牽拉損傷對大鼠坐骨神經(jīng)影響的實驗研究

童昌軍，魏優(yōu)秀，黃 康

·論 著·

牽拉損傷對大鼠坐骨神經(jīng)影響的實驗研究

童昌軍，魏優(yōu)秀，黃 康

目的 探討大鼠坐骨神經(jīng)牽拉傷后MRI變化以及損傷過程中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的表達和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白(COL-Ⅰ、Ⅲ)含量的變化。方法 將50只成年雄性SD大鼠隨機分為對照組(僅暴露坐骨神經(jīng))和牽拉組(大鼠右側(cè)后腿坐骨神經(jīng)牽拉傷)，分別于術(shù)后3d，2、4、6、8周，隨機取兩組大鼠各5只，切取牽拉段神經(jīng)行MRI、組織形態(tài)學、免疫組織化學的觀察及反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、Western Blot定量測定TGF-β1的表達和COL-Ⅰ、Ⅲ含量。結(jié)果 牽拉損傷后MRI表現(xiàn)為神經(jīng)增粗，T1、T2時間延長；牽拉組大鼠坐骨神經(jīng)TGF-β1的表達和COL-Ⅰ、Ⅲ含量明顯高于對照組，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論 坐骨神經(jīng)牽拉損傷后，周圍神經(jīng)發(fā)生纖維化病變，COL-Ⅰ、Ⅲ含量顯著增加，TGF-β1表達有顯著差異，提示TGF-β1在周圍神經(jīng)纖維化過程中具有一定的作用。

牽拉損傷； 坐骨神經(jīng)； MRI； 轉(zhuǎn)化生長因子； 膠原蛋白

周圍神經(jīng)損傷是臨床常見損傷，以擠壓、牽拉、撕裂性損傷多見，具有致殘后遺癥，不僅給患者身心造成重大傷害，也給患者的家庭和社會帶來沉重負擔，是目前亟待解決的一個難題。國內(nèi)外學者對周圍神經(jīng)擠壓傷后病理報道較多，但是對常見類型牽拉損傷的病理變化報道較少。本研究采用大鼠坐骨神經(jīng)牽拉損傷模型，模擬人體周圍神經(jīng)慢性牽拉損傷病理過程，動態(tài)監(jiān)測坐骨神經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達的變化及 Ⅰ 、 Ⅲ 型膠原蛋白(COL-Ⅰ、Ⅲ)含量的變化，并對其相關(guān)性進行分析，探討TGF-β1在周圍神經(jīng)慢性牽拉損傷過程中所起的作用，從而為慢性牽拉損傷致神經(jīng)纖維化探索一條可行的治療途徑。

材料與方法

1 實驗動物及分組

清潔級健康成年雄性SD大鼠50只(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重(200±15)g。隨機分成2組：A組(對照組)25只，B組(坐骨神經(jīng)慢性牽拉損傷組)25只，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食。

2 動物模型的建立及取材

大鼠以戊巴比妥鈉(40mg/kg)作腹腔注射麻醉，無菌條件下，左下肢背側(cè)部縱向切口，鈍性分離，游離坐骨神經(jīng)。A組大鼠只暴露坐骨神經(jīng)，B組大鼠暴露坐骨神經(jīng)，用兩把無齒輸精管分離鉗分別鉗夾住坐骨神經(jīng)主干，兩把鉗相距0.4cm，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，為盡量減少分離鉗夾對神經(jīng)的損傷作用，分離鉗僅扣住一齒，均勻地用力向兩側(cè)分離兩把分離鉗，使兩把分離鉗夾持的神經(jīng)牽拉到0.8cm，持續(xù)牽拉30s，此時可見神經(jīng)被牽拉變細長，松開鉗子，關(guān)閉傷口，常規(guī)方式飼養(yǎng)。

分別于術(shù)后3d，2、4、6、8周，隨機選取A、B組大鼠各5只，麻醉下處死，備檢。

3 MRI成像方法

使用Philips intera 1.5T超導型MRI掃描儀，采用直徑11cm的環(huán)形表面線圈。大鼠麻醉成功后，取側(cè)臥位，將待檢查側(cè)大鼠大腿緊貼表面線圈。分別對對照組、術(shù)后3d的大鼠進行坐骨神經(jīng)MRI檢查。檢查序列包括：采用快速自旋回波TSE序列進行坐骨神經(jīng)的T1W1、3D T2W1掃描，質(zhì)子頻譜預(yù)飽和反轉(zhuǎn)恢復成像(3D T2W1/SPIR);使用Mixed多回波序列(多回波SE與多回波IR交叉序列)進行坐骨神經(jīng)的T1時間測量，SE多回波序列進行T2時間測量。掃描層面方向為斜矢狀位，與坐骨神經(jīng)走行一致。具體參數(shù)T1W1：TR/TE650/20ms，層厚及層距2/1.0mm，矩陣256×512；3D T2W1：TR/TE 1 600/80ms；3D T2W1/SPIR：TR/TE 1 600/80ms；層厚及層距2/1.0mm，矩陣304×512；T1測量使用Mixed多回波TR(SE)：3 500ms，Tr(IR)：4 000ms，TE:20×8ms,tI:400,矩陣256×256；層厚：2.5mm。觀察各個序列上牽拉傷后坐骨神經(jīng)牽拉段、牽拉近段及牽拉遠段形態(tài)及信號的變化。在Mixed及自旋多回波序列上，分別測量坐骨神經(jīng)牽拉段、牽拉近段及牽拉遠段牽拉前后的T1、T2值。

4 坐骨神經(jīng)免疫組化分析

取術(shù)后2、4、6、8周大鼠坐骨神經(jīng)牽拉段約1.0cm，常規(guī)石蠟切片脫蠟，水化；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌切片3～5次后滴加3%H2O2，室溫靜置10min；PBS沖洗2～3次后滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置10～15min；滴加兔抗TGF-β1或Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白抗體(Abeam公司，英國)50μL，稀釋倍數(shù)為1∶50，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(IgG),PBS洗后行3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水終止顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化脫水，透明、中性樹膠封片后鏡檢。應(yīng)用德國LEICA系統(tǒng)，在200倍視野下進行圖像分析，用陽性反應(yīng)細胞內(nèi)的平均強度表示發(fā)生免疫反應(yīng)陽性細胞內(nèi)抗原物質(zhì)量的多少。

5 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA的表達

Trizol 溶液(GIBCO公司，美國)；TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ引物應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計軟件[美國Invitrogen(上海)英駿生物技術(shù)有限公司]設(shè)計；SYBR GreenⅠ熒光染料(Biotium公司，美國)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min、94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，共50個循環(huán)。應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料技術(shù)行實時定量PCR反應(yīng)，獲取各組標本的標準曲線，計算機分析Ct值。

6 免疫印跡法(Western Blot)檢測TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白的表達

β-actin(Sanata Cruz 公司，美國)；TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ一抗，兔抗鼠(Abeam公司，英國)；二抗均為羊抗兔(Abeam公司，英國)。以β-actin作為內(nèi)參照，相對分子質(zhì)量為42 000，濃度為1∶2500。取樣本組織100mg勻漿后提取蛋白，經(jīng)上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉后，依次加入兔抗鼠多克隆抗體(1∶400)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆抗體(1∶2400)、ECL顯色劑充分顯色。用美國Quantity One 4.4.0軟件分析，得到吸光度(A)值數(shù)據(jù)并計算出TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白A值與β-actin蛋白A值的比值，間接反映TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ水平。

7 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1 坐骨神經(jīng)的MRI表現(xiàn)

坐骨神經(jīng)牽拉傷后牽拉近段、牽拉段及牽拉遠段比損傷前(對照組)的T2W1及T2W1/SPIR上神經(jīng)信號增強，T1W1信號變化不明顯，見圖1、2。T1、T2值均延長(表1)。

表1 坐骨神經(jīng)損傷前后T1、T2值比較

與損傷前比較：*P<0.05

2 坐骨神經(jīng)牽拉傷后的病理變化

牽拉段表現(xiàn)為神經(jīng)外膜充血、腫脹，大量淋巴細胞及少量紅細胞浸潤，神經(jīng)纖維彌漫性變性、斷裂(圖3)，變成均質(zhì)淡染無結(jié)構(gòu)物質(zhì)；電鏡下表現(xiàn)為大部分神經(jīng)纖維崩解呈碎片(圖4)。牽拉近段表現(xiàn)為神經(jīng)纖維明顯腫脹，神經(jīng)外膜充血，出現(xiàn)輕度的脫髓鞘改變，呈空泡狀；電鏡下表現(xiàn)為軸突變性及髓鞘崩解。牽拉遠段光鏡下表現(xiàn)為大量淋巴細胞浸潤，神經(jīng)纖維彌漫變性，神經(jīng)外膜仍充血、腫脹；牽拉遠段神經(jīng)于損傷后部分軸突出現(xiàn)腫脹；電鏡下表現(xiàn)為軸突溶解，髓鞘崩解。

3 牽拉傷后后肢功能的變化

B組坐骨神經(jīng)牽拉傷后20只大鼠牽拉側(cè)后肢均出現(xiàn)脫毛、潰瘍腫脹、趾甲缺失、趾骨外露、踝下垂、展趾反射喪失、運動功能障礙。A組后肢活動自如，展趾反射功能正常，外觀未見改變。

4 免疫組化染色觀察及圖像分析

A組大鼠神經(jīng)細胞的胞質(zhì)TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達均呈陰性：B組TGF-β1的表達隨時間而變化，術(shù)后4周時其表達量達到高峰，以后則逐漸下降，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ傷后表達持續(xù)性升高。計算機軟件分析圖片陽性染色強度，其吸光度(A)值越大，表示陽性染色物質(zhì)越多，運用SPSS 13.0軟件行A、B兩組樣本均數(shù)t檢驗，兩組均數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5～8。

5 不同時間TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA含量的表達變化

以A組坐骨神經(jīng)TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表達作為參考，B組TGF-β1mRNA表達明顯升高，于術(shù)后4周達到高峰，最高可達A組4倍，以后逐漸下降。COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表達也顯著升高，于術(shù)后6周達到高峰，后處于平臺期。兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖9、10。

6 不同時間TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量(Western Blot)分析

神經(jīng)組織中TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白均有不同程度的表達。與A組坐骨神經(jīng)TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量相比，B組TGF-β1蛋白含量明顯升高，于術(shù)后4周達到高峰，以后逐漸下降。COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量也顯著升高，于術(shù)后6周達到高峰，后處于平臺期。A、B兩組均數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 圖2

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)牽拉傷后3D T2W1圖像：坐骨神經(jīng) 牽拉段及牽拉遠段腫脹,信號明顯升高

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)牽拉傷后3D T2W1/SPIR圖像：坐骨 神經(jīng)牽拉段及牽拉遠段腫脹,信號升高更為明顯

圖3 圖4

圖3 大鼠坐骨神經(jīng)牽拉段光鏡下表現(xiàn) 神經(jīng)纖維彌漫變性、斷裂(HE ×200)

圖4 坐骨神經(jīng)牽拉段電鏡表現(xiàn) 髓鞘崩解,軸突溶解 (×3000)

圖5 圖6

圖5 A組TGF-β1免疫組化圖像，染色呈陰性 ×200

圖6 B組4周時見大量片狀棕黃色TGF-β1陽性染色 ×200

圖7 圖8

圖7 B組6周時大量條索狀棕黃色陽性染色物質(zhì)COL-Ⅰ ×200

圖8 B組大量條索狀、棕褐色陽性染色物質(zhì)COL-Ⅲ ×200

圖9 圖10

圖9 各實驗組不同時間TGF-β1 mRNA表達相對值

圖10 各實驗組不同時間COL-I mRNA表達相對值

討 論

周圍神經(jīng)損傷模型以擠壓傷、切割傷報道較多，牽拉傷模型國內(nèi)外報道較少。本研究模擬牽拉傷機制，對大鼠坐骨神經(jīng)制作周圍神經(jīng)牽拉傷模型進行研究。Fullarton等[1]先用兩把緊鄰著的Dunhill鉗鉗夾神經(jīng)造成擠壓傷，再牽拉至5mm，然后持續(xù)性牽拉神經(jīng)30s，使牽拉段神經(jīng)最終長1.5cm，建立了山羊臂叢神經(jīng)牽拉傷的模型，其主要對牽拉傷的神經(jīng)修補時間及方法進行了研究。本研究借鑒其牽拉傷模型制作方法并進行改良，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，成功建立了坐骨神經(jīng)牽拉傷模型，病理顯示造成周圍神經(jīng)Sunderland Ⅳ度損傷[2]。坐骨神經(jīng)損傷后，大鼠損傷側(cè)后肢出現(xiàn)脫毛、潰瘍腫脹、趾骨外露，這些改變與神經(jīng)損害后神經(jīng)營養(yǎng)障礙、感覺神經(jīng)功能障礙、感覺缺失后肢體反復的機械損傷、坐骨神經(jīng)損傷后運動功能障礙導致機械性損傷機會增多等因素有關(guān)。

周翠屏等[3]報道兔坐骨神經(jīng)急性牽拉傷后，T2W1信號增高，神經(jīng)/肌肉信號強度比的動態(tài)變化能無創(chuàng)地反映神經(jīng)損傷后病理學上逐漸修復的過程，可作為檢測神經(jīng)損傷退變和修復及評估預(yù)后的有效手段。Stanisz等[4]在神經(jīng)切割傷和擠壓傷后第1、2、3、4、6周測量了T1及T2值，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后，神經(jīng)的脫髓鞘、炎癥反應(yīng)及軸突缺損引起T1、T2值升高。本研究中坐骨神經(jīng)牽拉傷后，牽拉近段、牽拉段及牽拉遠段神經(jīng)的T2W1信號升高，T1、T2值顯著延長；而病理組織學此時表現(xiàn)為坐骨神經(jīng)牽拉傷后神經(jīng)外膜充血、腫脹、炎癥細胞浸潤，牽拉段神經(jīng)纖維彌漫性壞死、崩解，變成均質(zhì)淡染無結(jié)構(gòu)物質(zhì)；電鏡下表現(xiàn)為神經(jīng)纖維彌漫崩解呈碎片。從MRI及病理組織學上說明大鼠坐骨神經(jīng)牽拉傷模型制作成功。

已有實驗研究證明，神經(jīng)急性鉗夾傷后，其TGF-β1表達明顯升高，而TGF-β1是公認的促進細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積、刺激膠原合成增加引起器官纖維化的重要因子，實驗旨在研究神經(jīng)慢性牽拉損傷后其ECM內(nèi)膠原蛋白含量變化及TGF-β1在此過程中的表達規(guī)律及作用。與對照組相比，牽拉組TGF-β1、COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ含量均明顯升高；TGF-β1在牽拉后第4周達到高峰，后有逐漸下降趨勢，但仍處于高表達狀態(tài)；COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ含量也持續(xù)升高，于牽拉后6周達到高峰，后處于平臺期。TGF-β1的高表達與COL-Ⅰ、 COL-Ⅲ的升高在一定時期呈正相關(guān)，尤其在牽拉早期約4周內(nèi)，二者含量同步升高。證明牽拉后TGF-β1升高為膠原蛋白高表達，促進神經(jīng)纖維化的一個重要因素。

Cahbrese和Kitamura等[5-6]分別實驗研究證實，肝纖維化組織中TGF-β1和Smad 4的表達明顯升高，其mRNA高表達主要集中在肝Kupffer細胞內(nèi)，促使肝纖維化形成。陳亮等[7]從細胞與分子學水平研究證明TGF-β1在細胞組織纖維化發(fā)生過程中的重要作用。有人通過有效干擾TGF-β1mRNA、Smad 4基因的轉(zhuǎn)錄，延緩實驗動物肝病的進展，說明TGF-β1參與膠原纖維的形成、沉積和肝纖維化的發(fā)生。Chodon等[8]在病理性瘢痕中發(fā)現(xiàn)TGF-β1水平顯著增高，TGF-β1的增加能顯著抑制Fas介導的成纖維細胞凋亡，加速成纖維細胞的增殖和膠原合成速度。由此可見，TGF-β1的高表達是促進纖維化的重要因素，但纖維化發(fā)生機制及治療措施有待研究探索。

[1] Fullarton AC,Lenihan DV,Myles LM,et al.Assessment of the method and timing of repair of a brachial plexus traction injury in an animal model for obstetric brachial plexus palsy[J].J Hand Surg(Br),2002,27(1):13-19.

[2] Robinson LR.Traumatic injury to peripheral nerves[J].Muscle Nerve,2000,23(6):863-873.

[3] 周翠屏,成麗娜,段小慧,等.兔坐骨神經(jīng)急性牽拉傷模型的制作：MRI與病理對照[J].中國醫(yī)學影像技術(shù),2009,25(S1):5-7.

[4] Stanisz GJ,Midha R,Munro CA,et al.MR properties of rat sciatic nerve following trauma[J].Magn Reson Med,2001,45(3):415-420.

[5] Calabrese F，Valente M，Giacometti C，et al．Parenchyrnal transforming growth factor-beta 1：its type Ⅱ receptor and Smad signaling pathway correlate with inflammation and fibrosis in chronic liver disease of viral etiology[J].J Gastreenterol Hepatol，2003，18(11)：1302-1308．

[6] Kitamura Y，Ninomiga H．Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrhosis in vivo and hepatic stellate cell liver in vitro[J].Pathol Int，2003，53(1)：18-26．

[7] 陳亮，陳振兵，翁雨雄,等．Erk和p38信號轉(zhuǎn)導通路對大鼠肌源性干細胞內(nèi)結(jié)締組織生長因子表達的調(diào)控作用[J].中華手外科雜志，2010,26(2)：110-112．

[8] Chodon T,Sugihara T,Igawa HH,et al.Keloid-derived fibroblasts are refractory to Fas-mediated apoptosis and neutralization of autocrine transforming growth factor-beta 1 can abrogate this resistance[J].Am J Pathol,2000,157(5):1661-1669.

(本文編輯： 黃小英)

Experimental research of effects of traction injury on the rat sciatic nerve

TONGChang-jun,WEIYou-xiu,HUANGKang

(Department of Orthopedics,Liyuan Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China)

Objective To investigate the change of MRI, transforming growth factor β1(TGF-β1) and collagen type Ⅰ,Ⅲ(COL-Ⅰ,Ⅲ) after sciatic nerve traction injury. Methods Fifty adult male SD rats were randomly divided into group A and B. In group A(the control group)the sciatic nerve of rats was exposed only. In group B(the traction injury group) the sciatic nerve of rats was tracted by smooth forceps to produce traction injury. Electron microscopy, immunochemistry,RT-PCR and Western Blot were performed to observe the morphological changes of the tracted nerve tissue and to determine the level of TGF-β1,COL-Ⅰand COL-Ⅲ at 3 days and 2,4,6,8 weeks after the surgery,respectively. Results The injured nerve was characterized as thickened in size and increased T1 and T2 relaxation time. The expression of TGF-β1 in the traction injury group was significantly higher than that of the control group(P<0.05). In the meanwhile,the contents of COL-Ⅰ,COL-Ⅲ were positively correlated in a certain period(P<0.05). Conclusion Peripheral nerve fibrosis can be caused by nerve traction injury which induces increased expression of COL-Ⅰ，COL-Ⅲ in the nerve. TGF-β1 is significantly higher than that of the control group,which suggests that TGF-β1 plays an important role in the process of neural injury and fibrosis.

traction injury; sciatic nerves; MRI; transforming growth factor; collagen

1009-4237(2017)01-0035-04

華中科技大學自主創(chuàng)新研究基金資助項目(2013QN126)

430077 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院骨科

魏優(yōu)秀，E-mail:2713910700@qq.com

R 651.3

A 【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2017.01.009

2016-01-21；

2016-05-20)