授粉后紅球姜雌性生殖器官qRT-PCR的內(nèi)參基因篩選

林浩川， 鐘春梅， 孫姝蘭

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育與生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

授粉后紅球姜雌性生殖器官qRT-PCR的內(nèi)參基因篩選

林浩川， 鐘春梅， 孫姝蘭*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育與生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

根據(jù)授粉后不同時(shí)間點(diǎn)的紅球姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)內(nèi)參基因，篩選出10個(gè)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的基因Actin-2(ACT2)、Actin-7(ACT7)、Betatubulin-1(TUB1)、Betatubulin-5(TUB5)、Alphatubulin-3(TUA3)、Ubiquitin(UBQ)、Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)、Elongationfactor1-alpha(EF-1α)、Cyclophilin(CYP)、Histone(H2A)作為候選內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析. 結(jié)果表明，在紅球姜雌性生殖器官授粉后的發(fā)育過程中，GAPDH和UBQ的表達(dá)穩(wěn)定性最好，均適合作為內(nèi)參基因，同時(shí)使用2種作為內(nèi)參基因能使實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析結(jié)果更精確. 因此，最終選擇GAPDH和UBQ作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析紅球姜雌性生殖器官相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)參基因. 該研究將為探究紅球姜敗育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為近源姜屬植物內(nèi)參基因的篩選提供線索.

紅球姜； 內(nèi)參基因； qRT-PCR； GeNorm； NormFinder； BestKeeper

紅球姜(Zingiberzerumet(L.) Smith)是一種良好的新型切花和藥用材料，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]. 筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，雖然其大、小孢子發(fā)育正常，但存在敗育現(xiàn)象，極大影響紅球姜的發(fā)展前景. 目前，姜屬植物的研究主要集中在形態(tài)解剖、藥用價(jià)值等方面[1]，有關(guān)紅球姜敗育的分子機(jī)理尚不清楚. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)因其具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因表達(dá)分析[2]，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于標(biāo)準(zhǔn)化分析的內(nèi)參基因[3]. 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分析紅球姜敗育相關(guān)基因的表達(dá)模式，有助于闡明其敗育的分子機(jī)制. 然而，目前尚未見任何姜科相關(guān)內(nèi)參基因篩選的報(bào)道. 在植物學(xué)研究中，一些表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的管家基因常被選為內(nèi)參基因，如肌動(dòng)蛋白基因(Actin)[4]、微管蛋白基因(Tubulin)[5]等，然而研究表明，管家基因在不同植物或不同實(shí)驗(yàn)條件中的表達(dá)水平并非持續(xù)穩(wěn)定[6]，即使是近源種間，相同的管家基因也存在表達(dá)差異[7]. 因此，篩選適用于授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析的內(nèi)參基因是極其必要的.

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Transcriptome Sequence)可以從整體上反映基因表達(dá)水平，有助于研究基因組信息未知的非模式物種[8]. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的qRT-PCR內(nèi)參基因篩選是目前一種新的有效方法，SANG等[9]通過該方法篩選出適用于不同重金屬脅迫下東南景天的內(nèi)參基因；CHANG等[10]也通過該方法篩選出1對(duì)可用于側(cè)柏不同組織的內(nèi)參基因；該方法同樣成功應(yīng)用于動(dòng)物[11]，真菌[12]等非模式物種內(nèi)參基因的篩選中.

本研究根據(jù)授粉后不同時(shí)間點(diǎn)的紅球姜轉(zhuǎn)錄組以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)內(nèi)參基因，篩選出10個(gè)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的基因Actin-2(ACT2)、Actin-7(ACT7)、Betatubulin-1(TUB1)、Betatubulin-5(TUB5)、Alphatubulin-3(TUA3)、Ubiquitin(UBQ)、Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)、Elongationfactor1-alpha(EF-1α)、Cyclophilin(CYP)、Histone(H2A)作為候選內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm[13]、NormFinder[14]和BestKeeper[15]3種常用統(tǒng)計(jì)學(xué)程序分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析紅球姜雌性生殖器官相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)參基因，為探究紅球姜敗育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以紅球姜姜花為實(shí)驗(yàn)材料，采樣地為廣東省惠州市博羅縣酥醪村羅浮山系. 開花前一天套袋以防止訪花動(dòng)物的干擾，開花后當(dāng)柱頭處于授粉期時(shí)進(jìn)行異花授粉，于授粉后0、2、4、6、8、10、12、18、24 h取下整朵姜花，分離出雌性生殖器官(花柱和子房)，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存. 共9個(gè)樣品，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

凍存樣品經(jīng)液氮研磨后，使用華越洋超快型植物RNA提取試劑盒(華越洋生物科技有限公司，0416-50)提取總RNA. 利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，并用NanoDrop 2000c(Quawell，美國(guó))檢測(cè)總RNA的純度和濃度. 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，RR047A)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置于-20℃冰箱保存. 反應(yīng)體系：模板RNA 800 ng；5×PrimeScript?Buffer (for Real-time) 4 μL；PrimScript?RT Enzyme Mix I 1 μL；RT Primer Mix 1 μL；5×gDNA Eraser Buffer 2 μL；gDNA Eraser 1 μL；用RNase Free dH2O補(bǔ)至20 μL體系. 反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s.

1.3 候選內(nèi)參基因的篩選和引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的授粉后不同時(shí)間點(diǎn)的紅球姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，計(jì)算各基因表達(dá)量的平均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation, SD)和變異系數(shù)(Coefficient of Variation, CV)，結(jié)合常用內(nèi)參基因[16]，篩選出10個(gè)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的ACT2、ACT7、TUB1、TUB5、TUA3、UBQ、GAPDH、EF-1α、CYP、H2A基因作為候選內(nèi)參基因. 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1). 所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.4 qRT-PCR反應(yīng)

qRT-PCR反應(yīng)在ABI PRISM?7500 PCR儀(Thermo，美國(guó))上進(jìn)行. 反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL (20×)；SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL；ROX Reference Dye II 0.4 μL；Forward primer 0.4 μL；Reverse primer 0.4 μL；用Nuclease-free water補(bǔ)至20 μL體系. 每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù). 反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s. 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物特異性.

1.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算基因擴(kuò)增效率

取9個(gè)樣品的cDNA模板等量混合，依次稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋5倍，即模板濃度分別為初始濃度的50、5-1、5-2、5-3、5-4倍. 通過qRT-PCR反應(yīng)，獲得候選內(nèi)參基因在不同模板濃度下的CT值. 以模板的log值為橫坐標(biāo)，以CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率k和相關(guān)系數(shù)R2. 通過公式E=(5-1/slope-1)×100%，計(jì)算出擴(kuò)增效率E.

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007對(duì)得到的CT值進(jìn)行整理，并通過3種常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性分析，篩選出適用于授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官qRT-PCR的內(nèi)參基因. GeNorm和NormFinder需要先將CT值轉(zhuǎn)換為相對(duì)表達(dá)量，而BestKeeper可直接使用原始CT值.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

選取授粉后不同時(shí)間點(diǎn)的紅球姜雌性生殖器官提取總RNA，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，RNA電泳條帶清晰明亮，無可見的DNA污染(圖1). NanoDrop 2000c(Quawell，美國(guó))檢測(cè)結(jié)果顯示，OD260/OD280為1.8～2.1，OD260/OD230為1.9～2.2，表明RNA樣品完整性較好，純度較高，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 引物擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性分析

利用10個(gè)候選內(nèi)參基因引物，分別對(duì)5個(gè)濃度梯度(5倍稀釋)的cDNA模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)繪制候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線. 結(jié)果顯示，所有候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)R2>0.990，且擴(kuò)增效率在95.71%～108.63%之間(表1)，表明cDNA模板量與相應(yīng)的CT值具有良好的線性關(guān)系，符合qRT-PCR對(duì)引物擴(kuò)增效率的要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性. 同時(shí)，溶解曲線分析結(jié)果表明，10個(gè)候選內(nèi)參基因都有明顯的單一信號(hào)峰，且同一樣品重復(fù)性良好(圖2)，表明所使用的引物特異性好，反應(yīng)的專一性高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖1 紅球姜雌性生殖器官授粉后不同發(fā)育時(shí)期樣品總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from pollinatedZingiberzerumet(L.) Smith female reproductive organ at different development stages

表1 紅球姜候選內(nèi)參基因qRT-PCR的引物序列和擴(kuò)增參數(shù)

Table 1 Primer sequences and amplification parameter for candidate reference genes ofZingiberzerumet(L.) Smith derived from qRT-CPR

基因基因名稱引物序列(5'→3')斜率k擴(kuò)增效率/%相關(guān)系數(shù)/R2ACT2Actin-2F-AAGGATGGCTGGAAGAGGACTR-AGAGCTGGAAACTGCCAAGAC-2.30101.570.9994ACT7Actin-7F-ACTTCCTTTCAGGTGGAGCCR-CTAAGTGGCGGGTCGACAAT-2.22106.310.9915TUB1Betatubulin-1F-AGCGAGCAGTTCACTCTGATGR-GTCGCGTCTTGGTACTGCTG-2.3896.830.9958TUB5Betatubulin-5F-ACATCCACCAGACACGAGGAR-CCCAACAACTGATTTGCCGC-2.28102.260.9963TUA3Alphatubulin-3F-CTGCAGTTGTGGAGCCATACAR-ATGTCGAGAGACCGCCTACA-2.19108.630.9905UBQUbiquitinF-CGATCACTCTCGAGGTGGAGR-TTCCGGCGAAGATAAGGCG-2.30101.250.9991GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphatedehydro-genaseF-AATTTTCCGCACCCATTCGCR-ATCATTGACGGCGACGAGTT-2.3797.330.9905EF-1αElongationfactor1-alphaF-CGACATTATCGCCAGGGAGAGR-CCAGTTGGACGGGTTGAGAC-2.4095.710.9970CYPCyclophilinF-TGTGGAAGCTACTCCCCTTGTR-AGCTGGCCGGATTGTTATGG-2.24105.390.9984H2AHistoneF-AGGCAGACAAAATCCAGCGAR-CTTCCCTCGAATCGACCAGG-2.29102.070.9957

圖2 10個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR溶解曲線

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同樣品下的CT值進(jìn)行匯總，評(píng)估這些基因的平均表達(dá)豐度(圖3). 結(jié)果顯示，所有候選內(nèi)參基因CT值處于20～29之間，其中大部分處于20～26之間，表明表達(dá)豐度比較適中.GAPDH和UBQ的CT值最低，范圍分別為20.18～22.85和20.63～22.58，表明這2個(gè)基因的表達(dá)豐度最高. 而TUB1的CT值最高，范圍為25.26～28.79，表明其表達(dá)豐度最低.

圖3 10個(gè)候選內(nèi)參基因的CT值分布

2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

采用3種常見但算法不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper，分別對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因在授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析. 2.4.1 GeNorm分析 GeNorm通過計(jì)算候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定值(Expression Stability Value，M)來量化候選基因的穩(wěn)定性. GeNorm以1.5作為臨界值，只有當(dāng)M值小于1.5時(shí)，該候選基因才能作為內(nèi)參基因使用，而且M值越小其表達(dá)穩(wěn)定性越好. 分析結(jié)果顯示，10個(gè)候選基因的M值均小于1.5，都可以作為內(nèi)參基因使用. 按照M值由高到低排列依次為：ACT7>TUB5>TUB1>CYP>ACT2>TUA3>EF-1α>H2A>GAPDH=UBQ(圖4)，表明GAPDH和UBQ的表達(dá)最穩(wěn)定，最適合作為內(nèi)參基因使用. 其次為H2A和EF-1α.

此外，GeNorm還能通過計(jì)算配對(duì)變異值(Pairwise Variation Value)來確定理想內(nèi)參基因的數(shù)目. 默認(rèn)以0.15為臨界值，當(dāng)有n個(gè)候選內(nèi)參基因時(shí)，若Vn/(n+1)<0.15，表明此時(shí)n個(gè)內(nèi)參基因已滿足準(zhǔn)確校正目標(biāo)基因表達(dá)量的要求，而無需使用更多的內(nèi)參基因. 分析結(jié)果顯示，V2/3<0.15(圖4)，因此內(nèi)參基因的最適數(shù)目為2個(gè)，分別是GAPDH和UBQ.

2.4.2 NormFinder分析 NormFineder基于組內(nèi)和組間基因表達(dá)的差異程度來排序，和GeNorm類似，候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性M值越小，表達(dá)越穩(wěn)定. 分析結(jié)果顯示，10個(gè)候選內(nèi)參基因按照M值由高到低排列依次為：ACT7>TUB5>TUB1>CYP>ACT2>H2A>UBQ>TUA3>EF-1α>GAPDH(圖5)，表明GAPDH的表達(dá)最穩(wěn)定，其次為EF-1α、TUA3和UBQ.

圖4 GeNorm分析10個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性(A)和最佳內(nèi)參基因數(shù)目(B)

Figure 4 Expression stability of ten candidate reference genes(A) and the optimal numbers of reference genes(B) analyzed by GeNorm

圖5 NormFinder分析10個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

Figure 5 Expression stability of ten candidate reference genes analyzed by NormFinder

2.4.3 BestKeeper分析 BestKeeper基于候選內(nèi)參基因在不同樣品中的CT值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)，SD值越小，表達(dá)越穩(wěn)定. 程序默認(rèn)SD的臨界值為1，當(dāng)SD大于1時(shí)，表明該基因不適合作為內(nèi)參基因使用. 分析結(jié)果顯示，ACT2、CYP和TUB1的SD均大于1，表明這3個(gè)基因穩(wěn)定性差，不適合作為內(nèi)參基因使用.UQB的SD值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最好，其次為TUB5、H2A和GAPDH(表2).

綜合上述3種程序的分析結(jié)果，GeNorm分析得出表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是GAPDH和UBQ，而NormFinder和BestKeeper則分別為GAPDH和UBQ，可見對(duì)最適內(nèi)參基因的分析結(jié)果都集中在GAPDH和UBQ.

表2 BestKeeper分析10個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Expression stability of ten candidate reference genes analyzed by BestKeeper

注：GM：幾何平均數(shù)；AM：算數(shù)平均數(shù)；Min：最小值；Max：最大值；SD：標(biāo)準(zhǔn)差；CP：置信參數(shù).

2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

分別使用GAPDH和UBQ作為內(nèi)參基因，對(duì)與紅球姜授粉后雌性生殖器官發(fā)育相關(guān)的A型細(xì)胞周期蛋白基因(A-typeCyclin-dependentKinase1,CDKA1)[17]的表達(dá)模式進(jìn)行分析，驗(yàn)證這2個(gè)內(nèi)參基因?qū)RT-PCR分析目的基因表達(dá)模式的影響. 結(jié)果顯示，分別以GAPDH和UBQ作為內(nèi)參基因時(shí)所得到的CDKA1的表達(dá)模式大致相同，CDKA1在授粉24 h后表達(dá)均顯著上調(diào)(圖6). 上述結(jié)果表明，GAPDH和UBQ適合作為授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析的內(nèi)參基因.

圖6 分別以GAPDH和UBQ作為內(nèi)參基因時(shí)CDKA1的表達(dá)模式分析

Figure 6 Expression pattern analysis ofCDKA1 usingGAPDHandUBQas internal controls

3 討論

近年來，qRT-PCR技術(shù)已成為研究基因表達(dá)量的重要方法，由于常用的內(nèi)參基因存在不穩(wěn)定性[18]，因此根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件篩選穩(wěn)定合適的內(nèi)參基因極為重要. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的qRT-PCR內(nèi)參基因篩選是一種新興的研究方法，能為缺乏基因組信息的非模式物種內(nèi)參基因的篩選提供線索.

本研究根據(jù)授粉后不同時(shí)間點(diǎn)的紅球姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)內(nèi)參基因，篩選出10個(gè)候選內(nèi)參基因ACT2、ACT7、TUB1、TUB5、TUA3、UBQ、GAPDH、EF-1α、CYP、H2A，結(jié)合qRT-PCR技術(shù)和3種統(tǒng)計(jì)學(xué)程序GeNorm、NormFinder和BestKeeper對(duì)它們?cè)谑诜酆蠹t球姜雌性生殖器官中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià). 結(jié)果表明，3種程序得出的穩(wěn)定性排序略有不同，這在黃瓜等植物內(nèi)參基因的篩選研究中也曾出現(xiàn)，可能是由于程序的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同所致[19-20]. 但從總體結(jié)果上看，排除差異顯著的TUB5，3種程序得出表達(dá)穩(wěn)定性較高的基因都是GAPDH、UBQ、H2A和EF-1α，表達(dá)穩(wěn)定性較低的基因都是ACT7和TUB1. 其中，GeNorm分析得出表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是GAPDH和UBQ，而NormFinder和BestKeeper則分別為GAPDH和UBQ，可見3種程序?qū)ψ钸m內(nèi)參基因的分析結(jié)果都集中在GAPDH和UBQ. 分別以GAPDH和UBQ作為內(nèi)參基因時(shí)，CDKA1在授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官中的表達(dá)模式大致相同，進(jìn)一步說明這2個(gè)候選基因適合作為該條件下的內(nèi)參基因. 目前已有大量研究表明GAPDH和UBQ在植物發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定，如ZHONG等[21]發(fā)現(xiàn)GAPDH在荔枝不同發(fā)育時(shí)期和不同實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)均較穩(wěn)定；孫美蓮等[22]也發(fā)現(xiàn)GAPDH在不同發(fā)育時(shí)期的葉片和愈傷組織中表達(dá)穩(wěn)定；劉洪峰等[23]發(fā)現(xiàn)UBQ在牡丹不同發(fā)育時(shí)期的花瓣以及鳳丹不同發(fā)育時(shí)期的種子中表達(dá)較穩(wěn)定；王彥杰等[24]對(duì)牡丹內(nèi)參基因的研究中，同樣篩選出GAPDH和UBQ為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，上述報(bào)道均與本研究結(jié)果一致. 此外，GeNorm程序?qū)?0個(gè)候選基因的配對(duì)差異值進(jìn)行計(jì)算，以0.15為臨界值界定Vn/(n+1)的大小，最終確定本實(shí)驗(yàn)條件下的理想內(nèi)參基因數(shù)目為2個(gè)，即GAPDH和UBQ. 許多研究者建議，在進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，相較于使用單一內(nèi)參基因校正目的基因的表達(dá)量，同時(shí)選擇2個(gè)或以上的內(nèi)參基因更有利于得到精確可靠的結(jié)果，而且對(duì)于檢測(cè)表達(dá)差異極為微小的目的基因，這種方法更為有效[25-26]. 因此，本研究最終同時(shí)選擇GAPDH和UBQ，作為授粉后不同發(fā)育時(shí)期的紅球姜雌性生殖器官實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析的內(nèi)參基因.

本研究首次報(bào)道了可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)化分析紅球姜雌性生殖器官相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)參基因GAPDH和UBQ，為探究紅球姜敗育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為近源姜屬植物內(nèi)參基因的篩選提供線索.

[1] YOB N J,JOFRRY S M,AFFANDI M M,et al.Zingiberzerumbet(L.) Smith:a review of its ethnomedicinal,chemical,and pharmacological uses[J]. eCAM,2011 (1):543216-543216.

[2] HUGGETT J,DHEDA K,BUSTIN S,et al. Real-time RT-PCR normalization strategies and considerations[J]. Genes and Immunity,2005,6(4):279-284.

[3] DERVEAUX S,VANDESOMPELE J,HELLEMANS J. How to do successful gene expression analysis using Real- time PCR[J]. Methods,2010,50(4):227-230.

[4] WONG C K,WANG C B,LI M L,et al. Identification and characterization of genes associated with the induction of embryogenic competence in leaf-protoplast-derived alfalfa cells[J]. IEEE Transactions on Electron Devices,2014,61(12):4210-4215.

[5] JEONG Y M,MUN J H,LEE I,et al. Distinct roles of the first introns on the expression of Arabidopsis profiling gene family members[J]. Tetrahedron Asymmetry,2006,22(7):722-727.

[6] LONG X Y,WANG J R,OUELLET T,et al. Genome-wide identification and evaluation of novel internal control genes for Q-PCR based transcript normalization in wheat[J]. Plant Molecular Biology,2010,74(3):307-311.

[7] 李錢峰,蔣美艷,于恒秀,等. 水稻胚乳RNA定量RT-PCR分析中參照基因選擇[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2008,29(2):61-66.

LI Q F,JIANG M Y,YU H X,et al. Selection of internal reference genes for quantitative RT-PCR analysis of total RNA from endosperm of rice (OryzasativaL.)[J]. Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition),2008,29(2):61-66.

[8] KRISTIANSSON E,ASKER N,F?RLIN L,et al. Characterization of theZoarcesviviparus,liver transcriptome using massively parallel pyrosequencing[J]. BMC Genomics,2009,10(1):1-11.

[9] SANG J,HAN X,LIU M,et al. Selection and validation of reference genes for real-time quantitative PCR in hyperaccumulating ecotype ofSedumalfrediiunder different heavy metals stresses[J]. Plos One,2013,8(12): Art e82927，10pp.

[10]CHANG E,SHI S,LIU J,et al. Selection of reference genes for quantitative gene expression studies inPlatycladusorientalis(Cupressaceae) using real-time PCR[J]. Plos One,2012,7(3):65-65.

[11]HU Y,XIE S,YAO J. Identification of novel reference genes suitable for qRT-PCR normalization with respect to the zebrafish developmental stage[J]. Plos One,2016,11(2): Art e0149277,13pp.

[12]VIEIRA A,CABRAL A,FINO J,et al. Comparative validation of conventional and RNA-Seq data-derived reference genes for qPCR expression studies ofColletotrichumkahawae[J]. Plos One,2016,11(3): Art e0150651,18pp.

[13]VANDESOMPELE J,DE PRETER K,PATTYN F,et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology,2002,3(7):1-11.

[14]ANDERSEN C L,JENSEN J L,ΦRNTOFT T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data:a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research,2004,64(15):5245-5250.

[15]PFAFFL M W,TICHOPAD A,PRGOMET C,et al. Determination of stable housekeeping genes,differentially regulated target genes and sample integrity:best Keeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters,2004,26(6):509-515.

[16] 張玉芳,趙麗娟,曾幼玲. 基因表達(dá)研究中內(nèi)參基因的選擇與應(yīng)用[J]. 植物生理學(xué)報(bào),2014,50(8):1119-1125.

ZHANG Y F,ZHAO L J,ZENG Y L. Selection and application of reference genes for gene expression studies[J]. Plant Physiology Journal,2014,50(8):1119-1125.

[17]IWAKAWA H,SHINMYO A,SEKINE M. Arabidopsis CDKA;1,a cdc2 homologue,controls proliferation of generative cells in male gametogenesis[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology,2006,45(5):819-831.

[18]GUTIERREZ L,MAURIAT M,GUéNIN S,et al. The lack of a systematic validation of reference genes:a serious pitfall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis in plants[J]. Plant Biotechnology Journal,2008,6(6):609-618.

[19]WAN H,ZHAO Z,QIAN C,et al. Selection of appropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real-time polymerase chain reaction in cucumber[J]. Analytical Biochemistry,2010,399(2):257-261.

[20]MAFRA V,KUBO K S,ALVESFERREIRA M,et al. reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental Conditions[J]. Plos One,2012,7(2): Art e31263,11pp.

[21]ZHONG H Y,CHEN J W,LI C Q,et al. Selection of reliable reference genes for expression studies by reverse transcription quantitative real-time PCR in litchi under different experimental conditions[J]. Plant Cell Reports,2011,30(4):641-653.

[22] 孫美蓮,王云生,楊冬青,等. 茶樹實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 植物學(xué)報(bào),2010,45(5):579-587.

SUN M L,WANG Y S,YANG D Q,et al. Reference genes for Real-time fluorescence quantitative PCR inCamelliasinensis[J]. Chinese Bulletin of Botany,2010,45(5):579-587.

[23] 劉洪峰,高樂旋,胡永紅. 牡丹不同發(fā)育階段種子和花瓣組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR中內(nèi)參基因的挖掘與篩選[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23(12):1639-1648.

LIU H F,GAO L X,HU Y H. Reference genes discovery and selection for quantitative Real-time PCR in tree peony seed and petal tissue of different development stages[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2015,23(12):1639-1648.

[24] 王彥杰,董麗,張超,等. 牡丹實(shí)時(shí)定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20(5):521-528.

WANG Y J,DONG L,ZHANG C,et al. Reference gene selection for Real- time quantitative PCR normalization in tree peony(PaeoniasuffruticosaAndr.)[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2012,20(5):521-528.

[25]MAROUFI A,BOCKSTAELE E V,LOOSE M D. Validation of reference genes for gene expression analysis in chicory (Cichoriumintybus) using quantitative real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology,2010,11(1):1-12.

[26]LUO H,LUO K,LUO L,et al. Evaluation of candidate reference genes for gene expression studies inCymbidiumkanran[J]. Scientia Horticulturae,2014,167(3):43-48.

【中文責(zé)編：成文 英文審校：李海航】

Screening of Reference Genes for qRT-PCR Analysis inZingiberzerumet(L.) Smith Female Reproductive Organ after Pollination

LIN Haochuan，ZHONG Chunmei，SUN Shulan*

(Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Screening of reference genes of pollinatedZingiberzerumet(L.) Smith female reproductive organ at development process is crucial for analyzing the expression of key regulatory genes forZingiberzerumet(L.) Smith abortion. According to the transcriptome database ofZ.zerumetSmith and researches on traditional reference genes, we selected 10 relatively stable genes as candidate reference genes, includingActin-2 (ACT2),Actin-7 (ACT7),Betatubulin-1 (TUB1),Betatubulin-5 (TUB5),Alphatubulin-3 (TUA3),Ubiquitin(UBQ),Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH),Elongationfactor1-alpha(EF-1α),Cyclophilin(CYP), andHistone(H2A), and analyzed their expression stability by qRT-PCR and three statistic programs: GeNorm, NormFinder and BestKeeper. The results showed thatGAPDHandUBQare the most stable genes during the development process of pollinatedZ.zerumetSmith female reproductive organ. These two genes were suitable to be reference genes, and it was more accurate for qRT-PCR normalization analysis using these two reference genes at the same time. This work indicated thatGAPDHandUBQare effective reference genes for qRT-PCR normalization analysis in pollinatedZ.zerumetSmith female reproductive organ at different development stages, which can be used for the study of molecular mechanism of abortive inZ.zerumetSmith, and for the screening of reference genes in other Zingiber species.

Zingiberzerumet(L.) Smith; reference genes; qRT-PCR; GeNorm; NormFinder; BestKeeper

2016-10-18 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)-廣東省人民政府聯(lián)合基金(U1301213)

Q786

A

1000-5463(2017)01-0067-07

*通訊作者:孫姝蘭，副研究員，Email:sunsl@scnu.edu.cn.