正交試驗優(yōu)化白術(shù)配方顆粒的索氏提取工藝Δ

李功華，李洪玉，費 瑩，壽 旦#（1.浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部，杭州 1001；.浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心，杭州 10007；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 1005）

正交試驗優(yōu)化白術(shù)配方顆粒的索氏提取工藝Δ

李功華1＊，李洪玉2，費 瑩3，壽 旦2#（1.浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部，杭州 310012；2.浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心，杭州 310007；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053）

目的：優(yōu)化白術(shù)藥材的索氏提取工藝，為其配方顆粒的研制提供依據(jù)。方法：以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取時間、料液比、提取次數(shù)為因素，采用L9（34）正交試驗，優(yōu)化及驗證白術(shù)配方顆粒的索氏提取工藝并與其他3種工藝（常溫浸提法、超聲提取法、回流提取法）進行比較。結(jié)果：優(yōu)化的提取工藝為用6倍藥材量乙醇提取3次，共提取8 h；驗證試驗結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯3次提取量分別為0.769、0.752、0.781 mg/g（RSD＝1.99%，n＝3），均高于其他3種方法的提取量（0.683、0.489、0.693 mg/g）。結(jié)論：優(yōu)化后的提取方法對白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的提取效率較高，可用于配方顆粒制備時白術(shù)中內(nèi)酯成分的提取。

白術(shù)；白術(shù)內(nèi)酯；索氏提??；工藝優(yōu)化；正交試驗

白術(shù)為菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖，味苦，性甘、溫，歸脾、胃經(jīng)，具健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功效[1]。白術(shù)屬于脾胃病常用藥，臨床廣泛應(yīng)用于治療便秘、泄瀉等癥[2]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ既是白術(shù)的特征性成分，也是白術(shù)的主要活性成分，其通常作為評價白術(shù)飲片及配方顆粒質(zhì)量的重要指標(biāo)[3-4]。中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，以炮制加工的中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代化科學(xué)提取、濃縮、干燥、制粒等工序精制而成的粉末或顆粒狀制劑，具有免煎易服、安全有效、攜帶方便等優(yōu)點[5]。

由于白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ含量較低，性質(zhì)不穩(wěn)定，該類成分的提取常采用水蒸氣蒸餾法、乙醇加熱回流法、CO2超臨界萃取法和索氏提取法等[6-9]，其中索氏提取工藝在工業(yè)化的中藥浸膏提取中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。為了充分提取白術(shù)飲片的有效成分，筆者先采用單因素試驗篩選白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯類成分的提取方式，建立白術(shù)中3種內(nèi)酯成分的高效液相色譜（HPLC）定量測定方法，再采用正交試驗對白術(shù)索氏提取工藝進行優(yōu)化[9]，期望為進一步開展白術(shù)內(nèi)酯的藥理研究及白術(shù)配方顆粒的工業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC20A-VP HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20A自動進樣器（日本島津有限公司）；BS210S電子天平（德國賽多利斯有限公司）；索氏提取器（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)玻璃儀器廠）。

1.2 藥材、對照品與試劑

白術(shù)（華東醫(yī)藥股份有限公司，批號：20151024，經(jīng)浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部余平副主任中藥師鑒定為菊科植物白術(shù)）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號：MUST-14012005，純度：＞98%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號：MUST-11122211，純度：＞98%）均購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心，批號：20150316，純度：＞98%）；甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇為藥用級，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：SHISEIDO CAPCELPAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～16 min，60%A～70%A；16～18 min，70%A～65%A；18～30 min，65%A）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ均為220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ為276 nm。取“2.2”項下3種對照品和供試品溶液（正交試驗7號）進樣分析，結(jié)果在該系統(tǒng)條件下各峰分離度良好，3種內(nèi)酯成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以3種成分計均大于3 000，系統(tǒng)適用性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品各10.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，制成對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取白術(shù)粗粉10 g，放在濾紙包內(nèi)，置于索氏提取器中，提取器下端與盛有提取溶劑的圓底燒瓶相連接，上接回流冷凝管。85℃恒溫水浴加熱，從開始出現(xiàn)虹吸計時，提取結(jié)束后停止加熱，放冷，取出提取液。按優(yōu)化后的提取方法重復(fù)提取，合并提取液，置于250 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得不同條件的索氏提取溶液。取上清液過0.22μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

將白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品溶液依次稀釋制備成5個質(zhì)量濃度梯度溶液，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，以進樣量（ng）為x軸、峰面積為y軸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性方程。結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積在線性范圍內(nèi)與進樣量呈良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

2.4 含量測定方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD分別為1.02%、1.31%、0.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表1 3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Results of linear relationship of 3 components

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，測定峰面積。結(jié)果，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD分別為1.14%、1.03%、1.22%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取白術(shù)粗粉6份，每份10 g，按“2.2.2”項下方法操作制備供試品溶液，進樣，測定峰面積。結(jié)果，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD分別為1.64%、1.26%、0.99%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收試驗 取白術(shù)粗粉9份，每份10 g，按照高、中、低比例，分別精密加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品，按“2.2.2”項下方法操作制備供試品溶液，進樣，測定峰面積，計算含量及加樣回收率。結(jié)果，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均加樣回收率分別為99.76%、100.08%、98.81%（RSD分別為1.06%、1.67%、1.58%，n＝9）。

2.5 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ索氏提取工藝的優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗 以提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量為評價指標(biāo)，考察單因素對提取率的影響。精密稱取白術(shù)飲片粗粉10 g，按照“2.2.2”項下制備方法，分別設(shè)計料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，提取總時間（即回流提取加熱時間）4、6、8、10 h，提取次數(shù)1、2、3、4次4個水平的單因素試驗條件，測定提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，得出各因素的最優(yōu)范圍。

單因素試驗結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的提取率隨料液比的增大，有效成分提取率呈升高趨勢；當(dāng)料液比達(dá)到1∶12時，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ有下降趨勢，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ增加不明顯。在考察時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)，采用索氏提取8 h后，已基本提取完全；提取次數(shù)則以3次為宜。

2.5.2 正交試驗 （1）因素與水平設(shè)計。在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定提取時間（A，h）、料液比（B，溶劑量）、提取次數(shù)（C）3個因素的3個水平。因素與水平見表2。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

（2）正交試驗方法與結(jié)果。精密稱取白術(shù)粗粉9份，每份10 g，放在濾紙包內(nèi)，置于索氏提取器中，按L9（34）正交試驗安排進行索氏提取，提取液過濾，減壓除盡乙醇，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶并定容，得供試品溶液1～9號。測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，以3種成分的含量總和為指標(biāo)，進行極差和方差分析。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

從表3極差R值看出，各因素對提取效果的影響大小依次為B＞A＞C。再結(jié)合方差分析，綜合考慮提取效率與能耗因素，確定最優(yōu)提取工藝組合為A3B1C3，即加6倍乙醇，提取3次，提取總時間8 h，每次為3、3、2 h。

（3）驗證試驗。精密稱取同一批白術(shù)粗粉3份，每份100 g，放在濾紙包內(nèi)，按優(yōu)化的提取方法，進行提取方法驗證。經(jīng)含量測定，3次提取樣品中白術(shù)內(nèi)酯含量總和分別為0.769、0.752、0.781 mg/g，RSD＝1.99%（n＝3），表明本研究所確定的提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.6 不同提取方法的比較

采用以下3種方法[11]對100 g白術(shù)藥材進行提取效果的比較。常溫浸提法：8倍溶劑，常溫浸提3 d；超聲提取法：8倍溶劑，超聲提取3次，每次30 min；回流提取法：8倍溶劑，提取3次，每次提取時間為3、3、2 h。將各提取方法所得產(chǎn)品含量測定結(jié)果與“2.5”項結(jié)果比較，提示索氏提取法獲得的白術(shù)內(nèi)酯含量總和最高。3種方法提取的白術(shù)內(nèi)酯含量結(jié)果見表5。

表5 3種方法提取白術(shù)內(nèi)酯的含量結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of the contents of atractylenolide by 3 kinds of methods（n＝3）

3 討論

索氏提取法利用溶劑回流和虹吸原理，使固體中的可溶物富集到燒瓶內(nèi)，同時蒸氣通過導(dǎo)氣管上升，被冷凝為液體滴入提取器中，從而實現(xiàn)使固體物質(zhì)每次都能被純凈的溶劑所萃取，故具有萃取效率高、提取雜質(zhì)少等優(yōu)點，尤其適用于小分子、低沸點、受熱不穩(wěn)定成分的提取[12]。

前期研究中，筆者按照浸提法和超聲提取法提取白術(shù)內(nèi)酯，結(jié)果提示，索氏提取法提取效率最高，因而最終采用索氏提取法作為白術(shù)的提取方法進行進一步的提取方法優(yōu)化。

筆者前期曾對不同種類的提取溶劑（甲醇、75%乙醇、乙酸乙酯、石油醚）進行考察，結(jié)果提示，75%乙醇、乙酸乙酯、石油醚等溶劑提取的樣品內(nèi)酯含量低、樣品色譜分析峰形差；而甲醇與乙醇提取的樣品中白術(shù)內(nèi)酯含量最高、各峰分離完全?？紤]后續(xù)藥效實驗及實際生產(chǎn)安全性，選擇乙醇為提取溶劑。

有研究表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，受熱易轉(zhuǎn)化[13]，而本研究采用索氏提取法可避免有效成分在高溫下?lián)p失。另外，所篩選的最優(yōu)提取工藝，與浸提法、超聲提取法及回流提取方法比較，提取率高，并適合大規(guī)模工業(yè)化中藥配方顆粒的提取生產(chǎn)。

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Optimization of the Soxhlet Extraction Technology of Atractylodes macrocephala Formula Granules by Orthogonal Test

LI Gonghua1，LI Hongyu2，F(xiàn)EI Ying3，SHOU Dan2（1.Dept.of Pharmacy，Zhejiang Provincial Tongde Hospital，Hangzhou 310012，China；2.TCM Research Center，Zhejiang Academy of TCM，Hangzhou 310007，China；3.School of Pharmacy，Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310053，China）

OBJECTIVE：To optimize the soxhlet extraction technology of Atractylodis macrocephalae，and to provide evidence for research and preparation of its formula granules.METHODS：Using the contents of atractylenolideⅠ，Ⅱ，Ⅲas index，based on single factor test，the Soxhlet extraction technology of A.macrocephalae formula granules was optimized and verified by L9（34）orthogonal test with extraction time，solid-liquid ratio，extraction times as factors，and then compared with other technologies（normal temperature extraction method，ultrasonic extraction method，reflux extraction method）.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as 6-fold ethanol，extracting for 3 times，lasting for 8 h.Results of validation test showed that the extraction amounts of atractylenolide were 0.769，0.752，0.781 mg/g（RSD＝1.99%，n＝3）for 3 times，which were higher than the extraction amounts of other 3 methods（0.683，0.489，0.693 mg/g）.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology possesses high extraction rates of atractylenolideⅠ，Ⅱ，Ⅲ，and can be used for the extraction of internal ether from A.macrocephalae formula granules.

Atractylodis macrocephalae；Atractylenolide；Soxhlet extraction；Technology optimization；Orthogonal test

R284.2

A

1001-0408（2017）07-0964-03

2016-06-22

2016-08-26）（編輯：劉 萍）

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2016ZB008）

＊副主任藥師。研究方向：藥物制劑。E-mail：ligonghua88@163. com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥制劑開發(fā)與研究。E-mail：shoudanok@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.29