牛瘤胃產(chǎn)纖維二糖磷酸化酶細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究

張青青,樊海妍,徐新慧,張璐璐,陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

牛瘤胃產(chǎn)纖維二糖磷酸化酶細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究

張青青,樊海妍,徐新慧,張璐璐,陳紅歌*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

為了獲得產(chǎn)新型纖維二糖磷酸化酶(CBP)的菌株，利用選擇性培養(yǎng)基從牛瘤胃液中逐步分離純化，篩選能以纖維二糖為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，分別檢測(cè)所篩選菌株的β-葡萄糖苷酶(βG)和CBP活力，并對(duì)其纖維二糖的利用方式(水解途徑或磷解途徑)進(jìn)行鑒定，獲得產(chǎn)CBP的菌株，命名為BY-a。采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)，結(jié)合16S rDNA序列分析，鑒定菌株BY-a為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。對(duì)菌種產(chǎn)CBP的溫度、時(shí)間、最適裝液量和溶氧量進(jìn)行初步優(yōu)化，結(jié)果顯示，BY-a菌株在裝液量為30 mL(250 mL)、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h時(shí)，產(chǎn)CBP活力最高。

牛瘤胃； 纖維二糖； 纖維二糖磷酸化酶； 產(chǎn)酶條件

植物纖維素是含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源。對(duì)纖維素的轉(zhuǎn)化利用可以緩解能源匱乏和生態(tài)惡化等問(wèn)題，其關(guān)鍵步驟是纖維素的徹底水解。目前，木質(zhì)纖維原料的水解普遍采用預(yù)處理(酸、堿、蒸汽爆破、濕氧化法等)+酶解的工藝[1]。纖維素的酶解需要內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,EG)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,βG)3類酶的協(xié)同作用[2]。然而，βG水解纖維二糖的過(guò)程中會(huì)積累大量的葡萄糖，該產(chǎn)物對(duì)βG有抑制作用。因此，纖維二糖的降解成為整個(gè)纖維原料水解的限速步驟[3]。

除了βG的水解方式外，自然界還存在另一種纖維二糖降解方式，即纖維二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase,CBP)催化的磷解作用：1分子纖維二糖生成1分子1-磷酸葡萄糖(G-1-P)和1分子葡萄糖[4]。其中，G-1-P在磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)的作用下生成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，進(jìn)入糖酵解途徑(EMP途徑)代謝。因此，1分子纖維二糖經(jīng)CBP磷解途徑發(fā)酵時(shí)凈生成5分子ATP，而經(jīng)βG水解途徑則生成4分子ATP，理論上，CBP的磷解作用比βG的水解作用更具有生物能學(xué)優(yōu)勢(shì)[5-7]。此外，Shin等[8]研究表明，與轉(zhuǎn)入βG的大腸桿菌相比，轉(zhuǎn)入CBP的大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期更短，生物量更高，對(duì)發(fā)酵抑制物如乙酸、丁醇等有更好的耐受性。因此，在降解纖維二糖時(shí)，CBP有更高的應(yīng)用價(jià)值。

目前，CBP主要來(lái)源于厭氧細(xì)菌，如Ruminococcusalbus[9]、Cellvibriogilvus[10]、Clostridiumstercorarium[6]、Ruminococcusflavefaciens[11]、Formsannosus[12]、Thermotoganeapolitana[13]、Clostridiumthermocellum[14]、Thermotogamaritima[15]等菌株，其培養(yǎng)受到嚴(yán)格厭氧條件的限制。因此，不斷發(fā)現(xiàn)新型產(chǎn)CBP的菌株對(duì)纖維素資源化利用具有重要意義[16-17]。牛瘤胃液可以高效降解纖維素，是豐富的纖維素降解菌來(lái)源庫(kù)。鑒于此，從牛瘤胃液中篩選新型CBP產(chǎn)生菌，以進(jìn)一步豐富CBP的來(lái)源，并初步探索其發(fā)酵條件，以更加有效地利用纖維素資源。

1 材料和方法

1.1 試劑

α-D-葡萄糖-1-磷酸、D-木糖、二硫蘇糖醇(DTT)購(gòu)自TaKaRa公司；纖維二糖、對(duì)硝基酚呋喃葡萄糖苷(pNPG)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)自Sigma公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母浸出物購(gòu)自O(shè)xiod公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 牛瘤胃液的采集

供試牛由鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校獸醫(yī)院提供。選取1頭停奶期的健康奶牛，在采樣前1個(gè)月內(nèi)禁止使用抗生素藥物，采集瘤胃液前7 d，加大纖維飼料的飼喂量。采樣時(shí)，奶牛飲水2 h后，將導(dǎo)胃管自奶牛鼻孔插入，使其順食道進(jìn)入奶牛瘤胃，使用虹吸法收集瘤胃液800 mL，裝入棕色瓶密封后避光、冰浴保存[18]。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 痕量營(yíng)養(yǎng)液 每升培養(yǎng)基含F(xiàn)eSO40.2 g、MnSO40.15 g、ZnCl20.3 g、CoCl20.4 g，定容至1 000 mL，分裝后4 ℃保存。

1.3.2 無(wú)細(xì)胞瘤胃液的制備 取120 mL瘤胃液，經(jīng)2層紗布過(guò)濾除去不溶性植物纖維，4 ℃、4 200 r/min離心15 min，上清即為無(wú)細(xì)胞瘤胃液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 CMC-Na初篩培養(yǎng)基 每升培養(yǎng)基含CMC-Na 20 g、KH2PO42 g 、(NH4)2SO41.4 g、MgSO40.3 g、CaCl20.3 g、痕量營(yíng)養(yǎng)液1 mL、半胱氨酸1 g、無(wú)細(xì)胞瘤胃液100 mL、瓊脂粉20 g。

1.3.4 加富CMC-Na培養(yǎng)基 每升培養(yǎng)基含CMC-Na 20 g、纖維二糖2 g、 KH2PO42 g、(NH4)2SO41.4 g、MgSO40.3 g、CaCl20.3 g、蛋白胨0.5 g、 酵母浸出物0.5 g、痕量營(yíng)養(yǎng)液1 mL、半胱氨酸1 g、無(wú)細(xì)胞瘤胃液100 mL、瓊脂粉20 g。

1.3.5 纖維二糖培養(yǎng)基 每升培養(yǎng)基含纖維二糖4 g、(NH4)2SO44 g、Na2HPO44 g、CaCl20.5 g、MgSO40.5 g、瓊脂粉15 g。

1.4 纖維二糖利用菌株的篩選

使用CMC-Na初篩培養(yǎng)基對(duì)瘤胃菌進(jìn)行初步篩選，然后在加富CMC-Na培養(yǎng)基上分離純化。將獲得的菌株進(jìn)行剛果紅染色，測(cè)量其透明圈大小。將透明圈較大的菌株接種于纖維二糖培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩，獲得能以纖維二糖為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株。

1.5 篩選菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定 參考《伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)》，對(duì)目的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、V-P試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，進(jìn)行分類鑒定[19]。

1.5.2 16S rDNA的序列與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 以通用引物27F/1492R對(duì)目的菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為27F： 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，初步確定菌種的種屬關(guān)系。從比對(duì)結(jié)果中選取與目的菌株相似度較高的16S rDNA序列，用CLUSTALX進(jìn)行多序列比對(duì)，然后用PHYLIP構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 篩選菌株產(chǎn)CBP活力分析

1.6.1 粗酶液的制備 菌株培養(yǎng)液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體，Tris-HCl Buffer重懸菌體，在冰上超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集上清，即獲得粗酶液。

1.6.2 βG活力的測(cè)定 以pNPG為底物測(cè)量βG活力，反應(yīng)體系：50 μL粗酶液、50 μL底物、100 μL pH值為 4.8的醋酸鈉緩沖液，在水浴鍋中反應(yīng)10 min，加入3 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于408 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，計(jì)算對(duì)硝基酚(pNP)的濃度。βG活力單位定義為：50 ℃、pH值為 4.8條件下，每分鐘生成1 μmol pNP所需的酶量。

1.6.3 CBP活力測(cè)定 采用合成方向的酶活力測(cè)定方法：以木糖和G-1-P為底物，在CBP的催化作用下合成纖維二糖，并釋放出無(wú)機(jī)磷，以無(wú)機(jī)磷的釋放量作為酶活力的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在200 μL的反應(yīng)體系中，含有終濃度為5 mmol/L的 Mg2+、40 mmol/L的 G-1-P、10 mmol/L 的DTT、400 mmol/L的木糖、50 mmol/L pH 值為7.5的Tris/HCl緩沖液、50 μL粗酶液。反應(yīng)液于37 ℃溫浴15 min后，加入2.0 mL 15 mmol/L鉬酸銨溶液，終止反應(yīng)，再加入0.5 mL 10 %的抗壞血酸，在30 ℃下溫浴15 min進(jìn)行顯色，最后在850 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。CBP活力單位定義為：在37 ℃、pH值為7.5條件下，每15 min釋放出1 mmol無(wú)機(jī)磷所需要的酶量。

1.7 篩選菌株產(chǎn)CBP條件的優(yōu)化

1.7.1 溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 將篩選菌株接種至纖維二糖液體培養(yǎng)基，分別于37、41 ℃條件下，測(cè)定培養(yǎng)24、36、48 h時(shí)菌株產(chǎn)CBP活力，確定產(chǎn)CBP的最適溫度和最佳時(shí)間。

1.7.2 裝液量和溶氧量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在靜止、振蕩、真空3種條件下，分別向250 mL三角瓶中裝入30、50、70 mL的纖維二糖液體培養(yǎng)基，接種后37 ℃培養(yǎng)24 h，檢測(cè)產(chǎn)CBP活力，確定產(chǎn)CBP的最佳裝液量和溶氧量。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維二糖利用菌株的篩選結(jié)果

采用CMC-Na初篩培養(yǎng)基和加富CMC-Na培養(yǎng)基初篩并富集瘤胃液中能夠利用纖維素鈉的菌株，經(jīng)剛果紅染色發(fā)現(xiàn)，有16株菌株透明圈直徑大于7 mm。

將上述16株初篩菌株分別在LB培養(yǎng)基和纖維二糖培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，結(jié)果顯示，16株菌株在LB培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，只有菌株CF51和BY-a可以在纖維二糖培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)(圖1)，表明菌株CF51和BY-a可以利用正常纖維二糖。

圖1 菌株在2種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

2.2 菌株BY-a和CF51利用纖維二糖方式的鑒定結(jié)果

菌株CF51和BY-a的細(xì)胞裂解液均沒有檢測(cè)到βG活力，但菌株BY-a有CBP活性?？梢姡闎Y-a能產(chǎn)生CBP，并通過(guò)磷酸解途徑降解纖維二糖。菌株CF51沒有顯示出CBP活性，推測(cè)該菌株是以分泌胞外βG的方式利用纖維二糖。

2.3 BY-a菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)及生理生化鑒定 BY-a菌株能在纖維二糖培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，圓形菌落呈乳白色，邊緣整齊。鏡檢顯示，BY-a菌株為桿狀革蘭氏陰性菌。生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，BY-a菌株過(guò)氧化氫酶及V-P試驗(yàn)均為陽(yáng)性，可產(chǎn)CBP(表1)。

表1 菌株BY-a生理生化特性

2.3.2 16S rDNA的序列與系統(tǒng)進(jìn)化樹 由圖2可見，BY-a菌株的16S rDNA序列與Klebsiellavariicolastrain CPB S30的16S rDNA序列相似度為100%。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可以確定菌株BY-a為克雷伯氏菌(Klebsiella)。

圖2 菌株BY-a的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 BY-a菌株產(chǎn)CBP的條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 溫度和時(shí)間 如圖3所示，37 ℃培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵液的CBP活力較41 ℃時(shí)高，因此，37 ℃更適合BY-a菌株產(chǎn)CBP。此外，37 ℃培養(yǎng)時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力降低，24 h時(shí)酶活力最高，為0.454 U/mL，48 h時(shí)酶活力減半。而溫度為41 ℃時(shí)，發(fā)酵液酶活力不隨時(shí)間改變。

圖3 溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)CBP的影響

2.4.2 裝液量和溶氧量 如圖4所示，不同程度的溶氧對(duì)菌株產(chǎn)CBP有影響，振蕩培養(yǎng)時(shí)CBP活力最高，真空培養(yǎng)時(shí)CBP活力最低。在靜止與真空條件下培養(yǎng)時(shí)，裝液量大小對(duì)CBP活力幾乎沒有影響。而在振蕩培養(yǎng)時(shí)，CBP活力隨裝液量增加而減少，在30 mL(250 mL)時(shí)最高，為0.490 U/mL。

圖4 裝液量和溶氧量對(duì)產(chǎn)CBP的影響

3 結(jié)論與討論

在纖維素的酶解過(guò)程中，中間產(chǎn)物纖維二糖的降解有水解和磷解2種方式。粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)等真菌利用胞內(nèi)βG將其完全水解[20]。熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)等細(xì)菌利用CBP將胞內(nèi)纖維二糖進(jìn)一步分解。相比之下，CBP的磷解作用更具有生物能學(xué)優(yōu)勢(shì)。目前，CBP主要存在于厭氧菌中，培養(yǎng)條件嚴(yán)格受限，不易大量獲取高純度酶，因此，發(fā)現(xiàn)新型的產(chǎn)CBP的菌株對(duì)該酶的利用具有一定的價(jià)值。

本研究從牛瘤胃中篩選到1株CBP產(chǎn)生菌BY-a，經(jīng)鑒定其為克雷伯氏菌(Klebsiella)。王炳曉等[21]從奶牛瘤胃中也篩選到1株克雷伯氏菌，該菌在有氧或無(wú)氧時(shí)均能產(chǎn)生纖維素酶。但目前尚未有克雷伯氏菌產(chǎn)CBP的報(bào)道。因此，這將為纖維二糖的降解利用提供新的候選菌株。此外，BY-a是兼性厭氧菌，具有獨(dú)特的產(chǎn)酶性質(zhì)，菌株在好氧條件下培養(yǎng)時(shí)，CBP活力比厭氧時(shí)高。這不僅將大大降低菌體培養(yǎng)的難度與成本，還豐富了纖維二糖降解酶系資源。而菌株CF51雖然能夠利用纖維二糖為唯一碳源生長(zhǎng)，但未能檢測(cè)到胞內(nèi)βG活力，可能是該菌主要以分泌到胞外的βG來(lái)降解纖維二糖，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

初步優(yōu)化后，BY-a菌株在裝液量為30 mL、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h時(shí)產(chǎn)CBP活力最高。雖然牛瘤胃的生理溫度為41 ℃，但BY-a菌株在37 ℃時(shí)更適合產(chǎn)酶。CBP活力自24 h持續(xù)降低，沒有出現(xiàn)峰值，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中0.4 %的纖維二糖含量較少，菌體在24 h前已停止生長(zhǎng)。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間，并進(jìn)一步提高酶活力。

本研究下一步將純化兼性厭氧菌BY-a的CBP蛋白，并探究其酶學(xué)性質(zhì)，以更好地闡明纖維素利用機(jī)制及獲取有益的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化所需酶資源。

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Screening and Fermentation Conditions of Cellobiose Phosphory-lase-producing Bacteria from Bovine Rumen

ZHANG Qingqing,FAN Haiyan,XU Xinhui,ZHANG Lulu,CHEN Hongge*

(College of Life Science,Henan Agriculture University/Key Laboratory of Enzyme Engineering of Agricultural Microbiology,Ministry of Agriculture,Zhengzhou 450002,China)

To obtain a novel CBP-producing strain,the bovine rumen fluid was screened using selective culture for the strains which could grow with cellobiose as the sole carbon source.The mode i.e.,hydrolysis or phosphorolysis that the strains degrade cellobiose was further identified.The CBP-producing strain named BY-a was obtained.The targeted strain’s taxonomic status was identified asKlebsiellabased on its physiological,biochemical characteristics,and 16S rDNA phylogenetic analysis.Then the fermentation conditions of the strain for enzyme production were optimized.The highest enzyme activity was obtained under 37 ℃ at 24 h,with 30 mL liquid in 250 mL flask.

bovine rumen fluid; cellobiose; cellobiose phosphorylase; fermentation conditions

2016-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571775)

張青青(1991-)，女，河南平頂山人，在讀碩士研究生，研究方向：微生物酶工程。E-mail:15903645518@163.com

*通訊作者：陳紅歌(1967-)，女，河南許昌人，教授，博士，主要從事微生物酶的研究與開發(fā)。E-mail:honggeyz@163.com

S816.7

A

1004-3268(2017)04-0113-05