、花青素和還原型VC等物質(zhì)，而這些物質(zhì)被證實(shí)在不同植物中,會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上受到低溫脅迫的影響。高丹丹發(fā)現(xiàn)溫度驟降處理后, 3種楊樹(PopulusL.)葉片中的總酚、黃酮、木質(zhì)素的含量均無顯著變化,但研究也發(fā)現(xiàn)抗凍性較弱的中綏楊(P.deltoides×P.cathangana)葉片中的總酚和木質(zhì)素含量較低[5]。Zhang C等通過對(duì)葡萄(VitisviniferaL.)在4°C 和25°C不同溫度下處理24 h、48 h、72 h 和 96 h，發(fā)現(xiàn)在葡萄表皮中花青素含量有顯著提高，而多酚與黃酮類物質(zhì)含量卻有所下降[6]。王勇等對(duì)核桃1 a生枝條的抗寒性指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定分析，對(duì)抗寒性指標(biāo)進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，品種間抗寒性差異較大時(shí)可用電導(dǎo)率法測(cè)定，此法既簡(jiǎn)便又節(jié)省費(fèi)用；抗寒性差異小時(shí)可用總酚、黃酮類物質(zhì)、可溶性糖和淀粉含量進(jìn)行抗寒性綜合鑒定[7]。黃酮、多酚、花青素、還原型VC這些內(nèi)源性物質(zhì)的變化可能因?yàn)橛|動(dòng)了控制調(diào)節(jié)這些物質(zhì)的多個(gè)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)了不同基因在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上的表達(dá)[8]。大量研究表明，在一定溫度范圍條件影響下，植物葉片均具有較強(qiáng)的生理調(diào)節(jié)能力，在低溫脅迫下，對(duì)低溫脅迫敏感的植物細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生加速，而清除活性氧的能力下降，導(dǎo)致活性氧水平升高，這同時(shí)會(huì)使植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中抗氧化劑含量(多酚、黃酮、VC等物質(zhì))和抗氧化酶活性提高[9]?；钚匝跏巧婕半娮觽鬟f生化過程中的正常代謝產(chǎn)物，必須及時(shí)清除，保持一定的低水平的動(dòng)態(tài)平衡，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受傷害，嚴(yán)重時(shí)死亡[10]。多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有鄰二酚羥基，容易被氧化，且對(duì)活性氧等自由基有較強(qiáng)的捕捉能力。在溫度初降時(shí)保護(hù)酶系實(shí)施保護(hù)作用，而隨著溫度的持續(xù)下降，保護(hù)酶系受低溫傷害而保護(hù)功能降低，植物受到低溫寒害[11]。酶活性降低導(dǎo)致調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成受到阻礙，因此低溫脅迫與核桃葉片內(nèi)黃酮、多酚、花青素等物質(zhì)含量的變化是密切相關(guān)的[12]。植物體內(nèi)源物質(zhì)變化的研究是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，是十分重要的，對(duì)基礎(chǔ)的研究也能夠給分子研究提供更多數(shù)據(jù)支持。近年來，分子研究越來越發(fā)達(dá)，反而越來越需要基礎(chǔ)試驗(yàn)研究結(jié)果來支持試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)。然而，目前對(duì)核桃葉片抗寒性的基礎(chǔ)研究還比較貧乏。因此,以核桃葉片為供試材料, 研究葉片內(nèi)各種抗氧化物質(zhì)對(duì)核桃抗寒性的影響,旨在為黃酮多酚類物質(zhì)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用和相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年6—7月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院果樹生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。此時(shí)是樹體葉片、果實(shí)速生期，適于試驗(yàn)材料的采摘和收集，同時(shí)也為后續(xù)抗逆基因在極端低溫條件下表達(dá)量的研究提供數(shù)據(jù)參考。

試驗(yàn)材料為采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山果園新鮮漾濞泡核桃葉梢對(duì)生葉片，樹齡12 a，處于盛果期，樹高5 m，沒有嚴(yán)重病害，長(zhǎng)勢(shì)良好。采集試驗(yàn)材料后在恒溫冰箱內(nèi)處理后進(jìn)行殺青、曬干，研磨成粉狀進(jìn)行保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度處理 試驗(yàn)設(shè)0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃的5個(gè)脅迫溫度水平，每個(gè)水平溫度分別脅迫24 h、48 h、72 h。每次處理重復(fù)3次。對(duì)照溫度(CK)為室溫(25℃)。將不同低溫、不同處理時(shí)間的樣品分別編號(hào)，并做好標(biāo)記。

1.2.2 化學(xué)成分含量測(cè)定方法 還原型VC含量測(cè)定采用靛酚法，黃酮類化合物含量測(cè)定使用三氯化鋁比色法，茶多酚類物質(zhì)含量測(cè)定使用酒石酸鐵比色法，花青素含量測(cè)定使用分光光度法[13]。使用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)黃酮含量的影響

核桃葉片采摘后相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理后黃酮的含量變化見表1。

表1 相同溫度下不同時(shí)間處理核桃葉片采摘后黃酮平均含量Table 1 The content of flavonoids of from Juglans regia leaves after harvest in different time periods at the same temperature mg/g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表1可知，在對(duì)照溫度下 (CK),黃酮含量平均值為16.94 mg/g, 并且在一定時(shí)間變化內(nèi)(24 h,48 h和72 h)保持穩(wěn)定；在0℃時(shí)隨著時(shí)間變化黃酮含量先降低后升高，并在72 h時(shí)達(dá)到最高值14.87 mg/g；-2℃時(shí)，黃酮變化規(guī)律與0℃時(shí)相同，在72 h時(shí)達(dá)到最高值17.28 mg/g， -2℃時(shí)的48 h處理與72 h處理相比差異顯著；-4℃時(shí)，黃酮含量先升高后降低，在48 h時(shí)達(dá)到最高值16.44 mg/g，-4℃時(shí)72 h 與24 h、48 h處理相比較差異顯著；-6℃時(shí)，黃酮含量隨時(shí)間降低，并在24 h處理時(shí)達(dá)到最高值22.62 mg/g；-8℃時(shí)，黃酮含量隨時(shí)間降低，并在24 h處理時(shí)達(dá)到最高值23.64 mg/g，-8℃時(shí)24 h與48 h、72 h處理相比差異顯著。由此可以看出，隨著時(shí)間推移，越低的溫度核桃黃酮含量最大值出現(xiàn)的時(shí)間越早，說明核桃內(nèi)黃酮對(duì)寒冷的響應(yīng)溫度越低響應(yīng)需要的時(shí)間越短。其中，-8℃時(shí)48 h和72 h處理的黃酮含量相比較變化不大。這說明這個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)葉片細(xì)胞組織已經(jīng)開始被破壞，黃酮含量趨于穩(wěn)定。

核桃葉片采摘后相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理后黃酮含量的變化見表2。

表2 相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理核桃葉片采摘后黃酮平均含量Table 2 The content of flavonoids of from Juglans regia leaves after harvest in different temperature at the same time mg/g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表2可知，低溫脅迫24 h后, 黃酮的含量在0℃處理達(dá)到了最低值12.48 mg/g,然后隨著溫度降低有了極為明顯的回升。其中，黃酮含量在-8℃處理達(dá)到的最高值與在0℃處理達(dá)到的最低值相比，高出11.16 mg/g。-6℃處理后核桃葉片細(xì)胞內(nèi)黃酮含量與0℃、-2℃、-4℃處理后黃酮含量相比，差異顯著；-8℃處理后核桃葉片細(xì)胞內(nèi)黃酮含量與CK、0℃、-2℃、-4℃處理后黃酮含量相比，差異顯著。低溫脅迫48 h后，黃酮含量在0℃達(dá)到最低值10.22 mg/g,隨著溫度變化黃酮含量在小范圍內(nèi)浮動(dòng)，黃酮在0℃達(dá)到的最低值與48 h其他溫度的黃酮數(shù)值相比,差異顯著。低溫脅迫72 h后，黃酮含量變化先降后升然后再降,到-6℃后趨于穩(wěn)定，黃酮含量在-4℃時(shí)達(dá)到最低值12.28 mg/g。這個(gè)最低值與CK、-2℃處理的黃酮含量相比，差異顯著。由此可以看出,在24 h短時(shí)間處理后溫度越低黃酮含量變化越明顯，而經(jīng)過48 h和72 h長(zhǎng)時(shí)間處理后黃酮含量有變化但變化穩(wěn)定在一個(gè)范圍內(nèi)。

這些結(jié)果表明，采摘后核桃葉片中黃酮的含量在低溫脅迫過程中，時(shí)間和溫度都是影響葉片抗寒內(nèi)源物質(zhì)黃酮變化的條件。在低溫條件下，植物自身抗寒系統(tǒng)體系開始運(yùn)轉(zhuǎn)，抗寒相關(guān)物質(zhì)含量提升；而在過低溫度或者過久的時(shí)間處理后黃酮含量并無明顯變化，由此推斷處理時(shí)間較長(zhǎng)和處理溫度過低時(shí)均會(huì)造成植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物理?yè)p傷，自身抗寒系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致相關(guān)抗寒物質(zhì)含量無明顯變化。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，尉芹等采用不同溶劑提取核桃葉中的抗氧化物質(zhì)并發(fā)現(xiàn)核桃葉中提取物均有很強(qiáng)的抗氧化作用，核桃葉提取物的抗氧化有效成分主要是單寧、黃酮及萜類化合物[14]。胡博路等研究發(fā)現(xiàn)，核桃葉能有效地清除O2-及·OH[15]。張運(yùn)紅等發(fā)現(xiàn)冷害脅迫后，噴施竹葉黃酮后的辣椒(CapsicumannuumL.)葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著高于對(duì)照，說明噴施竹葉黃酮能提高其抗寒性[16]。這些結(jié)論都有力說明核桃葉片自身有很強(qiáng)的抗寒性，而抗寒性的來源是因?yàn)槿~片內(nèi)含有大量的黃酮類等物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果說明，黃酮在核桃受到低溫脅迫的情況下，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速變化來響應(yīng)寒冷。

2.2 低溫脅迫對(duì)核桃多酚含量的影響

核桃葉片采摘后相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理后多酚含量的變化見表3。

表3 相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理核桃葉片采摘后多酚平均含量Table 3 The content of polyphenols of from Juglans regia leaves after harvest in different time periods at the same temperature %

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表3可知，在對(duì)照溫度下 (CK),多酚含量在一定時(shí)間范圍內(nèi)(24 h,48 h和72 h)有小幅度的下降而后升高，在72 h達(dá)到最高值33.85%。在0℃處理下，多酚含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈大幅度下降趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到最高值29.49%，0℃處理24 h與48 h、72 h間多酚含量差異顯著。在-8℃處理下，多酚含量變化與0℃時(shí)變化相似，并在24 h達(dá)到最高值26.48%， -8℃處理24 h與48 h、72 h間多酚含量差異顯著。在-2℃處理下，隨著時(shí)間推移核桃葉片多酚含量變化趨勢(shì)為先升高后降低，48 h處理時(shí)多酚含量達(dá)到最高值26.48%，-2℃處理下48 h與24 h、72 h相比多酚含量差異顯著。在-4℃處理下，多酚含量變化與-2℃時(shí)變化相似，48 h處理時(shí)含量達(dá)到最高值21.09%，-4℃處理下48 h與24 h、72 h相比多酚含量差異顯著。而在更低溫度 (-6℃)處理下，多酚含量卻有先下降后升高的趨勢(shì)，并在脅迫72 h后達(dá)到最高36.71%，-6℃處理下72 h與24 h、48 h相比多酚含量差異顯著。

核桃葉片采摘后相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理后多酚的變化見表4。

表4 相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理核桃葉片采摘后多酚平均含量Table 4 The content of polyphenols of from Juglans regia leaves after harvest in different temperature at the same time %

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表4可知，低溫脅迫24 h后，多酚含量先升后降，然后又有所升高。多酚含量在0℃達(dá)到了最高值29.49%，與多酚在-2℃達(dá)到的最低值13.00%相比高了16.49個(gè)百分點(diǎn)。0℃處理的核桃葉片細(xì)胞內(nèi)多酚含量與-2℃、-4℃、-6℃處理的多酚含量相比，差異顯著。低溫脅迫48 h后，-2℃處理時(shí)多酚含量達(dá)到最高值26.48%，與多酚在-8℃達(dá)到的最低值8.72%相比高了17.76個(gè)百分點(diǎn)，其中-2℃的多酚含量與CK、0℃、-4℃、-6℃、-8℃的多酚含量相比差異顯著。在低溫脅迫72 h后,多酚含量先降低后升高，最后在-8℃下達(dá)到10.78%；其中，多酚含量在-6℃脅迫后達(dá)到的含量最高值36.71%與在-8℃脅迫達(dá)到的最低值10.78%相比，高出25.93個(gè)百分點(diǎn)。-6℃時(shí)的多酚含量與0℃、-2℃、-4℃、-8℃的多酚含量相比較差異顯著。

這些結(jié)果表明，采摘后核桃葉片中多酚的含量隨著溫度降低而大幅度波動(dòng), 說明溫度對(duì)核桃內(nèi)多酚含量變化影響很大，72 h處理-6℃時(shí)多酚含量達(dá)到最高值， 而-8℃處理使多酚含量顯著降低。這些結(jié)果說明，當(dāng)植物轉(zhuǎn)入0℃時(shí)植物本身抗寒系統(tǒng)開始相應(yīng)的運(yùn)作，而-6℃是一個(gè)核桃凍害的臨界值，-8℃低溫經(jīng)過48 h和72 h長(zhǎng)時(shí)間處理已經(jīng)對(duì)植物組織本身造成不可逆的傷害。宋宇琴等發(fā)現(xiàn)不同品種核桃枝條中多酚和黃酮類物質(zhì)含量最高的品種抗寒能力最強(qiáng)[17]。冷平等發(fā)現(xiàn)，原產(chǎn)日本中部的栽培柿(DiospyroskakiL.f)‘富有’和原產(chǎn)于亞熱帶臺(tái)灣的臺(tái)東豆柿在自然低溫條件下多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量均有明顯的提高，表明柿屬植物樹體內(nèi)酚類物質(zhì)組成及含量與其抗寒力的獲得有一定關(guān)系[18]。李春明等發(fā)現(xiàn)楊樹(PopulusL.)葉片中總酚、黃酮、縮合單寧、水楊苷、特里楊苷含量的季節(jié)動(dòng)態(tài)與最低氣溫變化之間呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)[19]。這說明低溫會(huì)提高葉片內(nèi)多酚物質(zhì)的含量來響應(yīng)抗寒生理，且核桃作為葉片內(nèi)多酚含量較高的樹種，更能抵抗低溫脅迫，這也說明為什么-6℃脅迫48 h后葉片內(nèi)多酚含量依然會(huì)升高。

2.3 低溫脅迫對(duì)花青素含量的影響

核桃葉片采摘后相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理后花青素含量的變化見表5。

表5 相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理核桃葉片采摘后花青素平均含量Table 5 The content of anthocyanin of from Juglans regia leaves after harvest in different time periods at the same temperature mg/g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表5可知，在對(duì)照溫度下 (CK),花青素含量在一定時(shí)間變化內(nèi)(24 h,48 h和72 h)有小幅度的升高而后下降。0℃和-4℃內(nèi)花青素含量隨時(shí)間并沒有顯著變化，-2℃內(nèi)花青素含量也沒有顯著變化，但是隨著時(shí)間的推移有下降的趨勢(shì)。在較低溫度的處理下(-6℃和-8℃)，花青素含量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化，并在處理48 h后分別達(dá)到了最高值5.22 mg/g和3.91 mg/g。由此可以看出，-6℃或-8℃是花青素相應(yīng)抗寒的一個(gè)臨界溫度。

核桃葉片采摘后相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理后花青素含量的變化見表6。

表6 相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理核桃葉片采摘后花青素平均含量Table 6 The content of anthocyanin of from Juglans regia leaves after harvest in different temperature at the same time mg/g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表6可知，在低溫脅迫24 h處理中，花青素含量變化處于一個(gè)小幅下降的趨勢(shì)，其中-6℃花青素含量達(dá)到最低值2.25 mg/g，與對(duì)照CK相比差異顯著。在低溫脅迫48 h處理中，花青素的含量在-2℃(2.78 mg/g)比對(duì)照CK(4.96 mg/g)有了明顯下降,然后隨著溫度降低又有了極為明顯的回升 (在-6℃時(shí)達(dá)到了5.22 mg/g)，并在更低溫處理下下降至較低水平。其中，花青素含量在-6℃脅迫48 h后達(dá)到的最高值與在-2℃達(dá)到的最低值相比，高出2.44 mg/g，-2℃花青素達(dá)到的最低值與對(duì)照CK相比差異顯著。在低溫脅迫72 h處理中，花青素含量呈先降低后升高再降低的變化，并在-8℃達(dá)到最低值1.90 mg/g，-8℃與CK、0℃、-4℃、-6℃的花青素含量存在顯著差異。

與多酚含量變化類似，花青素含量在0到-4℃區(qū)間內(nèi)，不同處理時(shí)間均呈現(xiàn)小幅度波動(dòng)和緩慢下降趨勢(shì)。在-6℃處理72 h和48 h時(shí)花青素含量均達(dá)到處理組內(nèi)最高值， 而-8℃處理使花青素含量顯著降低。由此推斷，-6℃可能是花青素類物質(zhì)響應(yīng)低溫脅迫的一個(gè)臨界溫度，低于-6℃后花青素含量隨著溫度和時(shí)間的相互作用逐漸趨于穩(wěn)定。花青素含量不同也說明植物葉片組織發(fā)生了不同程度的損傷。這些結(jié)果說明，花青素響應(yīng)低溫脅迫。

2.4 低溫脅迫對(duì)還原型VC含量的影響

核桃葉片采摘后相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理后還原型VC含量的變化見表7。

表7 相同溫度內(nèi)不同時(shí)間處理核桃葉片采摘后還原型VC平均含量Table 7 The content of reducing vitamin C of from Juglans regia leaves after harvest in different time periods at the same temperature mg/100g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表7可知，在對(duì)照溫度下 (CK),還原型VC含量在一定時(shí)間內(nèi)(24 h,48 h和72 h)先升高而后下降。0℃處理，還原型VC含量也出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中48 h處理還原型VC含量達(dá)到最高值161.33 mg/100g，與24 h、72 h處理相比差異顯著。而在-2℃處理下，還原型VC含量隨著時(shí)間的變化有所提升，從24 h的99.73 mg/100g 升至72小時(shí)的最高值193.60 mg/100g。-4℃處理后，還原型VC含量先降低后升高，在72 h時(shí)達(dá)到最高值134.93 mg/100g，與24 h、48 h時(shí)相比差異顯著。值得一提的是，在-6℃處理下，還原型VC含量隨時(shí)間推移大幅度下降，至48 h后趨于穩(wěn)定，其中還原型VC含量在24 h時(shí)達(dá)到最高值161.33 mg/100g。而在-8℃處理下，還原型VC含量隨時(shí)間推移逐漸下降，24 h時(shí)達(dá)到最大值140.8 mg/100g。-6℃與-8℃還原型VC含量變化趨勢(shì)相似，說明在較低溫度下核桃葉片組織已經(jīng)出現(xiàn)損傷，處理48 h后還原型VC含量基本趨于穩(wěn)定。

核桃葉片采摘后相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理還原型VC含量的變化見表8。

表8 相同時(shí)間內(nèi)不同溫度處理核桃葉片采摘后還原型VC平均含量Table 8 The content of reducing vitamin C of from Juglans regia leaves after harvest in different temperature at the same time mg/100g

注：不同字母表示 Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)達(dá) 5%顯著水平。

由表8可知，在低溫脅迫24 h處理中, 還原型VC含量在較高溫度處理下均無明顯變化,然后隨著溫度降低(-6℃和-8℃)有了極為明顯的回升，在-6℃達(dá)到最高值161.33 mg/100g，-6℃還原型VC含量與CK、0℃、-2℃、-4℃處理相比差異顯著。在低溫脅迫48 h中,還原型VC的含量隨著處理溫度的降低呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中-2℃處理時(shí)還原型VC含量達(dá)到最大值184.80 mg/100g，與-4℃、-6℃、-8℃處理相比差異顯著。在低溫脅迫72 h中，還原型VC含量隨著處理溫度的降低呈現(xiàn)出與48 h處理類似的先升高后降低的變化趨勢(shì)，并在-2℃處理達(dá)到最高值193.60 mg/100g，與CK、0℃、-6℃、-8℃處理相比差異顯著。這些結(jié)果表明，還原型VC平均含量在不同處理時(shí)間下，不同溫度對(duì)其含量有著極大的影響。其中,在24 h脅迫下，還原型VC含量在-6℃時(shí)達(dá)到最高值，而在48 h和72 h脅迫下，還原型VC含量在-2℃時(shí)達(dá)到最高值。這也說明在溫度和時(shí)間的相互疊加作用下最高值的點(diǎn)會(huì)隨著這個(gè)疊加影響推移。在短時(shí)間內(nèi)處理，葉片內(nèi)抗寒機(jī)制在極低溫度 (-6℃)下仍然可以促使還原型VC含量迅速變化以此來抵抗低溫環(huán)境。然而，長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理使葉片產(chǎn)生了較弱的低溫耐受性，表現(xiàn)為-2℃時(shí)的還原型VC含量就急速上升。-6℃和-8℃同時(shí)間段內(nèi)的低溫處理還原型VC含量變化維持較低水平，據(jù)推測(cè)是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間低溫葉片已受到嚴(yán)重的機(jī)械損傷。Riverapastrana D等也在木瓜[Chaenomelessinensis(Thouin) Koehne]中發(fā)現(xiàn)了低溫處理對(duì)于VC等抗氧化物含量變化的影響[20]。說明核桃葉內(nèi)還原型VC含量的變化是為了提高葉片內(nèi)的抗氧化性，以此來響應(yīng)低溫脅迫。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，在核桃葉片分別經(jīng)過0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃低溫水平下脅迫不同時(shí)間后，其多酚類物質(zhì)、黃酮、花青素、還原型VC含量均會(huì)隨著溫度降低以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)有不同程度的升高和降低。其中，-6℃或-8℃是核桃葉片內(nèi)源物質(zhì)不再改變的臨界溫度。當(dāng)?shù)陀谶@個(gè)溫度后，這些內(nèi)源物質(zhì)基本不再發(fā)生變化。黃酮含量在-8℃脅迫24 h后達(dá)到最高值23.64 mg/g，多酚含量在-6℃脅迫72 h后達(dá)到最高值36.71%，花青素含量在-6℃脅迫48 h后達(dá)到最高值5.22 mg/g，還原型VC含量在-2℃脅迫72 h后達(dá)到最高值193.60 mg/100g。這些結(jié)果表明，核桃葉片內(nèi)源物質(zhì)含量和低溫脅迫有較強(qiáng)的相關(guān)性。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的黃酮與多酚含量變化規(guī)律與參考文獻(xiàn)中的變化規(guī)律相近，在超過植物體能夠承受的低溫后，抗寒機(jī)制中的抗氧化物質(zhì)含量被消耗降低，當(dāng)植物組織被冰晶破壞，這些物質(zhì)的含量最終趨于穩(wěn)定。黃酮、VC、多酚類物質(zhì)等的含量變化在植物抗寒過程中有重要的作用。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，清除或控制由低溫逆境所產(chǎn)生的生物自由基可能是酚類物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)等保護(hù)植物機(jī)體免受損傷的重要機(jī)理之一。植物體內(nèi)酚類物質(zhì)、黃酮物質(zhì)等結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多,是哪些種類在樹體抗低溫逆境中起主要作用、其生理生化機(jī)制的詳細(xì)過程是如何進(jìn)行的、是由哪些抗性基因進(jìn)行調(diào)控等問題還有待今后進(jìn)一步研究。

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(編輯 潘秀華)

The response of flavonoids and polyphenols injuglansregialeaves to low temperature stress

SONG Jingwu1, YIN Desong1,ZHAO Diguang3,QI Beibei1，CHEN Yingying1，ZHOU Ling2，PENG Lei1

(1CollegeofHorticultureandLandscape,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;2CollegeofLongrunPu’erTea，YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China;3ChineseAcademyofAgriculturalSciences,ZhengzhouFruitInstitute,Zhengzhou450009,China)

As an important secondary metabolite in plant, polyphenols have important ecological functions to resist extreme environment. In order to study the changes of the content of polyhenols in theJuglansregiain response to different low temperature stress, the experiment was carried out by using treatments of 0 ℃, -2℃, -4℃, -6℃ and -8℃ in different time period ( 24 h, 48 h, 72 h). We investigated the levels of polyphenols，flavonoids，anthocyanins and vitamin C content inJuglansleaf. Our results reveal that the content of flavonoids, polyphenols, anthocyanins inJuglansleaves under different low temperature stress decreased at first before the increase. The content of reducing vitamin C under different low temperature stress firstly rised and then fell. The content of flavonoids reached the highest point (23.64 mg/g) at -8℃ when treated for 24 h. The content of polyphenols ar-rived at the highest point (36.71%) at -6℃ when treated for 72 h. The content of anthocyanins reached 5.22 mg/g at -6℃ when treated for 48 h. The content of reducing vitamin C arrived at the highest point (193.60 mg/100g) at -2℃ when treated for 72 h. Our study shows that the contents of substances fromJuglansleaf have strong correlation with the temperature changes.

Juglansleaf; low temperature stress; flavonois; polyphenol; anthocyanin; reducing vitamin C

1007-4961(2017)01-0034-08

10.13320/j.cnki.hjfor.2017.0007

2016-11-15；

2016-12-25

宋靜武(1990-)，男，河南鄭州人，在讀碩士研究生，主要從事果樹栽培與生理研究。

通迅作者：彭磊(1969-)，男，云南元江人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹育種及栽培生理研究。

S 664.1

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