粒細(xì)胞集落刺激因子免疫調(diào)節(jié)胚胎植入的研究進展

溫惠慧，紀(jì)亞忠

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

粒細(xì)胞集落刺激因子免疫調(diào)節(jié)胚胎植入的研究進展

溫惠慧，紀(jì)亞忠*

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

免疫因素介入的反復(fù)種植失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是導(dǎo)致不孕不育的常見原因之一。近年來，應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-Colony Stimulating Factor，G-CSF)改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床胚胎著床率、降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)逐漸成為相關(guān)研究熱點。本文從其作用機制和臨床應(yīng)用兩個方面對G-CSF在輔助生殖醫(yī)學(xué)中的最新研究進展，進行了綜述。

粒細(xì)胞集落刺激因子； 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 反復(fù)種植失敗

(JReprodMed2017，26(7)：730-734)

一、概述

成功妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是胚胎成功著床。但目前，無論是自然妊娠還是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)，不明原因的胚胎著床失敗(RIF)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)發(fā)生率仍較高，研究表明其發(fā)病因素繁多，在排除遺傳發(fā)育、生殖系統(tǒng)畸形、高育齡等因素后仍有部分女性患者無法成功受孕。早期妊娠失敗，如RSA，林其德等[1]建議將RSA分為2類6型，即免疫類(同種免疫型和自身免疫型)和非免疫類(染色體異常型、解剖異常型、內(nèi)分泌紊亂型、感染型)。對于成功妊娠免疫因素尤為重要，生殖道特別是子宮局部的免疫細(xì)胞能否識別并耐受胚胎抗原直接影響了妊娠的建立和維持。粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)是正常妊娠生理過程中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子之一，在母體與胚胎之間的交流中有著重要的調(diào)節(jié)作用。妊娠，作為一種同種異體移植，不僅需要母體免疫系統(tǒng)不產(chǎn)生排斥作用耐受半同種移植物的胎兒，還需要早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞在該過程中發(fā)揮獨特的生物學(xué)功能：如高增殖能力，甚至類似惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[2]。研究證實，G-CSF 可刺激自然移植物的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，在G-CSF 的作用下滋養(yǎng)細(xì)胞偽足增多、變長，侵襲能力增強[3]。因此G-CSF對母-胎界面具有雙向調(diào)節(jié)作用，即對免疫細(xì)胞具有抑制作用，而對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能則具有促進作用。

目前IVF-ET中單個移植周期的妊娠率約50%，累計妊娠率已達(dá)80%左右，但仍有近10%的女性患者經(jīng)過多個周期種植后仍未受孕，通常稱之為反復(fù)種植失敗[4]。導(dǎo)致種植失敗的原因除了胚胎本身質(zhì)量外，子宮內(nèi)膜容受性也起著關(guān)鍵作用。即使是高質(zhì)量的胚胎，其胚胎植入率也僅有20%～30%左右[5]。研究已證明，G-CSF通過影響基因的表達(dá)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)控及細(xì)胞粘附系統(tǒng)，使其發(fā)生一系列改變，最終形成能夠接受胚胎著床的一種綜合狀態(tài)，包括子宮內(nèi)膜厚度、腔上皮、腺上皮、間質(zhì)的發(fā)育狀態(tài)及子宮內(nèi)膜的血流灌注情況[6]。

二、G-CSF簡介

1.G-CSF的來源及分布：G-CSF是常見的內(nèi)源性造血生長因子，廣泛作用于骨髓微環(huán)境，刺激血細(xì)胞再生。G-CSF可選擇性促嗜中性粒細(xì)胞祖細(xì)胞增殖分化，通過促進吞噬氧化發(fā)揮其功能。1983年從小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并提純了GSF，隨后人源G-CSF(hG-CSF)于1986年克隆成功[7]。hG-CSF是一種小分子糖蛋白，包括 5個外顯子和4個內(nèi)含子，其分子量約為19 600，長約2.25 kd。G-CSF體內(nèi)來源廣泛，最早發(fā)現(xiàn)于造血細(xì)胞中的單核巨噬細(xì)胞系[8]，后發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板等非造血細(xì)胞及惡性腫瘤中也存在G-CSF及其受體的表達(dá)[9-10]。正常情況下，人體血清中G-CSF的含量很低，應(yīng)激情況下可顯著增高[11]。

2.粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)的來源及分布：hG-CSF的生物活性通過細(xì)胞表面的特異性G-CSFR來調(diào)節(jié)。G-CSFR為高親和力受體，主要存在于骨髓中，也表達(dá)在中性粒細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和髓系白血病細(xì)胞系如HL-60細(xì)胞等[12-13]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)5種不同類型的G-CSFR的異構(gòu)體，由不同的RNA剪接方式產(chǎn)生，但各種變構(gòu)體的生物學(xué)作用及其表達(dá)的調(diào)控目前仍不十分明確。G-CSF與血細(xì)胞表面G-CSFR結(jié)合發(fā)揮作用，刺激粒系母細(xì)胞增殖和分化，在增加成熟粒細(xì)胞功能的同時刺激骨髓造血干細(xì)胞增殖分化，并刺激骨髓細(xì)胞釋放進入外周血。除了促進粒系母細(xì)胞生長增殖作用外，G-CSF也可促進損傷內(nèi)膜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬、運動、殺菌活性及表面分子的表達(dá)[14]。

三、G-CSF對胚胎種植與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)作用

1.滋養(yǎng)層細(xì)胞系細(xì)胞因子的表達(dá)與胚胎植入：胚胎來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞向母體子宮內(nèi)膜的遷移、浸潤是正常胚胎植入以及胎盤形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于G-CSFR主要存在于胎盤組織和滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此推測G-CSF可能具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞和早期妊娠的作用[15]。有研究表明G-CSF通過激活PI3K/Akt和Erk1/2信號通路來提高人滋養(yǎng)層細(xì)胞系基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的活性以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌[16]。此外G-CSF還可通過以下機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞系的遷移、侵襲，參與胚胎的植入：(1)G-CSF通過提高細(xì)胞運動性參與滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移，將滋養(yǎng)層細(xì)胞置于含有G-CSF的培養(yǎng)基中孵化9 h，滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)前端伸出偽足、細(xì)胞體收縮、細(xì)胞尾端和周圍基質(zhì)黏著解離等遷移表型轉(zhuǎn)變現(xiàn)象[3]；(2)細(xì)胞入侵過程中，整合素聯(lián)系著胞外基質(zhì)與肌動蛋白的α/β異二聚體膜受體，對細(xì)胞骨架重塑起著支配作用[17]。隨著胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞向母體子宮蛻膜層和肌層血管入侵時，細(xì)胞呈現(xiàn)α6β4整合素表達(dá)的下調(diào)，同時α5β1、αvβ1、αvβ3及α1β1整合素表達(dá)上調(diào)[18-19]。基于此，實驗發(fā)現(xiàn)在含有G-CSF的培養(yǎng)基中，G-CSF可大大促進滋養(yǎng)層細(xì)胞β1亞基的表達(dá)，激活P38，Erk1/2和PI3K信號通路對β1整合素的表達(dá)進行調(diào)控[3]；(3) 促分裂素原活化蛋白激酶鏈(MAKP)是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移及侵襲的生物學(xué)作用。MAPK主要有四個亞族：Erk、JNK、p38、Erk5。G-CSF通過PI3K介導(dǎo)的磷酸化作用活化滋養(yǎng)層細(xì)胞Erk1/2MAPK信號通路，調(diào)節(jié)MMP-2的活性和VEGF分泌[16]，同時也作用于p38信號通路[3]，從而促進滋養(yǎng)層細(xì)胞系的遷移、侵襲。以上實驗表明G-CSF可作為母胎界面表達(dá)的因子之一促進胚胎植入和胎盤形成。

2.母體內(nèi)膜淋巴細(xì)胞因子與胚胎植入：母體免疫系統(tǒng)功能受一系列細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，在胚胎種植過程中及妊娠早期，來自母體內(nèi)膜淋巴細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的多種因子參與了母體對胚胎免疫耐受的調(diào)節(jié)。子宮內(nèi)膜中的 T 細(xì)胞主要分布于功能層，包含豐富的 T 細(xì)胞亞群。CD4+T 細(xì)胞激活后按分泌細(xì)胞因子譜分為 Th1 型和 Th2 型兩個功能亞群。Th1 型細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，主要分泌 白介素-2(IL-2)、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)等細(xì)胞因子。Th2 型細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，主要分泌 IL-4、IL-6、IL-10 等因子。大量研究表明Th1 型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不利于妊娠，而Th2 型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以改善這種狀態(tài)，正常妊娠是一種Th2 偏移現(xiàn)象[20]。體內(nèi)外實驗證實，G-CSF 可以誘導(dǎo) CD4+和 CD8+T 細(xì)胞表達(dá) G-CSFR，且呈時間依賴性；G-CSF 重復(fù)刺激能維持 G-CSFR在 CD4+T 細(xì)胞上的表達(dá)[21]，這可能是 G-CSF 對 T 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的重要機制之一。G-CSF 抑制 T 細(xì)胞的異種反應(yīng)性，使 T 細(xì)胞處于免疫低反應(yīng)狀態(tài)。G-CSF 可以誘導(dǎo) T細(xì)胞的應(yīng)答不足并促進T細(xì)胞由Th1 型向 Th2 型分化[22]。高明霞[23]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜G-CSF可以激發(fā)G-CSFR的表達(dá)，IL-1、VEGFE、整合素β、白血病抑制因子、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)，降低IL-2的表達(dá)，從而促進內(nèi)膜修復(fù)，改善子宮內(nèi)膜容受性。

3.子宮內(nèi)膜相關(guān)基因的表達(dá)與胚胎植入：將體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞暴露于G-CSF環(huán)境中，探究與胚胎植入過程有關(guān)的子宮內(nèi)膜相關(guān)基因表達(dá)的差異。結(jié)果提示G-CSF可通過影響以下基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)控及細(xì)胞粘附系統(tǒng)：(1)TYMP，作為血小板衍化內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)，其作用主要是通過調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)促進血管形成及細(xì)胞遷移[24]。研究表明，在RIF和RSA患者的子宮內(nèi)膜中，TYMPmRNA表達(dá)下調(diào)[25]；(2)磷酸化整合素B3 (ITGB3)是人和動物體內(nèi)重要的子宮內(nèi)膜黏附分子[26]，在大劑量的G-CSF培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜組織，發(fā)現(xiàn)有大量ITGB3的表達(dá)，高度提示了該因子在細(xì)胞遷移及胚胎種植過程中的作用[27]，但RIF/RSA與對照組間無統(tǒng)計學(xué)意義[25]；(3)尿激酶型纖溶酶原激活物受體(PLAUR)，是細(xì)胞遷移、增殖分化、重塑組織的重要因子[28]，在不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)存在動態(tài)差異，一般表達(dá)于早期胎盤組織，特別是子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞表面[29]。尿激酶纖維蛋白溶酶激活劑(uPA)表達(dá)高低與葡萄胎、先兆子癇等滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)妊娠疾病有關(guān)。其信號通路需要整合素，包括ITGB3的參與[28]。在RSA患者中發(fā)現(xiàn)，ITGB3/PLAURmRNA表達(dá)比值顯著下降。而將子宮內(nèi)膜暴露于含有大劑量G-CSF培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，子宮內(nèi)膜PLAUR mRNA表達(dá)顯著提高，而在對照組中未發(fā)生明顯變化[25]。故該實驗表明可考慮將相關(guān)子宮內(nèi)膜因子表達(dá)缺陷列入應(yīng)用G-CSF適應(yīng)癥范疇。

四、G-CSF在生殖領(lǐng)域治療現(xiàn)狀

G-CSF在研究中主要用于治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、IVF-ET反復(fù)著床失敗。

1.G-CSF應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)：2009年Scarpellini 和 Sbracia[30]首次提出對患有RSA的夫婦使用基因重組的集落生長因子(rG-CSF)。該研究對前期靜脈注射免疫球蛋白治療失敗的68名不明原因RSA的婦女進行隨機對照試驗。治療組35位婦女經(jīng)皮注射Filgrastim (Neupogen，Dompe，Italy)，治療劑量 1 μg (100 000 IU)/kg/d。對照組33位婦女經(jīng)皮注射生理鹽水，治療時間同治療組。研究中所有婦女在三個月內(nèi)均自然受孕。治療組及對照組活產(chǎn)率分別為(82.8%：48.5%，P<0.01)。治療組在孕期有相對較高水平的HCG。治療組一例皮疹、兩例白細(xì)胞增多(白細(xì)胞計數(shù)>25×109/L)，對照組一例妊娠高血壓。兩組在流產(chǎn)孕周和新生兒出生體重方面無差異且沒有先天畸形病例報道。在23位流產(chǎn)患者中，對14位患者的妊娠組織進行基因檢測，治療組一例、對照組兩例發(fā)現(xiàn)基因異常。

2013年，Santjohanser 等[31]對IVF且有RSA史的患者(至少有兩次早期流產(chǎn))進行G-CSF的有效性評估，127位患者共199個周期納入研究。患者被隨機分為三組：G-CSF治療組，其他藥物治療組及對照組。所有研究對象均口服葉酸和陰道塞黃體酮栓劑(600 mg/d，黃體期開始至孕后12周)。結(jié)果顯示采用G-CSF治療組有較好的妊娠結(jié)局，妊娠率和活產(chǎn)率分別為47%、32%。與G-CSF治療組相比，采用其他藥物治療組妊娠率和活產(chǎn)率分別為27%、14%，不采用藥物治療組妊娠率和活產(chǎn)率分別為24%、13%[31]]。兩個實驗采用不同的方案來評估G-CSF對RSA患者臨床結(jié)局的有效性，均顯示可降低流產(chǎn)率[30-31]。也有數(shù)據(jù)顯示G-CSF參與了卵泡發(fā)育，可能是IVF結(jié)局的預(yù)測因子[32]。然而，使用G-CSF對何種癥狀是否真正有益依然有待探討。

2.G-CSF應(yīng)用于 IVF-ET反復(fù)著床失?。?011年Gleicher 等[33]首次報道應(yīng)用rG-CSF治療薄型子宮內(nèi)膜，對4名不孕婦女(年齡在33～45歲)在胚胎移植當(dāng)日通過宮腔內(nèi)導(dǎo)管給藥rG-CSF [30 MU (300 μg/1 ml)]。結(jié)果提示，用藥后患者子宮內(nèi)膜厚度顯著增加且4例患者全部妊娠，除外一名異位妊娠。因此，胚胎移植當(dāng)日，對于薄型子宮內(nèi)膜患者，使用G-CSF 改善了患者妊娠率。

隨后，2013年Gleicher 等[34]對21名IVF治療失敗(平均2.0±2.1 (0～9) 個周期)的患者(年齡為 40.5±6.5 歲)進行了超過18個月的前瞻性觀察隊列研究，部分患者診斷為卵巢儲備功能下降 [16/21 (76.2%)]。這些患者HCG日的子宮內(nèi)膜厚度均不超過7 mm。在HCG日的前6～12 h通過宮腔內(nèi)導(dǎo)管注入G-CSF，若內(nèi)膜在給藥后的48 h內(nèi)未增至7 mm，則在取卵后再次給藥。其中3名患者需要再次給藥。經(jīng)陰道超聲測量子宮內(nèi)膜厚度。結(jié)果顯示，從宮腔內(nèi)灌注G-CSF到胚胎移植的過程中，內(nèi)膜厚度自(6.4±1.4)mm增至(9.3±2.1)mm(P<0.01)并獲得19.0%的臨床妊娠率。結(jié)果表明，對于薄型子宮內(nèi)膜患者，HCG日使用G-CSF 改善了患者妊娠率。雖然G-CSF對改善子宮內(nèi)膜厚度有正向作用，但由于這項研究的局限性，例如小樣本、無隨機對照組以及入組病例未經(jīng)嚴(yán)格篩選第一次行IVF治療的不孕婦女，因此仍無法科學(xué)評價G-CSF對改善IVF臨床妊娠率的有效性。

最近，Aleyasin等[35]對112名IVF反復(fù)著床失敗的不孕患者進行多中心、隨機對照實驗，對G-CSF改善IVF臨床結(jié)局的有效性進行評估。研究對象均采用長方案，在胚胎植入1 h前，治療組56名患者皮下注射 300 μg G-CSF，對照組不采取任何治療。黃體支持均采用天然黃體酮陰道栓劑 (2 次/d)以及80 mg阿司匹林。結(jié)果顯示，治療組及對照組移植率 (18% vs.7.2%，P=0.007)、生化妊娠率 (44.6% vs.19.6%，P=0.005)及臨床妊娠率 (37.5% vs.14.3%，P=0.005)，治療組明顯高于對照組。該實驗首次評估了全身性使用G-CSF對 IVF反復(fù)失敗患者的有效性，與宮腔灌注相比，操作簡單、易接受且成本更低。但因未建立對照組，尚需要更多的隨機對照試驗進行證實，并進一步探索其最佳臨床應(yīng)用途徑與劑量。

五、總結(jié)

G-CSF作為預(yù)防RSA和RIF的新型免疫治療方法之一，雖然其中的某些治療方法可以有效提高臨床妊娠率，但是仍需高質(zhì)量的大樣本隨機雙盲對照研究證明其有效性，進而明確真正受益的群體、最佳的給藥劑量、給藥時間、最佳給藥途徑(皮下還是宮腔灌注)，也亟待制定規(guī)范的治療方案、嚴(yán)格的適應(yīng)證及相關(guān)禁忌癥。

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[編輯：谷炤]

Research progress in effect of granulocyte colony-stimulating factor on immune regulation in embryo implantation

WENHui-hui，JIYa-zhong*

DepartmentofAssistedReproduction，theaffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200065

It is a common cause of infertility that immune factors involve repeated implantation failure and recurrent abortion.In recent years，it is become a research hotspot that granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is applied for improving clinical embryo implantation rate，reducing recurrent miscarriage and improving endometrial receptivity.This paper reviews the latest research progress of application of G-CSF in assisted reproductive technology from two aspects of mechanism and clinical application.

G-CSF； Recurrent spontaneous abortion； Repeated implantation failure

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.022

2016-11-23；

2017-02-23

溫惠慧，女，江西贛州人，碩士研究生，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

，Email：jiyazhong@hotmail.com)