12個(gè)金針菇菌株菌絲的生長速度及胞外酶活力比較

趙淑英++王立安

摘要：主要比較了生產(chǎn)上常用的12個(gè)金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]菌株菌絲的生長速度及菌落特征，同時(shí)，對12個(gè)菌株的胞外酶，如羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶的活力進(jìn)行了測定，以期找出菌絲生長速度與胞外酶活力的相關(guān)性，為正確評價(jià)菌種質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，12個(gè)菌株間菌絲生長速度存在差異，在PDA加富培養(yǎng)基上生長較快的菌株是9號和12號；在模擬出菇培養(yǎng)基上生長較快的菌株是7號、8號和12號。羧甲基纖維素酶活力最高的菌株是5號，木聚糖酶和漆酶活力最高的菌株是1號。胞外酶活力大小表現(xiàn)的順序與生長速度偶聯(lián)性較差。

關(guān)鍵詞：金針菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]；生長速度；羧甲基纖維素酶；木聚糖酶；漆酶

中圖分類號：S646.1+5∶Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5849-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.032

Study on the Hypha Growth Speed and Extracellular Enzymes Activity of 12 Strains of Flammulina velutiper

ZHAO Shu-ying1，WANG Li-an2

（1. College of Physical Education， Cangzhou Normal University， Cangzhou 061001， Hebei， China；

2. College of Life Science， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050021， China）

Abstract： The hypha growth speed and colony characteristics of 12 stains of Flammulina velutiper （Fr.） Sing commonly used on the production was compared. Moreover， the activity of their extracellular enzymes， such as Carboxymethyl cellulose， xylanase， laccase enzyme were determined in order to find out the relationship between hypha growth rate and extracellular enzyme activity so as to provide scientific basis for evaluation of strain quality. The experimental results show that the growth speed of strain No.9 and No.12 was faster than the others on PDA medium with rich inorganic salts and vitamin； while the growth speed of strain No.7， No.8， and No.12 was faster than others on simulated mushroom medium. Carboxymethyl cellulase is the most active in strain No.5； while xylanase and laccase is the most active in strain No.1. The contingency between extracellular enzyme activity and speed coupling is poorer.

Key words： Flammulina velutiper （Fr.） Sing.； growth speed； CMC cellulose； xylanase； laccase

金針菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing.]是味道鮮美、營養(yǎng)豐富的食用菌之一，同時(shí)又具有良好的保健價(jià)值，在國內(nèi)許多地區(qū)都有栽培，金針菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展起到了重要推動(dòng)作用。但在金針菇生產(chǎn)上也出現(xiàn)一些問題，一是所用金針菇菌種普遍退化、老化，造成菇農(nóng)栽培風(fēng)險(xiǎn)加大，經(jīng)濟(jì)效益下滑；二是金針菇菌種市場極為混亂。由于目前食用菌菌種質(zhì)量評價(jià)的科學(xué)體系還不完善，菌種質(zhì)量和產(chǎn)銷管理薄弱，一定程度上造成了食用菌菌種雜、多、亂的混亂現(xiàn)象，嚴(yán)重?fù)p害了菇農(nóng)利益。為了解決以上問題，試驗(yàn)選擇12個(gè)金針菇菌株為材料，通過測定胞外酶活力，試圖建立快速評價(jià)菌種質(zhì)量的檢測體系，即找出胞外酶活力與生長速率的內(nèi)在聯(lián)系，從而建立不同菌株的酶活力數(shù)據(jù)庫來評價(jià)菌種質(zhì)量，為金針菇菌種質(zhì)量保障提供技術(shù)支撐?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

12個(gè)不同金針菇菌株均為當(dāng)?shù)亟疳樄街髟跃N，現(xiàn)保存于河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。具體編號為1號：白金F21；2號：金針FV093；3號：金針1008；4號：金科佳2041；5號：金針日金1號；6號：金F39；7號：金針1301；8號：金針2102；9號：三明B；10號：金雜19；11號：福建白金針；12號：三明C。

主要儀器有756MC紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、電磁爐、電子分析天平、RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、振蕩器、78-1磁力加熱攪拌器、立式自動(dòng)電熱蒸汽滅菌器等。

胞外酶活力測定的主要試劑有3，5-二硝基水楊酸（DNS，顯色劑）、醋酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.6）、鄰聯(lián)甲苯胺、木聚糖溶液，底物為1%的羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2 菌種培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)基 分別制作PDA培養(yǎng)基、PDA加富培養(yǎng)基、模擬出菇培養(yǎng)基。

1.2.2 不同菌株菌絲生長速度的測定 將4 ℃冰箱保存的試管母種分別接種到PDA加富培養(yǎng)基平板上，25 ℃下培養(yǎng)7 d后備用[1]。將活化的菌絲沿菌落的邊緣用打孔器切下直徑8 mm的菌塊，分別接種于PDA加富培養(yǎng)基平板及模擬出菇培養(yǎng)基平板上，每個(gè)菌種3次重復(fù)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d后每天定時(shí)精確測量菌落半徑，同時(shí)觀察記錄菌株的菌落形態(tài)，按下式計(jì)算菌絲生長速度[2]，

菌絲生長速度（mm/d）=菌落半徑（mm）/菌絲生長天數(shù)（d）。

1.3 胞外酶活力測定

1.3.1 酶液的制備 將在模擬出菇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落沿菌落邊緣挖取發(fā)菌料各1 g于試管中，加入0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液10 mL（pH 4.6），4 ℃浸提4 h；將浸提液用濾紙過濾即得粗酶液。用于測定羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活力，測定時(shí)將各酶液稀釋10倍[3]。

1.3.2 羧甲基纖維素酶活力測定 參考文獻(xiàn)[4]的方法。①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，準(zhǔn)確稱量0.1 g葡萄糖，加去離子水定容至100 mL，配成濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照表1中不同的梯度進(jìn)行稀釋，制成梯度溶液。每試管分別取樣2.5 mL，分別加2.5 mL DNS置于沸水浴5 min后顯色，冷卻后，于紫外可見分光光度計(jì)530 nm處測OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。②羧甲基纖維素酶活力的測定，將1%的羧甲基纖維素鈉溶液與稀釋后的粗酶液在50 ℃預(yù)熱1～2 min，在試管中依次加入預(yù)熱后的2.0 mL 1%的羧甲基纖維素鈉溶液和0.5 mL稀釋后的粗酶液，50 ℃水浴30 min，取出后立即加入DNS試劑2.5 mL，100 ℃水浴中保溫5 min，取出后用冷水冷卻，于530 nm處測OD值，對照管加DNS試劑后再加相應(yīng)酶液，每組設(shè)1個(gè)對照、2次重復(fù)。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后的光密度改變值表示。羧甲基纖維素酶活力單位定義為在50 ℃、pH 4.6條件下，反應(yīng)30 min，每分鐘每毫升羧甲基纖維素酶催化纖維素類物質(zhì)水解生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1 U。按下式計(jì)算酶活力，

羧甲基纖維素酶活力=N×葡萄糖的生成量/30/0.5×2.5，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數(shù)，葡萄糖的生成量從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出，30表示酶促反應(yīng)的時(shí)間（min）；0.5代表反應(yīng)中加的酶量（mL）；2.5為反應(yīng)的總體積（mL）。

1.3.3 木聚糖酶活力的測定 木聚糖酶活力為各菌株在模擬出菇培養(yǎng)基上生長第八天所測得，參考文獻(xiàn)[5]的方法，先將pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液、1%的木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃預(yù)熱1～2 min；然后在試管中依次加入pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液1 mL、1%的木聚糖溶液0.5 mL、稀釋后的粗酶液0.5 mL，40 ℃水浴30 min；取出后立即加入DNS試劑3 mL，100 ℃水浴中保溫5 min，取出后用水冷卻，于510 nm波長處測OD值。對照管加DNS試劑后再加相應(yīng)的酶液，每組設(shè)1個(gè)對照、2次重復(fù)。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后吸光度的改變表示。木聚糖酶活力單位定義為在40 ℃、pH 4.6條件下，反應(yīng)30 min，每分鐘每毫升木聚糖酶催化底物產(chǎn)生0.1吸光度的變化為1 U。按下式計(jì)算木聚糖酶活力，

木聚糖酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數(shù)；30表示酶促反應(yīng)的時(shí)間（min）；0.5代表反應(yīng)中加的酶量（mL）；0.1為吸光度的變化數(shù)值。

1.3.4 漆酶活力的測定 漆酶活力為各菌株在模擬出菇培養(yǎng)基上生長第八天所測得，參考文獻(xiàn)[6]的方法，先將3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺溶液、pH 4.6 的醋酸鈉緩沖溶液及粗酶液于28 ℃預(yù)熱1～2 min；然后往試管中依次加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.5 mL、pH 4.6的醋酸鈉緩沖溶液3.5 mL、0.5 mL粗酶液，28 ℃保溫30 min后，以煮沸滅活的酶液作對照，600 nm處測OD值，每組設(shè)1個(gè)對照、2次重復(fù)，酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后吸光度值的改變表示。漆酶活力單位定義為在28 ℃、pH 4.6條件下，反應(yīng)30 min，每分鐘每毫升漆酶催化底物產(chǎn)生0.1個(gè)吸光度的變化為1 U。按下式計(jì)算漆酶活力，

漆酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，

式中，N為固體原料加水浸提所得的酶液稀釋倍數(shù)；30表示酶促反應(yīng)的時(shí)間（min）；0.5代表反應(yīng)中加的酶量（mL）；0.1為吸光度的變化數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其制表和繪圖，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個(gè)金針菇菌株的菌絲生長特性比較

12個(gè)金針菇菌株在PDA加富培養(yǎng)基及模擬出菇培養(yǎng)基上的菌絲生長速度及生長狀況測定結(jié)果分別見表2、圖1、圖2，在PDA加富培養(yǎng)基上的菌絲生長速度方差分析結(jié)果見表3，在模擬出菇培養(yǎng)基上的菌絲生長速度方差分析結(jié)果見表4。從表2、表3、表4、圖1、圖2分析可知，在PDA加富培養(yǎng)基上，12個(gè)金針菇菌株的菌絲生長速度可分為4組， A組有9號和12號菌株，B組含10號、7號、3號、11號、8號、5號，C組為1號；D組為6號、2號和4號，生長速度總體趨勢為A>B>C>D。各組的方差分析結(jié)果表明，A組和B組菌絲生長速度之間無顯著差異（P>0.05），同屬生長較快的菌株；C組與B組菌絲生長速度相比無顯著差異（P>0.05），但卻顯著低于A組（P<0.05）；D組菌絲生長速度較慢，且與A、B、C組差異顯著（P<0.05）。在PDA加富培養(yǎng)基上總方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=18.72，P=0.000 000，P<0.05，說明不同菌株在PDA加富培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異。在模擬出菇培養(yǎng)基上，12個(gè)金針菇菌株的菌絲生長速度可分為5組，A′組是12號和8號，B′組含7號、10號、6號、9號、4號、3號、5號，C′組有1號；D′組有2號，E′組有11號。生長速度的總體趨勢是A′>B′>C′>D′>E′。各組的方差分析結(jié)果表明，A′組和B′組之間無顯著差異（P>0.05），同屬生長較快的菌株；C′組和B′組之間無顯著差異（P>0.05），但要顯著低于A′組（P<0.05）；D′組和C′組之間無顯著差異（P>0.05），但卻顯著慢于A′組和B′組（P<0.05）；E′組菌絲生長速度要顯著慢于A′組、B′組、C′組和D′組（P<0.05）。在模擬出菇培養(yǎng)基上總方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)=12.981，P=0.000 000，P<0.05，說明不同菌株在模擬出菇培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異。

2.2 12個(gè)金針菇菌株的纖維素酶活力

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，吸光度在0.2～1.4時(shí)，與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，其回歸方程為y=0.008 1x-0.253 5，R2=0.998 425，說明可用于糖的測定。

2.2.2 12個(gè)金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力 12個(gè)金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力測定結(jié)果見表5、圖4。由表5、圖4可以看出，12個(gè)金針菇菌株的羧甲基纖維素酶活力由大到小的排序依次為5號、1號、7號、4號、9號、3號、8號、2號、12號、6號、10號、11號。以5號菌株的羧甲基纖維素酶活力最高，為175.41 U，與其他11個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；11號菌株的羧甲基纖維素酶活力最低，為123.56 U，與其他11個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

2.3 12個(gè)金針菇菌株的木聚糖酶活力

12個(gè)金針菇菌株的木聚糖酶活力測定結(jié)果見表5、圖5。由表5、圖5可以看出，12個(gè)金針菇菌株的木聚糖酶活力由大到小的排序依次為1號、2號、12號、11號、9號、4號、3號、5號、7號、10號、6號、8號。以1號菌株的木聚糖酶活力最高，為3.60 U，除2號菌株外，與其他10個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；8號菌株的木聚糖酶活力最低，僅為0.76 U，除6號、7號、10號菌株外，與其他8個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

2.4 12個(gè)金針菇菌株的漆酶活力

12個(gè)金針菇菌株的漆酶活力測定結(jié)果見表5、圖6。由表5及圖6可以看出，12個(gè)金針菇菌株的漆酶活力由大到小的排序依次為1號、2號、9號、4號、12號、6號、11號、8號、5號、7號、10號、3號。以1號菌株的漆酶活力最高，為3.39 U，與其他11個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）；3號菌株的漆酶活力最低，僅為1.09 U，與其他11個(gè)菌株的酶活力差異顯著（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，12個(gè)金針菇菌株的菌絲生長速度在PDA加富培養(yǎng)基和模擬出菇培養(yǎng)基上基本是一致的，形態(tài)特征也無明顯差異。在PDA加富培養(yǎng)基和模擬出菇培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為生長較快的菌株有9號、12號、10號、7號、3號、8號、1號、5號、6號。所以可以用在PDA加富培養(yǎng)基上生長較快作為判斷菌種吃料能力的評價(jià)指標(biāo)。另外從反映菌株吃料能力的胞外酶活力測定情況看，羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶活力均較高的菌株只有1號，并且其生長速度也較高，可判斷為優(yōu)良菌株；9號、12號各項(xiàng)指標(biāo)也表現(xiàn)較好，也可視為優(yōu)質(zhì)菌種[7]。

試驗(yàn)的初衷是建立金針菇不同菌株的質(zhì)量評價(jià)體系，所以搜集的菌種均為各地的高產(chǎn)主栽菌種。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，大多數(shù)金針菇菌株在PDA加富培養(yǎng)基和模擬出菇培養(yǎng)基上的生長速度均較快，說明參試菌株多數(shù)品質(zhì)優(yōu)良。此外，試驗(yàn)通過測定胞外酶活力試圖建立快速評價(jià)菌種質(zhì)量的檢測體系，即找出胞外酶活力與生長速度的內(nèi)在聯(lián)系，通過建立不同菌株的酶活力數(shù)據(jù)庫來評價(jià)菌種質(zhì)量。但試驗(yàn)結(jié)果顯示，還有很多問題需要進(jìn)一步探討，如有的菌株在2種培養(yǎng)基上的生長速度不一致，如11號在PDA加富培養(yǎng)基上生長的速度較快，但在模擬出菇培養(yǎng)基上生長最慢；還有就是胞外酶活力大小的順序與生長速度偶聯(lián)性較差，如2號菌株為生長速度較慢的菌株，但其木聚糖酶、漆酶的活力卻較高。

為了克服誤差，試驗(yàn)進(jìn)行了多次重復(fù)，但仍存在這些問題?？赡艿脑蛞皇菂⒃嚨木昃g不一致，由于參試材料來自各地，菌齡已無從查考。但一個(gè)明顯的事實(shí)是菌株的生長速度與菌株的傳代次數(shù)相關(guān)，傳代次數(shù)越多，菌株生長能力越弱；菌株生長速度與菌株的適應(yīng)能力也有關(guān)，從一種培養(yǎng)基到另一種培養(yǎng)基，菌株需要有一段適應(yīng)時(shí)間，培養(yǎng)基成分相差越大，菌株生長速度就越慢。從試驗(yàn)結(jié)果看出，相同的菌株在不同的培養(yǎng)基上生長速度不同，不同的菌株在相同的培養(yǎng)基上生長速度也不同。整體上比較，菌株在PDA加富培養(yǎng)基上的生長速度高于在模擬出菇培養(yǎng)基上的生長速度。PDA加富培養(yǎng)基較模擬出菇培養(yǎng)基有更豐富的碳、氮源。為此，下一步的研究應(yīng)注意采用相同菌齡的材料來對比?？刹捎孟葘⒃嚥牧线M(jìn)行品比試驗(yàn)，再采用組織分離方法重新分離菌種，以使菌齡達(dá)到一致。二是胞外酶屬于誘導(dǎo)性酶，酶活性的高低與培養(yǎng)基的基質(zhì)有關(guān)。為了比較不同菌株的吃料能力，試驗(yàn)采用了模擬出菇培養(yǎng)基測定3種胞外酶活力。羧甲基纖維素酶的作用是分解纖維素，木聚糖酶有分解半纖維素的能力，漆酶能催化木質(zhì)素類的氧化酚類和芳香類化合物。試驗(yàn)采用的方法比一般的利用菌袋比較更利于在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及取材；但從酶活力結(jié)果看，結(jié)果并不理想?？赡艿脑蚴敲笢y定方法本身的誤差造成，因在測定過程中參考有關(guān)文獻(xiàn)方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶活力數(shù)據(jù)漂移較大，如在測各種菌株漆酶的活力時(shí)，若將反應(yīng)溫度升高至50 ℃后，液體顏色為綠色，這與文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)物為藍(lán)綠色不同；懷疑為產(chǎn)物有所改變，故將測漆酶活力的溫度固定為28 ℃。所以，建立穩(wěn)定的、標(biāo)準(zhǔn)化酶活力檢測方法將是下一步的重點(diǎn)。

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