馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取方法優(yōu)化與比較

王秉鵬，蒙 靜，郭 玫，黃新異，董方圓，邸多隆*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000；2.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3.寧夏自治區(qū)農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)辦公室，寧夏 銀川 750011)

馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取方法優(yōu)化與比較

王秉鵬1,2，蒙 靜3，郭 玫1*，黃新異2，董方圓3，邸多隆2*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000；2.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 中國(guó)科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3.寧夏自治區(qū)農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)辦公室，寧夏 銀川 750011)

為了探究馬鈴薯莖葉中茄尼醇適宜的提取溶劑和提取方法，選取從寧夏固原采收的同一批馬鈴薯莖葉為研究對(duì)象，分別以95%乙醇、甲醇為提取溶劑，并設(shè)置不同的提取次數(shù)和提取時(shí)間，優(yōu)化了加熱回流提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的方法，并比較了加熱回流提取、冷浸提取和超聲提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的效果。結(jié)果表明，采用95%乙醇加熱回流提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇，提取2次，每次提取1.5 h，茄尼醇提取率達(dá)到96.85%，明顯高于甲醇作為提取溶劑(47.04%)；其浸膏得率為7.63%，與甲醇作為提取溶劑(8.07%)相當(dāng)，可降低后期茄尼醇的精制和純化的成本。該方法簡(jiǎn)便、可行，試劑還可反復(fù)回收利用，可行性強(qiáng)。

馬鈴薯； 莖葉； 茄尼醇； 提取方法

馬鈴薯(Solanumtuberosum)，茄科茄屬1年生草本植物，原名陽(yáng)芋，首載于《植物名實(shí)圖考》[1]中，其本身即可食用，又可藥用，性平味甘，可以治胃痛、痄肋、癰腫等疾病[2]。馬鈴薯莖分為地上莖和地下莖兩部分，其中地下莖為人們?nèi)粘Ｉ钪兴秤玫鸟R鈴薯塊莖，而作為地上莖部分的馬鈴薯莖葉目前尚未被充分利用，尤其是其所含的茄尼醇[3]，更是亟待開(kāi)發(fā)。

茄尼醇為一種不飽和的聚異戊二烯伯醇，屬于四倍半帖烯醇，廣泛存在于茄科植物中[3]。其本身具有消炎、抗菌、補(bǔ)血、降血脂和抗腫瘤等生物活性，而且高純度的茄尼醇(含量≥ 90%)更是合成泛醌類(lèi)藥物輔酶Q10、維生素K2以及其他藥物的重要中間體[4]。茄尼醇結(jié)構(gòu)獨(dú)特，人工合成過(guò)程非常復(fù)雜，且浪費(fèi)大量試劑[5]，只能從植物中提取，目前全世界所用茄尼醇主要從煙葉中提取[6]，而煙草資源本來(lái)就緊缺，再加上現(xiàn)在煙草利用率逐步提高，國(guó)家對(duì)煙草行業(yè)的強(qiáng)制性管控[7]，使生產(chǎn)茄尼醇的成本日益昂貴，尋找代替煙草提取茄尼醇的原料勢(shì)在必行。馬鈴薯莖葉中茄尼醇含量(0.1%～1%)與煙草中茄尼醇含量(0.3%～3%)相當(dāng)[8-10]，故可選用馬鈴薯莖葉替代煙草提取茄尼醇，以緩解茄尼醇原料緊缺的局面。

目前,茄尼醇提取方法主要有微波輔助萃取[11]、超臨界流體萃取提取[12]、超聲提取[13]、勻漿提取[14]等，在這些提取方法中均用到石油醚、乙酸乙酯或6號(hào)溶劑等揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，且部分設(shè)備成本高昂、操作工藝繁雜，再加上幾乎全部用煙葉作為提取原料，因此不適合工業(yè)生產(chǎn)。鑒于此，以寧夏固原所產(chǎn)馬鈴薯莖葉為研究對(duì)象，以95%乙醇和甲醇為提取溶劑，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其提取液中茄尼醇含量，以茄尼醇提取率和浸膏得率為提取指標(biāo)，系統(tǒng)研究了提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取分離效果的影響，確定最佳提取方法，為馬鈴薯莖葉中茄尼醇的開(kāi)發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

于9、10月到寧夏固原馬鈴薯種植基地采收馬鈴薯地上部分的莖葉，去除主莖及其他雜質(zhì)后洗凈泥土，自然陰干，帶回實(shí)驗(yàn)室剪切成1.0 cm左右的小段。

藥品與試劑：95%乙醇、甲醇(均為分析純，天津利華隆博醫(yī)藥化學(xué)有限公司)，甲醇、無(wú)水乙醇(均為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)，茄尼醇對(duì)照品(批號(hào)：20140219，純度≥97%，上海士峰生物科技有限責(zé)任公司)。

儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀(Agilent Technologies，USA)，包括 G1311A 四元泵、G1315D DAD檢測(cè)器、G1322B手動(dòng)進(jìn)樣器；AT-950(Heater and Cooler)色譜柱柱溫箱(天津奧塞恩斯儀器有限公司)；HWS26電熱恒溫水浴鍋(上海恒科技術(shù)有限公司)；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司)；ZFD-9050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BT224S電子天平(Sartorius公司)；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器(江蘇正基儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 茄尼醇含量的檢測(cè) 采用HPLC法測(cè)定。HPLC條件：C18液相色譜柱(Spherisorb，250 mm×4.6 mm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇∶無(wú)水乙醇(80∶20，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1.0 mL/min。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取茄尼醇對(duì)照品4.5 mg，加甲醇(色譜純)溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，即得茄尼醇對(duì)照品溶液。

1.2.3 馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取方法優(yōu)化

1.2.3.1 加熱回流提取試劑的篩選 精密稱(chēng)取5 g剪切成段的馬鈴薯莖葉于燒瓶中，分別加入50 mL(10倍量)甲醇(分析純)、95%乙醇(分析純)于電熱恒溫水浴鍋中，80 ℃加熱回流提取2.0 h，提取2次，每次提取結(jié)束后過(guò)濾，分別將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)后用95%乙醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，分別測(cè)定茄尼醇含量，測(cè)定結(jié)束后，將提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，測(cè)定浸膏得率。提取率=試驗(yàn)所得茄尼醇質(zhì)量/總茄尼醇質(zhì)量×100%，總茄尼醇質(zhì)量為試驗(yàn)前用標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的馬鈴薯莖葉中所含全部茄尼醇含量；浸膏得率=浸膏質(zhì)量/馬鈴薯莖葉質(zhì)量×100%。

1.2.3.2 加熱回流提取次數(shù)的考察 精密稱(chēng)取5 g剪切成段的馬鈴薯莖葉于燒瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析純)于電熱恒溫水浴鍋中，80 ℃加熱回流提取2.0 h，分別提取1次、2次、3次，提取結(jié)束后過(guò)濾，分別將每次的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)定容至25 mL容量瓶中，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定茄尼醇含量，測(cè)定結(jié)束后將提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，測(cè)定浸膏得率。

1.2.3.3 加熱回流提取時(shí)間的考察 精密稱(chēng)取5 g剪切成段的馬鈴薯莖葉于燒瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析純)于電熱恒溫水浴鍋中，80 ℃分別加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，各提取2次，每次提取結(jié)束后過(guò)濾，分別將每次的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)定容至25 mL容量瓶中，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定茄尼醇含量，測(cè)定結(jié)束后將各提取液分別再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，測(cè)定浸膏得率。

1.2.3.4 冷浸提取方法優(yōu)化 精密稱(chēng)取5 g剪切成段的馬鈴薯莖葉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析純)(稱(chēng)定質(zhì)量)置于水浴恒溫振蕩器中(25 ℃，60 r/min)振搖提取，0.5 h后用0.45 μm的微孔濾膜將提取液濾過(guò)少許，取續(xù)濾液測(cè)得提取液中茄尼醇含量(每次測(cè)定后繼續(xù)稱(chēng)定質(zhì)量，加95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量)，之后以0.5 h為時(shí)間間隔繼續(xù)測(cè)定，直至茄尼醇含量穩(wěn)定，分別冷浸提取2次，提取結(jié)束后過(guò)濾，最后將濾液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，測(cè)定浸膏得率。

1.2.3.5 超聲提取方法優(yōu)化 精密稱(chēng)取5 g剪切成段的馬鈴薯莖葉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析純)(稱(chēng)定質(zhì)量)于數(shù)控超聲波清洗器中(25 ℃，70 Hz)超聲提取，提取時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、35 min，直接將少許提取液用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定茄尼醇含量直至穩(wěn)定(每次測(cè)定后繼續(xù)稱(chēng)定質(zhì)量，加95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量)，再在同樣條件下提取第2次，直至提取的茄尼醇含量達(dá)到穩(wěn)定，提取結(jié)束后過(guò)濾，最后將濾液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，測(cè)定浸膏得率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、Origin 8.5軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱回流提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的方法優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 提取試劑的篩選結(jié)果 從表1可以看出，采用95%乙醇加熱回流提取，馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取率(96.85%)明顯高于甲醇加熱回流提取的結(jié)果(47.04%)，且浸膏得率與甲醇提取相當(dāng)，故選用95%乙醇(分析純)作為馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取試劑。

表1 不同提取試劑對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取效果的影響

2.1.2 提取次數(shù)的確定 從表2可以看出，馬鈴薯莖葉提取2次后，其茄尼醇提取率達(dá)到96.85%；提取第3次，茄尼醇的提取率僅為3.14%，且相對(duì)偏差結(jié)果較大。說(shuō)明茄尼醇在第3次提取時(shí)已經(jīng)不穩(wěn)定，故從節(jié)約時(shí)間和試劑以及茄尼醇穩(wěn)定性的角度考慮，將馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取次數(shù)定為2次。

表2 加熱回流提取次數(shù)對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取效果的影響

2.1.3 提取時(shí)間的確定 從圖1和表3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，茄尼醇含量、提取率、浸膏得率等參數(shù)都相應(yīng)升高，在加熱回流提取1.5 h后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，茄尼醇含量、總提取率和浸膏得率的變化不大，說(shuō)明提取1.5 h后，茄尼醇提取率已達(dá)到穩(wěn)定，故將加熱回流提取時(shí)間定為1.5 h。

圖1 加熱回流提取不同時(shí)間的茄尼醇含量和浸膏得率表3 加熱回流提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇 提取效果的影響

提取時(shí)間/h提取次數(shù)提取率/%2次總提取率/%浸膏得率/%2次總浸膏得率/%0.5133.5960.944.225.59227.351.371.0148.4474.225.136.58225.781.451.5176.5496.856.027.63220.311.612.0183.5997.656.277.96214.061.69

2.2 冷浸提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的方法優(yōu)化結(jié)果

從圖2可以看出，在第1次冷浸提取至2.5 h后，茄尼醇含量基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明在提取2.5 h后基本達(dá)到穩(wěn)定；而在第2次冷浸提取至1.0 h后，茄尼醇含量基本保持穩(wěn)定。根據(jù)2次提取的結(jié)果，將冷浸提取的時(shí)間定為2.5 h。從表4可以看出，冷浸提取2次的總提取率為57.34%,總浸膏得率為1.88%。

圖2 冷浸提取次數(shù)對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取效果的影響表4 冷浸提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇相關(guān)考察指標(biāo)結(jié)果

提取次數(shù)項(xiàng)目提取率/%平均提取率/%RSD/%2次總提取率/%浸膏得率/%平均浸膏得率/%RSD/%2次總浸膏得率/%1平行132.4632.390.357.341.021.011.811.88平行232.321.002平行125.1324.951.00.860.871.88平行224.770.88

2.3 超聲提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的方法優(yōu)化結(jié)果

從表5可以看出，在超聲提取10 min時(shí)，馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取率達(dá)到最大值，之后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，茄尼醇提取率逐漸降低，在提取35 min時(shí)降低5.4%，而在整個(gè)提取過(guò)程中，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，浸膏得率逐漸升高，其原因可能在于10 min后茄尼醇不再溶出，只有一些極性較大的醇溶性雜質(zhì)溶出，致使浸膏得率增加。因此，在茄尼醇提取率達(dá)到最大值后沒(méi)必要繼續(xù)提取，避免溶出雜質(zhì)過(guò)多，增大茄尼醇精制的壓力，故從節(jié)省時(shí)間和降低消耗的角度考慮，超聲提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取時(shí)間為10 min。

表5 超聲提取后相關(guān)考察指標(biāo)結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為超聲提取茄尼醇2次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)之和。

2.4 不同方法提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的效果比較

由表6可見(jiàn)，95%乙醇加熱回流提取與其他幾種提取方法相比，其茄尼醇含量和提取率均較高，故95%乙醇加熱回流提取為馬鈴薯莖葉中茄尼醇的最佳提取方法。

表6 不同方法提取馬鈴薯莖葉中茄尼醇的效果比較 %

3 結(jié)論與討論

茄尼醇結(jié)構(gòu)獨(dú)特，極性較小，只能用有機(jī)試劑提取。本研究分別用95%乙醇、甲醇作為馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取試劑，其結(jié)果表明，95%乙醇提取茄尼醇時(shí)提取率較高，故選用95%乙醇為馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取試劑；在確定提取試劑后又探討了加熱回流提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)馬鈴薯莖葉中茄尼醇提取效果的影響，并比較了加熱回流提取、冷浸提取和超聲提取等提取方法的差異，最后確定馬鈴薯莖葉中茄尼醇的提取方法為，95%乙醇提取加熱回流提取1.5 h，提取2次，茄尼醇的提取率達(dá)到96.85%。

在確定提取時(shí)間的試驗(yàn)中，比較了不同時(shí)間內(nèi)的2次提取效果，在第1次提取結(jié)束后，茄尼醇提取率、浸膏得率都隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；在第2次提取結(jié)束后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，浸膏得率升高，茄尼醇提取率則降低，而此時(shí)的茄尼醇提取率是相對(duì)莖葉而言的，不是浸膏中的提取率，說(shuō)明隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，茄尼醇有所降解，此結(jié)論在超聲提取的結(jié)果中也有體現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，茄尼醇的降解幅度可能較小，影響不大，但在工業(yè)生產(chǎn)中，由于試劑和原料的用量呈幾何增長(zhǎng)，茄尼醇的降解勢(shì)必會(huì)造成工業(yè)成本的增加以及試劑、原料的浪費(fèi)，因此，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中需要嚴(yán)格考慮提取時(shí)間這一影響因素。

研究表明，茄尼醇在植物中除以游離狀態(tài)存在外，還有一部分以茄尼醇酯的形式存在[15]，茄尼醇酯需經(jīng)堿或脂肪酶皂化斷裂酯鍵才能生成游離茄尼醇[16-17]。因此，本研究中的提取率僅指游離茄尼醇的提取率，而關(guān)于茄尼醇酯的皂化研究將會(huì)在后續(xù)研究中開(kāi)展，茄尼醇提取率將會(huì)進(jìn)一步提高。

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Optimization and Comparison of Extracting Methods of Solanesol in Potato Stem and Leaf

WANG Bingpeng1,2，MENG Jing3,GUO Mei1*,HUANG Xinyi2,DONG Fangyuan3,DI Duolong2*

(1.Department of Pharmacy，Gansu University of Medicine/Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province，Lanzhou 730000,China; 2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics of Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000,China; 3.Comprehensive Development Office of Agriculture in Ningxia Autonomous Region，Yinchuan 750011,China)

In order to investigate the optimal extraction solvents and extraction methods，the same batch potato stem and leaf which was collected from Guyuan，Ningxia was as material.Solanesol was extracted through heating reflux extraction with 95% ethanol and methanol as extraction solvents under different extraction times and extraction time，and extraction effect of solanesol by heating reflux extraction，cold-soaked extracting and ultrasonic extraction methods were compared.The results showed that the extraction ratio was up to 96.85% with 95% ethanol as extraction solvent under extraction times of 2 and extraction time of 1.5 h,which was much higher than that with methanol as extraction solvent(47.04%),and the dry extract yield was 7.63% with 95% ethanol as extraction solvent，which was equivalently with that methanol as extraction solvent(8.07%),which could reduce the cost of refine and purification of solanesol.This method was simple，feasible,and the solvent could be recycled，which had high feasibility.

potato; stem and leaf; solanesol; extraction methods

2016-09-27

2016寧夏農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)科技推廣項(xiàng)目(NTKJ2016-09-03)

王秉鵬(1988-),男，甘肅張掖人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 E-mail:wbpzhongyao@163.com

*通訊作者：郭 玫(1963-)，女，湖北宜昌人，教授，碩士，主要從事中藥有效成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:guomeig@sina.com 邸多隆(1964-)，男，甘肅張掖人，研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)和分析化學(xué)研究。 E-mail:didl@licp.cas.cn

S532;F316.5

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1004-3268(2017)04-0138-05