三種方法對肉松中膽固醇含量的測定及比較

朱炳祺++劉柱++陳萬勤

摘要：采用直接皂化方法對樣品進行前處理，用乙醚和石油醚混合液（1∶1）萃取，用氣相色譜、液相色譜和比色法分別進行檢測。氣相、液相色譜法在25～500 mg/L范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系（R2>0.999），比色法在0～42 mg/L范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系（R2>0.997）。液相、氣相色譜和比色法3個加標濃度平均回收率分別為105.5%、100.1%和102.3%，檢出限分別為0.1、0.4和2.1 mg/100 g，對肉松中膽固醇含量測得值分別為52.2、51.2和102 mg/100 g。3種方法均很好地滿足方法學(xué)要求，其中比色法體現(xiàn)總固醇類化合物的含量；氣相色譜法和液相色譜法專屬性更強、靈敏度更高，能更準確地反應(yīng)樣品中膽固醇含量。

關(guān)鍵詞：膽固醇；肉松；氣相色譜法；液相色譜法；比色法

中圖分類號：O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0942-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.038

Determination of Cholesterol Contents in Dried Meat Floss

and Comparison of 3 Different Methods

ZHU Bing-qi， LIU Zhu， CHEN Wan-qin， LUO Jin-wen

（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310000， China）

膽固醇在人體內(nèi)起著廣泛的生理作用，是動物細胞中不可缺少的重要物質(zhì)，其不僅僅是細胞膜的組成物質(zhì)，也是膽汁酸、維生素D和甾體激素的原料[1]。膽固醇主要來源為兩個，其中80%是人體自身合成，其次20%是從食物中獲取。世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）將300 mg設(shè)置為成年人每日最大建議攝入量[2]。盡管并沒有充足的數(shù)據(jù)來揭示從食物中過量攝入膽固醇與動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病之間的直接關(guān)系[3]，但大量研究表明兩者之間存在相關(guān)性[4，5]，高水平的低密度膽固醇提高了心血管疾病的風(fēng)險[6]，因此在相關(guān)領(lǐng)域這一直是一個重要的課題[1]。

在針對膽固醇的化學(xué)檢測分析手段中，主要使用了比色法、熒光發(fā)光法、液相色譜法和氣相色譜法等[1，2]。其中氣相色譜法和液相色譜法能夠?qū)⒛懝檀挤蛛x并進行定量分析，因此較為常用[7]。通常固醇類物質(zhì)在190～210 nm處有吸收，因此在液相方法中常使用紫外檢測器；氣相色譜柱分離性好、靈敏度高，通常配備FID或質(zhì)譜檢測器[2，5]。比色法利用固醇類與酸作用時脫水聚合產(chǎn)生顏色物質(zhì)以進行定量分析[8]。在國家標準中，規(guī)定了高效液相色譜法GB/T 22220-2008，肉與肉制品中膽固醇含量測定GB/T 9695.24-2008和食品中膽固醇的測定GB/T 5009.128-2003為法定方法對膽固醇進行檢測，但鮮有報道將上述3種方法同時進行比較。

本試驗通過直接皂化法處理樣品，利用比色法、高效液相色譜法和氣相色譜法3種方法分別測定肉松中膽固醇的含量，進行方法學(xué)驗證，比較3種方法的優(yōu)缺點，為實驗室開展膽固醇的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉松；魷魚；膽固醇（純度≥95%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；甲醇、無水乙醇（色譜純，德國Merck公司）；石油醚（沸程30～60 ℃）；無水乙醚；無水硫酸鈉；氫氧化鉀。以上試劑如無特別說明均為分析純，試驗用水為Millipore超純水。

1.2 儀器設(shè)備

天平（Mettler XPE205，美國Mettler Toledo公司）；氣相色譜儀（7890B，F(xiàn)ID檢測器，美國Agilent公司）；液相色譜儀（1260，DAD檢測器，美國Agilent公司）；紫外可見分光光度儀（Lambda 35，美國Perkin Elmer公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10，德國IKA公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 膽固醇樣品皂化：將樣品粉碎混勻，精密稱取固體樣品于具塞錐形瓶中，加入30 mL無水乙醇，超聲5 min，加入60% 氫氧化鉀溶液10 mL，置于80 ℃ 恒溫水浴中皂化20 min，取出超聲5 min，繼續(xù)放回80 ℃水浴中皂化20 min，取出搖勻、冷卻至室溫。

膽固醇提?。簩⒃砘喝哭D(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，用30 mL水分2～3次沖洗具塞錐形瓶，沖洗液并入分液漏斗，再用50 mL石油醚和乙醚混合液（1∶1）分2～3次沖洗錐形瓶并入分液漏斗中，振搖提取2 min，靜置，分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個分液漏斗中，再用40 mL上述石油醚和乙醚混合液重復(fù)提取一次，棄去水相，合并有機相。用蒸餾水洗滌提取液至中性。棄去水相，無水硫酸鈉去水。

提取液濃縮：液相色譜法和氣相色譜法中將提取液轉(zhuǎn)移至250 mL平底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干。無水乙醇溶解定容至5 mL，取過濾液于進樣小瓶中，待測。比色法中將提取液轉(zhuǎn)移至容量瓶，用石油醚和乙醚混合液（1∶1）定容至100 mL。

1.3.2 液相色譜法 色譜柱，Waters SunFire（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；檢測器，二極管陣列檢測器；檢測波長205 nm；流動相為100%甲醇；流速1.0 mL/min；柱溫38 ℃；進樣量10 μL。

1.3.3 氣相色譜法 色譜柱，DB-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣，高純氮；恒流2 mL/min；柱溫（程序升溫）：初始溫度為200 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；進樣口溫度280 ℃；檢測器溫度310 ℃；進樣量1 μL；進樣方式為分流進樣，分流比10∶1；空氣流速400 mL/min；氫氣流速30 mL/min。

1.3.4 比色法 移取定容后的提取液5 mL，置于10 mL具塞試管中，在65 ℃水浴中氮氣吹干，加入4 mL冰乙酸，2 mL鐵礬顯色液，混勻，在15～90 min內(nèi)，在563 nm波長下比色，測吸光度，根據(jù)標準曲線計算相應(yīng)膽固醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

膽固醇通常以結(jié)合的形態(tài)存在于樣品中，通過皂化，將其水解成游離態(tài)的膽固醇以供分析。該過程涉及皂化堿液濃度、皂化時間、皂化溫度等因素。

皂化過程中，充足的氫氧化鉀保證反應(yīng)能夠完全進行[9，10]。反應(yīng)時間是膽固醇充分水解的必要條件，試驗考察了反應(yīng)40、60和90 min，均取得了一致的膽固醇含量，故表明反應(yīng)40 min即可。合適的溫度為反應(yīng)的進行提供能量，相關(guān)研究表明在60 ℃時反應(yīng)不完全，但過高的溫度也會帶來副反應(yīng)，因此80～90 ℃較為理想[9，10]。試驗加入10 mL 60%氫氧化鉀水溶液，采用了40 min的反應(yīng)時間和85 ℃的皂化溫度。為了樣品均勻反應(yīng)，對其進行超聲處理，并在皂化過程中振搖。

萃取溶劑的選擇中，正己烷的回收率較低，乙醚和石油醚均有90%以上的回收率[9]。依據(jù)GB/T 22220-2008，本試驗中采用乙醚∶石油醚（1∶1）為萃取溶劑。

2.2 方法學(xué)驗證

本次試驗對肉松樣品分別進行了液相法、氣相法和比色法3種考察方法。在液相色譜法和氣相色譜法中，將膽固醇標準品用無水乙醇溶解配制稀釋成25～500 mg/L的標準溶液，待色譜儀分析，制作標準曲線。在比色法中，將標準儲備液定量稀釋至0.1 mg/mL的中間液，分別定量移取中間液置于10 mL試管內(nèi)，加入冰乙酸使總體積為4 mL，加入2 mL鐵礬顯色液，混勻，在15～90 min內(nèi)，在563 nm波長下比色，以膽固醇標準濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標做標準曲線。精密稱取樣品，經(jīng)樣品處理后，進行含量測定、加標考察、精密度試驗和檢出限試驗。

圖1和圖2分別為膽固醇測定的氣相色譜和液相色譜，根據(jù)“1.3.2”和“1.3.3”中的儀器參數(shù)設(shè)置進行分析，膽固醇得到較好地分離，在氣相色譜和液相色譜中保留時間分別為9.292和12.635 min。

由表1可以看出，3種方法均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。3種方法均進行了25、50和100 mg/100 g 3個加標濃度的回收考察試驗，每個濃度點平行3份，扣除樣品背景后液相法、氣相法和比色法分別得到105.5%、100.1%和102.3%的回收率。精密度試驗中平行測定6份肉松樣品中膽固醇含量，得到的RSD%均小于5。由于樣品為陽性樣品，故在檢出限的測定中色譜法對樣品進行稀釋至S/N=3，比色法采用檢出限CL=3Sb/b[b方法校正曲線的斜率；Sb空白值標準偏差（平行測定20次）]計算得到，色譜法的檢出限比比色法低一個數(shù)量級。3種方法的驗證指標均符合國標要求，其中實驗室獲得的液相色譜法檢出限明顯優(yōu)于GB/T 22220-2008的規(guī)定。

2.3 3種方法對膽固醇檢測結(jié)果的分析

對本試驗所使用的肉松樣品進行檢測結(jié)果見表2。由表2可知，利用液相色譜法和氣相色譜法得到的結(jié)果平均值分別為52.2 mg/100 g和51.2 mg/100 g，而利用比色法測得的結(jié)果為102.0 mg/100 g，較色譜法結(jié)果高出近1倍。根據(jù)GB/T 5009.128-2003，比色法適用于固醇類化合物，該固醇類化合物與酸作用時，可脫水發(fā)生聚合反應(yīng)，產(chǎn)生顏色物質(zhì)。由于樣品中含有除了膽固醇以外的固醇類化合物，同樣會發(fā)生顯色反應(yīng)，干擾膽固醇的測定，因此導(dǎo)致比色法的結(jié)果較色譜法高。在此次研究中平行對魷魚樣品進行膽固醇檢測，其中氣相、液相和比色法得到的結(jié)果平均值分別為145、144、187 mg/100 g，該結(jié)果同樣反映出比色法所得的結(jié)果較氣相色譜和液相色譜法高。相關(guān)研究用比色法和HPLC法對鴨蛋蛋黃粉中的膽固醇含量進行比較，比色法所得結(jié)果也明顯高于HPLC法，同樣是由于蛋黃粉中脂類成分干擾所致[8]。

3 結(jié)論

本試驗對常用的氣相色譜法、液相色譜法和比色法在膽固醇的檢測中進行了比較和方法學(xué)考察。優(yōu)化了樣品處理中皂化溫度、時間和萃取過程。在對肉松的檢測中，氣相色譜法和液相色譜法均能將膽固醇與其他固醇類和脂類成分在分析過程中進行分離，故能取得較為準確的結(jié)果。而比色法則由于未進行分離，故檢測結(jié)果反映的是樣品中總固醇含量。

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Abstract： Saponification was applied in sample pretreatment， and cholesterol was extracted by a mixed solvent of diethyl ether and petroleum ether （1∶1，V/V），then analyzed by liquid chromatography（LC），gas chromatography（GC） and colorimetric method respectively. The results showed that good linearity were obtained in the range of 25～500 mg/L by using chromatography （R2>0.999） and in 0～42 mg/L by colorimetric method （R2>0.997）. By using LC，GC and colorimetric method，the average recovery were 105.5%，100.1% and 102.3%，the limit of detection（LOD） were 0.1 mg/100 g，0.4 mg/100 g and 2.1 mg/100 g， and the cholesterol content in dried meat floss were 52.2 mg/100 g， 51.2 mg/100 g and 102 mg/100 g respectively. All three analytical methods were validated， among which the colorimetric method revealed the total steroid content，and LC，GC were more accurate and sensitive in cholesterol analysis than colorimetric method.

Key words： cholesterol； dried meat floss； gas chromatography； liquid chromatography； colorimetric method