孑遺植物雙蕊蘭菌根真菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

曲波++蔣玉玲++張藝子涵++張麗杰

摘要：以蘭科孑遺植物雙蕊蘭（Diplandrorchis sinica）菌根為材料，通過分離、純化、培養(yǎng)其菌根真菌，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用正交試驗(yàn)方法篩選溫度、碳源、氮源和培養(yǎng)基pH等培養(yǎng)條件建立雙蕊蘭菌根真菌培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，雙蕊蘭菌根真菌菌落白色或淺黃色，呈均勻輻射狀向外生長；生長面有稀松或較豐富的氣生菌絲，帶有透明液滴。通過對菌落生長速率的測定與分析，4種因素的最佳綜合水平為：碳源為半乳糖，濃度為2%；氮源為硝酸銨，濃度為0.5%；pH為6；溫度為25 ℃。菌落生長速率隨著天數(shù)的遞增而以較快的速度下降，第7天之后趨于穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：雙蕊蘭（Diplandrorchis sinica）；孑遺植物；菌根真菌；培養(yǎng)條件

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5798-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.018

Diplandrorchis Sinica Mycorrhizal Fungi Optimization of Culture Conditions

QU Bo1， JIANG Yu-ling1， ZHANG-YI Zi-han1，2， ZHANG Li-jie1

（1.Bioscience and Technology College， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；

2.College of Life Science， Inner Mongolia University， Hohhot 010021，China）

Abstract： The Orchid relict plant Diplandrorchis sinica fungi were used as materials. By separation，purification and cultured， the D. sinica mycorrhizal fungi culture system which based on the principle of orthogonal design was established， using orthogonal experimental method to set culture conditions that include temperature，carbon source，nitrogen source and medium pH. The results showed that the white or pale yellow colonies of D. sinica fungi showed the uniform radial outward growth，growth surface of sloppy or rich aerial hyphae with transparent droplets. Through measurement and analysis of colony growth rate，best level of four factors were as following： The carbon source was concentration of 2% galactose； The nitrogen source was concentration of 0.5% ammonium nitrate； pH was 6； The temperature was 25 ℃. Colony growth curve showed downward-trend， with the increase in the number of days，and finally tends to a constant value.

Key words： Diplandrorchis sinica； relict plant； mycorrhizal fungi； culture conditions

雙蕊蘭（Diplandrorchis sinica），蘭科雙蕊蘭屬植物，為單屬種，腐生蘭，是蘭科中最原始的植物之一[1]，是研究蘭科植物起源與系統(tǒng)進(jìn)化的重要材料。目前雙蕊蘭僅在遼寧省桓仁縣和新賓縣有發(fā)現(xiàn)，其種群量極少，已被列入國家保護(hù)植物名錄[2]，2012年被評估為國際自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄（IUCN）極危（Critically endangered，CR）物種[3]。雙蕊蘭生育期極短，通常8月中旬萌發(fā)，9月初開花后即凋謝，約20 d。雙蕊蘭是蘭科植物中極其罕見的原始類型，其繁殖方式至今未知。雙蕊蘭分布區(qū)域極其狹窄，種群數(shù)量極少，自然繁殖能力較弱，隨著生境的改變，分布范圍會日益縮減，若不及時采取有效措施，將有瀕臨滅絕的危險[4]，因此，有必要開展雙蕊蘭的保育生物學(xué)研究，人工促進(jìn)其種群恢復(fù)及擴(kuò)大。

蘭科菌根（Orchidaceous mycorrhizae）是蘭科植物與真菌形成的共生聯(lián)合體，在蘭科植物生長和生命活動中有重要的作用[5，6]。菌根真菌促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)，提高繁殖率，加快植株的生長，增強(qiáng)宿主的抗逆性，同時還能促進(jìn)植物產(chǎn)生許多藥用成分和新化合物等[7]。目前國內(nèi)外對于與雙蕊蘭共生的真菌研究仍未見報道，從而限制了雙蕊蘭保育工作的順利進(jìn)行。因此，對雙蕊蘭菌根深入研究，有助于研究共生長發(fā)育模式，為人工撫育雙蕊蘭提供理論依據(jù)，同時，也為進(jìn)一步探索蘭科植物的適應(yīng)機(jī)制提供參考[8-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

供試的雙蕊蘭來自遼寧省撫順市新賓縣（E124°41′～125°05′，N41°11′～41°21′）。取其根段 2 cm，75%乙醇浸1 min，0.1%升汞表面消毒10 min，切成小段，直接放在PDA培養(yǎng)基上室溫下培養(yǎng)。分離純化后，挑取菌根真菌菌絲，ZESS顯微成像系統(tǒng)拍照。同時將其作為本試驗(yàn)的菌種。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，去離子水1 000 mL，沸水煮熟后過濾得馬鈴薯汁，加入碳源20 g、氮源5 g、瓊脂15 g。

1.2.2 試驗(yàn)條件 確定以溫度、碳源、氮源、pH為主要影響因素，采用4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，共設(shè)置9種處理。根據(jù)前期單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，溫度分別設(shè)置為15、20、25 ℃；碳源為葡萄糖、蔗糖、半乳糖；氮源為氯化銨、硝酸銨、甘氨酸；pH分別設(shè)置為5、6、7（表1、表2）。每個處理3個重復(fù)，于接種后每天用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量菌落直徑，并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel和SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)分析菌株生長速率并比較各條件差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙蕊蘭菌根菌形態(tài)特征

雙蕊蘭菌根菌接種后，菌落呈均勻輻射狀向外生長，菌落先呈白色，第5天時菌落邊緣逐漸變?yōu)闇\黃色；生長面有稀松或較豐富的氣生菌絲，帶有透明液滴（圖1A）。菌絲寬約2～4 μm，有隔；分支略呈直角，分支處縊縮，距菌絲分枝點(diǎn)較近處形成隔膜，隔膜具桶孔（圖1C）。分生孢子長橢圓形，長8～12 μm，寬3～5 μm（圖1D）。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3、表4可知，溫度間的F=807.641，P=0.000<0.01，差異極顯著；碳源間的F=72.311，P=0.000<0.01，差異極顯著；氮源間的F=26.542，P=0.000<0.01，差異極顯著；pH間的F=16.597，P=0.001<0.01，差異極顯著。

F檢驗(yàn)的結(jié)果表明，不同的碳源、氮源、pH和溫度都對菌落生長速率有極顯著的影響，故應(yīng)分別考察不同碳源、不同氮源、不同pH和不同溫度的多重比較結(jié)果，以選出最優(yōu)組合。

由表5可知，在95%置信區(qū)間內(nèi)，均值越大，對生長速率影響越大。所以通過比較“均值”列，可以發(fā)現(xiàn)半乳糖>葡萄糖>蔗糖，碳源最佳水平為半乳糖；硝酸銨>甘氨酸>氯化銨，氮源最佳水平為硝酸銨；pH 6>pH 5>pH 7，pH最佳水平為6；25 ℃>20 ℃>15 ℃，溫度最佳水平為25 ℃。

2.3 菌落生長情況

通過觀察9種處理的菌落生長狀況（圖2）發(fā)現(xiàn)，前5 d 9種處理菌落直徑都以較快的速度穩(wěn)定增加，類似線性遞增。第5天至第11天，處理2、處理3、處理4和處理8的生長速率較快；處理1、處理5、處理6和處理9的生長速率較慢；處理7的生長速率則趨于穩(wěn)定。第11天至第15天，處理2、處理3、處理4和處理8的生長速度于第11天左右達(dá)到最高峰之后便趨于穩(wěn)定；處理1、處理5、處理6和處理9的生長速度繼續(xù)增加，未達(dá)到峰值；處理7仍以3.5 mm/d的速率增長。

對第1、3、5、7、9、11、13、15天的9種處理的菌落直徑作生長曲線（圖3），可以得出9種處理的三項(xiàng)擬合的生長曲線公式，如下：

處理1：y=0.003x3-0.146x2+6.218 4x-4.422，R2=0.997 7；

處理2：y=-0.050 7x3+0.922 2x2+2.932 8x+9.484 1，R2=0.995 1；

處理3：y=-0.025 7x3+0.097 7x2+9.715 8x+7.129 6，R2=0.988 9；

處理4：y=-0.028 2x3+0.201 6x2+8.401 9x+12.103，R2=0.986 0；

處理5：y=-0.005 5x3+0.191 9x2+2.82x+4.240 4，R2=0.999 1；

處理6：y=-0.023x3+0.549 6x2+1.174 1x+12.151， R2=0.997 5；

處理7：y=0.031 5x3-1.003 7x2+11.55x+4.890 5，R2=0.997 5；

處理8：y=0.000 3x3-0.586 9x2+14.269x+5.588 5，R2=0.992 7；

處理9：y=-0.031 1x3+0.721 4x2+1.250 1x+7.806 8，R2=0.999 4。

綜上所述，生長曲線呈拋物線狀，生長公式的R2越大，曲線斜率越?。簧L曲線先進(jìn)行線性增長，達(dá)到頂峰再趨于恒定值，最后再逐步減小。生長公式符合真菌生長的規(guī)律。

3 小結(jié)與討論

不同的蘭科植物的菌根菌生長條件有著顯著差異，在自然環(huán)境下，菌根菌的生長受環(huán)境因素影響較大。

1）溫度：大部分蘭科植物的菌根菌在25 ℃下生長速度較快[11]，而本試驗(yàn)雙蕊蘭菌根菌的最適生長溫度恰好為25 ℃。有研究表明，華石斛的菌根菌最適生長溫度也為25 ℃，生長溫度范圍為5～40 ℃之間[12]；美花石斛的最適溫度為25 ℃或28 ℃[13]；但也有例外，美花蘭的菌根菌在25 ℃恒溫培養(yǎng)下生長緩慢，30 ℃是其最適的生長溫度[14]。這說明生活型不同，菌根菌的生長最適溫度范圍不同。

2）碳源：每種菌根菌對不同的碳源利用率不同，本試驗(yàn)中的雙蕊蘭的菌根菌對半乳糖利用率最高。有試驗(yàn)曾驗(yàn)證霍山石斛的菌根菌最適碳源為蔗糖[15]；而華石斛的菌根菌可利用的碳源范圍較廣，可利用單糖、雙糖、多聚碳水化合物的多種碳源，對麥芽糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素、蔗糖利用效果較好[12]。由此看來，與腐生的雙蕊蘭共生的菌根菌更適合利用單糖。

3）pH：菌根菌適合在酸性土壤中生長（pH 4.0～6.0），本試驗(yàn)驗(yàn)證了這種說法。但是也有少數(shù)菌根真菌在弱堿性條件下生長，例如美花蘭的菌根菌在pH 8.0時能夠快速生長[14]；美花石斛的優(yōu)勢菌根真菌均對堿性環(huán)境條件適應(yīng)性較強(qiáng)[13]。這表明與蘭科植物共生的菌根菌對酸堿度的耐受性和蘭科植物棲息的環(huán)境有直接關(guān)系。

4）氮源：不同菌根菌對相同氮源的吸收和利用率存在較大差異，同一菌根菌對不同氮源的吸收效果也不同。如華石斛的菌根菌對酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、硝酸鈉利用效果較好，對氨態(tài)氮利用效果較差[12]。徐超等[16]研究表明，在對蘭科植物鐵皮石斛進(jìn)行純培養(yǎng)氮源的篩選過程中，無機(jī)氮源（硝酸銨）為適用于鐵皮石斛菌根真菌生長的氮源，與本研究的結(jié)果基本一致。

利用SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件，分析試驗(yàn)所選各因素對生長速率的影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)誤差較小，說明依據(jù)該培養(yǎng)條件所建立的雙蕊蘭菌根菌的培養(yǎng)體系穩(wěn)定，有利于菌絲生長。綜上所述，雙蕊蘭菌根真菌最優(yōu)培養(yǎng)體系為：碳源為2%半乳糖，氮源為0.5%硝酸銨，pH為6，溫度為25 ℃。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳心啟.中國蘭科的一個原始新屬[J].植物分類學(xué)報，1965，10（3）：193-206.

[2] 汪 松，解 焱.中國物種紅色名錄（第1卷）：紅色名錄[M].北京：高等教育出版社，2004.

[3] 國際自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄[OL].http：//www.iucnredlist.org/，2015.

[4] 陳心啟.雙蕊蘭屬——一個極其原始和在系統(tǒng)發(fā)育上有重要意義的蘭科新屬[J].植物分類學(xué)報，1979，17（1）：1-6.

[5] RODRIGUES A S L，PILGRIM J D，LAMOREUX J F，et al. The value of the IUCN Red List for conservation[J].Trends in Ecology & Evolution，2006，21（2）：71-76.

[7] 張麗杰，沈海龍，崔健國，等.珍稀瀕危植物——雙蕊蘭[J].遼寧林業(yè)科技，2008（6）：28，51.

[8] 張麗杰，周 強(qiáng)，鞠文鵬，等.珍稀瀕危植物雙蕊蘭的生境調(diào)查[J].北方園藝，2010（16）：111-112.

[9] 張麗杰，王強(qiáng)恩，周 強(qiáng)，等.瀕危植物雙蕊蘭生長土壤微生物的探討[J].北方園藝，2010（21）：100-101.

[10] 祝業(yè)平，李紹泉，柳永清，等.孑遺植物雙蕊蘭種群分布區(qū)域調(diào)查初報[J].遼寧林業(yè)科技，2004（1）：23-24.

[11] 郭順星，曹文琴，高微微.鐵皮石斛及金釵石斛菌根真菌的分離及其生物活性測定[J].中國中藥雜志，2000，25（6）：338-341.

[12] 周玉杰.海南特有種華石斛共生真菌篩選及生物學(xué)特性研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2010.

[13] 李瑛婕.美花石斛優(yōu)勢內(nèi)生菌根真菌生物學(xué)特性及其分子鑒定[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2010.

[14] 仲 凱.美花蘭（Cymbidium insigne）菌根化培養(yǎng)研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

[15] 王 娣.霍山石斛內(nèi)生真菌的分離及其促生作用的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[16] 徐 超，席剛俊，范克勝，等.不同氮源對鐵皮石斛菌根真菌生長的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：236-238.