豬源綠膿桿菌的分離鑒定及16S rRNA基因同源性分析

蔣增海，鄧同煒，徐耀輝，趙攀登，陳 益

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

豬源綠膿桿菌的分離鑒定及16S rRNA基因同源性分析

蔣增海1，2，鄧同煒1,2，徐耀輝1，2，趙攀登1,2，陳 益1,2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

從解剖病變?yōu)樾陌?、纖維素性肺炎、肺膿腫的病死仔豬體內(nèi)分離到1株細(xì)菌，通過形態(tài)特征觀察、生化試驗(yàn)，將分離菌株初步鑒定為綠膿桿菌。動物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對小鼠具有很強(qiáng)的致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對氧氟沙星、恩諾沙星高度敏感，對頭孢噻肟、慶大霉素中度敏感，對青霉素、氟苯尼考、氨芐西林、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、卡那霉素等耐藥。將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中發(fā)表的綠膿桿菌序列進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明，分離菌株與綠膿桿菌不同菌株的同源性高達(dá)99%以上，進(jìn)一步確定分離菌株為綠膿桿菌。基于16S rRNA基因序列，使用MEGA 5.05軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，分離菌株與病人痰液和腹瀉嬰兒分離菌株的同源性最高，與未加工水果分離菌株同源性最低。

豬； 綠膿桿菌； 分離鑒定； 藥敏試驗(yàn)； 16S rRNA 基因； 同源性分析

綠膿桿菌(Bacilluspyocyaners),也稱銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa),該菌于1882年首先由Gersard氏從傷口膿液中分離到[1]。綠膿桿菌在自然界廣泛存在于水、土壤 、空氣以及動物的腸道和皮膚中，是一種條件性致病菌，在特定的情況下能引起人及動物感染發(fā)病，現(xiàn)已報(bào)道能引起貂出血性肺炎、羊化膿性肺炎、雛雞急性敗血死亡、竹鼠急性死亡等[2-6]。張道永等[7]從奶牛、豬、雞、羊、黑熊等19種動物分離到794株綠膿桿菌，表明綠膿桿菌能感染多種動物。目前，國內(nèi)仍未有豬發(fā)生綠膿桿菌感染致病的報(bào)道。2015年4月，河南省獲嘉縣某規(guī)?；B(yǎng)豬場，保育仔豬表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、被毛粗亂，出現(xiàn)零星死亡，應(yīng)用氟苯尼考等藥物治療無效，解剖發(fā)現(xiàn)病變?yōu)樾陌?、纖維素性肺炎及綠色斑和肺化膿性膿腫病灶，為了確診病因，以進(jìn)行有效防治，采集病死仔豬的心臟血液、肺臟組織進(jìn)行了病原分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和16S rRNA基因同源性分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 血瓊脂平板購自鄭州博賽生物有限公司，營養(yǎng)瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯粉均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 供試動物 成年健康昆明小鼠由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.3 生化試驗(yàn)試劑 各種微量生化試管、氧化酶試紙片、各種藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)試劑自制。

1.1.4 PCR擴(kuò)增試劑 rTaq酶、dNTPs、10×PCR 緩沖液(Mg2+plus)、DL2000 DNA Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.5 參考序列 從GenBank下載部分已發(fā)表銅綠假單胞桿菌16S rRNA序列，菌株名稱、序列登錄號和分離來源等分別為R6-765 (JQ659860.1， 植物組織)、R8-768(JQ659979.1，植物組織)、RRLP (感染病人導(dǎo)尿管)、DK1(LN870292.1，病人痰液)、DK2(CP003149.1，病人)、B136-33 (CP004061.1，腹瀉嬰兒)、F9676(CP012066.1，生病老鼠)、P(KR080311.1，未加工水果)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離、培養(yǎng) 無菌采集病死保育仔豬的心臟血液、肺臟組織，接種于血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板等，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，根據(jù)細(xì)菌生長情況，挑取典型綠色菌落，進(jìn)一步純化、傳代。挑取純化的綠色單菌落，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將所分離純培養(yǎng)物接種牛乳培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)管，37 ℃培養(yǎng)，觀察其生化反應(yīng)特性。同時(shí)分離純化培養(yǎng)物，按照參考文獻(xiàn)[8-9]的方法進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)。

1.2.3 動物致病性試驗(yàn) 取純培養(yǎng)物,無菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)16～18 h得到幼齡菌液，稀釋為0.5麥?zhǔn)蠝啙岫?每只小鼠腹腔接種0.2 mL，共接種4只，同時(shí)選擇4只作為對照。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)物，接種于滅菌營養(yǎng)肉湯，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，稀釋為0.5麥?zhǔn)蠝啙岫龋缓笥脺缇藓炚喝【?，均勻涂抹于無菌普通營養(yǎng)瓊脂平板，貼上藥敏紙片，次日測定抑菌圈。

1.2.5 引物 參考文獻(xiàn)[10-11]合成16S rRNA基因特異性通用引物， 正向引物F: 5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATGGCTCAC-3′；反向引物R: 5′-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.6 PCR模板 挑取營養(yǎng)瓊脂平板分離純化培養(yǎng)物2個(gè)單菌落，加入200 μL去離子水，水浴煮沸10 min，-20 ℃冷凍10 min,取出解凍,12 000 r/min離心2.5 min，取上清作為模板。

1.2.7 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為:10×PCR緩沖液(Mg2+plus) 5 μL，rTaq酶1.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正向、反向引物(2 mol/L)各2 μL，菌株DNA模板2 μL，最后補(bǔ)充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min ; 94 ℃ 45 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.8 PCR產(chǎn)物測序 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將結(jié)果陽性者送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.9 16S rRNA的基因序列分析 將分離菌株測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的已知序列，通過Blast比對，利用MEGA 5.05軟件，對分離菌株和8種不同來源的綠膿桿菌16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，比較其同源性關(guān)系[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落的形態(tài)及培養(yǎng)特征

將分離、純化的細(xì)菌接種在普通營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)12～24 h，形成圓形、光滑、濕潤的中等大小菌落，稍微隆起，邊緣整齊，菌落和培養(yǎng)基均為藍(lán)綠色，并具有特殊芳香味。將純培養(yǎng)物接種于普通肉湯中、牛乳石蕊培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，液面呈黃綠色、藍(lán)綠色。進(jìn)行革蘭氏染色后，油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離菌株呈單個(gè)、成雙或呈鏈狀排列，短小桿菌，為革蘭氏陰性細(xì)菌(圖1)。

圖1 革蘭氏染色后分離菌株形態(tài)特征(1 000×)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株能分解發(fā)酵β-半乳糖，不分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、半乳糖、果糖及蔗糖，不產(chǎn)生硫化氫，硝酸鹽還原為陰性，MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，均符合綠膿桿菌生化特征。

2.3 動物致病性試驗(yàn)結(jié)果

將所分離菌株接種小白鼠后，表現(xiàn)為扎堆、怕冷，精神沉郁，厭食，腹部膨大，24～48 h后，試驗(yàn)組4只小鼠全部死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔大量積液、胸腔積液、肺出血等。對照組4只小白鼠，活潑健康，無死亡。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株具有致病性。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對氧氟沙星、恩諾沙星抑菌圈直徑分別為26、24 mm；對頭孢噻肟、慶大霉素抑菌圈直徑均為19 mm；對強(qiáng)力霉素、卡那霉素抑菌圈直徑分別為9、8 mm；對氨芐西林、青霉素、氟苯尼考、阿莫西林抑菌圈直徑均為0 mm。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，以上結(jié)果表明，分離菌株對氧氟沙星、恩諾沙星高度敏感，對頭孢噻肟、慶大霉素中度敏感，對青霉素、氟苯尼考、氨芐西林、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、卡那霉素耐藥。

2.5 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及同源序列分析

PCR擴(kuò)增分離菌株16S rRNA基因片段大小約為1 467 bp片段,與預(yù)期大小相符(圖2)。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將其序列與GenBank中發(fā)表的已知序列對比，結(jié)果表明，其序列與綠膿桿菌不同菌株的同源性高達(dá)99%以上?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明,分離菌株與病人痰液(DK1)和腹瀉嬰兒(B136-33)分離菌株同源性最高，與未加工水果(P)分離菌株同源性最低(圖3)。

M: DNA Marker DL2000； 1：陰性對照； 2:16S rRNA圖2 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

HN1為分離菌株；DK1、B136-33、R6-765、R8-768、RRLP、F9676、 DK2為GenBank中的綠膿桿菌菌株圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建豬源綠膿桿 菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

綠膿桿菌廣泛分布于自然界，常為條件致病菌，導(dǎo)致多種動物和人發(fā)病。近年來，國內(nèi)外的報(bào)道均認(rèn)為綠膿桿菌為完全致病菌，其對人和動物的危害已引起人們的高度重視。本研究從患病豬體內(nèi)分離、純化到1株綠膿桿菌，動物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，其具有很強(qiáng)的致病性，確診為綠膿桿菌感染，為國內(nèi)首次報(bào)道豬群感染綠膿桿菌致病。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離綠膿桿菌對氧氟沙星、恩諾沙星高度敏感，這與戴秀美等[15]報(bào)道水貂源綠膿桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果有一致性；對氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、阿莫西林等藥物耐藥，推測可能與當(dāng)前豬場預(yù)防或治療呼吸道疾病常使用這些藥物，容易產(chǎn)生耐藥菌株有關(guān)。因此，建議豬場在使用氟苯尼考或強(qiáng)力霉素治療豬呼吸道疾病無效時(shí)，可輪換使用氧氟沙星、恩諾沙星等敏感藥物。16S rRNA 基因測序是目前用于鑒定菌株種類的最普通的分子技術(shù)[16]，本研究將分離菌株16S rRNA基因片段進(jìn)行測序，通過Blast進(jìn)行同源性比對，進(jìn)一步鑒定分離菌株屬于綠膿桿菌；與前人建立的綠膿桿菌SYBR Green I實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測方法[17]相比，16S rRNA 基因測序鑒定未知菌株更方便實(shí)用?；?6S rRNA基因序列，構(gòu)建不同來源綠膿桿菌系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，分離綠膿桿菌與人源綠膿桿菌同源性最高，推測其可能對人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅，需要進(jìn)一步證明。

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Isolation,Identification and Antimicrobial Susceptibility Test ofPseudomonasaeruginosafrom the Infected Piglet and Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal DNA Sequences

JIANG Zenghai1,2，DENG Tongwei1,2,XU Yaohui1,2，ZHAO Pandeng1,2,CHEN Yi1,2

(1.College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China；2.Henan Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biotechnology,Zhengzhou 450046,China)

A bacterial strain was isolated from the dead piglet with pericarditis，fibrinous pneumonia and lung abscess lesions.The isolate has been identified asPseudomonasaeruginosathrough the obervation of morphological characteristics and biochemical test.Animal pathogenicity test showed that thePseudomonasaeruginosaisolate is highly pathogenic to mice.Drug sensitive test indicated that the isolate was highly sensitive to ofloxacin and enrofloxacin,intermediate sensitive to cefotaxime and gentamicin,and resistant to penicillin,florfenicol,amoxicillin,ampicillin,doxycycline,kanamycin,and so on.Homologous relationship was searched bween 16S rRNA gene sequence of the isolate and that of organisms published in GenBank by blast-sequence alignment.The results indicated that the homology reached more than 99% beween the isolate and other strains ofPseudomonasaeruginosaregistered in GenBank,furtherly confirming that the isolate belongs toPseudomonasaeruginosa.Phylogenetic tree was constructed using MEGA 5.05 on basis of 16S Ribosomal DNA Sequences of the isolate and those of eightPseudomonasaeruginosaisolates from different sourcs in GenBank,revealing that the isolate has the highest homology with thePseudomonasaeruginosaisolates from sputum and infant diarrhea,and the lowest one with that from unprocessed fruit.

swine;Pseudomonasaeruginosa; isolation and identification; antimicrobial susceptibility test; 16S rRNA sequene; phylogenetic analysis

2016-10-20

河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(122102110131)

蔣增海(1976-)，男，四川簡陽人，講師，博士，主要從事豬病方面的教學(xué)、研究和防控工作。 E-mail:50242328@qq.com

S855.1

A

1004-3268(2017)04-0118-04