莪術(shù)二酮轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇的方法優(yōu)化

周 陽，陳 平，雷 敏，胡立宏

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所 中藥現(xiàn)代化中心，上海 201203)

莪術(shù)二酮轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇的方法優(yōu)化

周 陽1， 2，陳 平1，雷 敏2，胡立宏2

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所 中藥現(xiàn)代化中心，上海 201203)

本文對莪術(shù)二酮轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇的方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化研究，采用HPLC外標(biāo)法測定不同反應(yīng)條件下莪術(shù)醇的產(chǎn)率，考察溶劑、溫度、時間、底物濃度對反應(yīng)產(chǎn)率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，加熱回流7 h，莪術(shù)二酮濃度為20 mg.mL-1時莪術(shù)醇產(chǎn)率最高，分離收率達(dá)80.5%，產(chǎn)物經(jīng)重結(jié)晶純度可達(dá)98%(HPLC)。

莪術(shù)醇；莪術(shù)二酮；轉(zhuǎn)化；回流

1 引言

莪術(shù)醇(1)是從莪術(shù)藥材中提取分離的藥用單體成分。從上個世紀(jì)七十年代起莪術(shù)醇已作為治療宮頸癌的藥物，近年來也有文獻(xiàn)報道其具有抗菌、抗病毒[1]、抗炎[2]、抗癲癇[3]及抗乳腺癌[4]、肝癌[5]、腸癌[6]的藥理活性。但莪術(shù)醇在莪術(shù)藥材中含量較低，在蓬莪術(shù)(Curcuma phaeocaulis Val.)、廣西莪術(shù)(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang)、溫郁金(Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling)中含量分別在0.02—0.05 mg·g-1、0.06—0.09 mg·g-1、0.19—0.24 mg·g-1[ 7]。但是，與莪術(shù)醇具有生源合成關(guān)系的莪術(shù)二酮(2)在三種莪術(shù)藥材中含量相對較高，在蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)中含量分別為0.3—1.5 mg·g-1、0.3—1.5 mg·g-1，而溫郁金藥材中莪術(shù)二酮含量高達(dá)15—18 mg·g-1[ 8]。由于莪術(shù)醇在莪術(shù)藥材中含量較低，采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾的方法提取揮發(fā)油，柱層析或分餾的方法分離純化的效率不高[9,10]；且莪術(shù)藥材中其他成分不能充分利用，導(dǎo)致藥材資源的浪費(fèi)。而存在的這種資源問題嚴(yán)重限制了莪術(shù)醇的藥理、臨床的深入研究。1985年計志忠、曾昭鈞發(fā)現(xiàn)莪術(shù)藥材中含量較高的莪術(shù)二酮在封管條件下[11]及高壓反應(yīng)釜中[12]能轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，封管反應(yīng)產(chǎn)率較低，高壓反應(yīng)釜存在一定安全隱患；1988年該課題組又報道稱莪術(shù)二酮可以在AlCl3催化條件下定量轉(zhuǎn)化成莪術(shù)醇，我們按照該方法制備的產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)譜、碳譜、氫譜鑒定產(chǎn)物不是莪術(shù)醇，而是莪術(shù)內(nèi)酯(3)[13,14]。鑒于莪術(shù)醇在藥學(xué)領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景及傳統(tǒng)獲取方法的局限性，本文著重探討了一種在回流條件下莪術(shù)二酮轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇的方法以解決莪術(shù)醇資源供應(yīng)問題，以滿足莪術(shù)醇的后續(xù)開發(fā)利用。

圖1 莪術(shù)二酮(1)、莪術(shù)醇(2)、莪術(shù)內(nèi)酯(3)的結(jié)構(gòu)

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Waters2996高效液相色譜儀，Waters2695檢測器(USA)，ELSD-6000檢測器；Waters SQD MS/SQD液質(zhì)聯(lián)用儀(USA)；IKA C-MAG HS7磁力攪拌器(廣州)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA OSB-2100恒溫水浴鍋，EYELA CA-1111冷卻水循環(huán)儀(上海)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州)；ZF-1三用紫外分析儀(上海)。

莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮由本實(shí)驗(yàn)室從溫郁金藥材中提取分離得到，經(jīng)HPLC-UV檢測純度大于98%；乙腈(色譜純Adamas-beta)；甲酸(色譜純Aladdin)；純凈水(娃哈哈)；其他反應(yīng)溶劑均為國藥分析純試劑。

2.2 方法

兩口燒瓶中加入莪術(shù)二酮(1.0 g，4.23 mmol)和50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌升溫至回流，記錄時間，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程(10%香草醛硫酸溶液顯色)，7 h后取出放冷至室溫，減壓旋蒸去除溶劑得淡黃色粗品，用石油醚和二氯甲烷重結(jié)晶得透明針狀莪術(shù)醇固體，莪術(shù)醇分離收率80.5%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.87 (d, J=2.5 Hz, 2H), 2.61-2.47 (m, 3H), 2.22-2.09 (m, 2H), 2.01-1.82 (m, 2H), 1.81-1.62 (m, 3H), 1.55-1.39 (m, 2H), 1.28-1.12 (m, 1H), 1.00 (dd, J=6.6, 4.7 Hz, 6H), 0.86 (d, J=6.5 Hz, 3H).

13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 144.71, 112.88, 104.50, 88.07, 56.43, 54.48, 39.37, 38.77, 34.71, 30.91, 28.72, 28.24, 23.06, 21.48, 12.36.

圖2 反應(yīng)路線

2.3 性能測試

2.3.1 色譜條件

色譜柱Waters C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；流動相 乙腈-0.1%甲酸水溶液(45：55)等度洗脫；柱溫 30℃；流速 1 mL·min-1；檢測波長 200 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密稱取莪術(shù)醇2.2 mg，4.2 mg，6.0 mg，8.1 mg，12.2 mg用甲醇定容至5 mL。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣二次記錄峰面積，取平均值，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=1826000X + 2317590，r2= 0.9991，n = 5)。在0.44—1.62 mg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液制備及反應(yīng)產(chǎn)率的計算

將莪術(shù)二酮(80 mg，0.34 mmol)按一定濃度溶于溶劑中，攪拌升溫至溶劑回流，記錄反應(yīng)時間。反應(yīng)完畢后取出放冷，減壓旋蒸去除溶劑，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣二次記錄峰面積，取平均值，按2.3.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計算莪術(shù)醇產(chǎn)率。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同反應(yīng)溶劑對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

反應(yīng)條件同2.2，考察了不同反應(yīng)溶劑對莪術(shù)醇產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表1

表1 溶劑對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

序號溶劑產(chǎn)率/%1乙醇—2吡啶9．73甲苯8．34二甲苯56．75N，N?二甲基甲酰胺71．36N，N?二甲基乙酰胺70．87乙二醇38．2

由表1可知，無論是低沸點(diǎn)還是高沸點(diǎn)的質(zhì)子性溶劑都不利于反應(yīng)的進(jìn)行，通過TLC以及LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)反應(yīng)較雜。于是考察了不同沸點(diǎn)的非質(zhì)子性溶劑，隨著溶劑沸點(diǎn)的升高，產(chǎn)率有較大的提升且產(chǎn)物單一。分析原因莪術(shù)二酮轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇屬于熱重排反應(yīng)，需要較高的溫度，因此，以高沸點(diǎn)溶劑如DMF、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)作反應(yīng)溶劑時反應(yīng)產(chǎn)率較高，但由于DMAC價格較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，故選擇DMF作為反應(yīng)溶劑。

3.2 不同反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

反應(yīng)條件同2.2，以DMF作溶劑考察了不同反應(yīng)溫度對莪術(shù)醇產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表2。

表2 溫度對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

序號溫度/℃產(chǎn)率/%11001．9212012．3314033．4416066．85回流72．1

由表2可知，隨溫度的升高產(chǎn)率逐漸升高，較高的溫度是反應(yīng)進(jìn)行的必要條件。加熱至回流產(chǎn)率達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)回流條件下反應(yīng)5 h莪術(shù)二酮仍有剩余，考慮通過延長反應(yīng)時間進(jìn)一步提高產(chǎn)率。

3.3 不同反應(yīng)時間對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

反應(yīng)條件同2.2，在DMF作溶劑，加熱回流條件下考察了不同反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響

序號反應(yīng)時間/h產(chǎn)率/%1362．62469．63571．34677．25779．76871．77970．8

由表3可知，在一定范圍內(nèi)，延長反應(yīng)時間產(chǎn)率升高，延長至8—9 h時，產(chǎn)率有所降低。反應(yīng)時間7 h產(chǎn)率達(dá)到最高。

3.4 不同濃度對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

反應(yīng)條件同2.2，在DMF作溶劑，加熱回流，反應(yīng)時間7 h條件下考察了不同濃度對產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表4。

表4 濃度對產(chǎn)率的影響

序號濃度/mg．mL-1產(chǎn)率/%1576．321077．532082．944081．558077．1

由表4可知，不同的濃度對反應(yīng)產(chǎn)率影響較小，考慮反應(yīng)后處理以及放大反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性，可以選擇較高的濃度比以減少溶劑的用量。

4 結(jié)論

我們成功地開發(fā)了一種由量豐莪術(shù)二酮生產(chǎn)莪術(shù)醇的方法。該方法簡便易行，為莪術(shù)醇的制備提供參考。以DMF為溶劑，濃度20 mg·mL-1攪拌加熱至回流7 h莪術(shù)二酮以82.9%的產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為莪術(shù)醇。減壓旋蒸回收溶劑，石油醚和二氯甲烷重結(jié)晶，莪術(shù)醇收率80.5%，純度98%。

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The optimization on transformation from Curdione to Curcumol

ZHOUYang1,2,CHENPing1，LEIMin2,HULi-hong2

(1. School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

The method of transformation from curdione to curcumol was optimized. HPLC with external standard method was used to measure the reaction yield under different solvent, temperature, time and concentration. A optimized result was obtained with N,N-Dimethylformamide as solvent, under refluxing for 7 hours, and 20 mg.mL-1curdione, the best yield of curcumol was up to 80.5% and purity was over 98%.

curcumol; curdione; transformation; reflux

2017-2-13

周陽(1991-)，男，碩士研究生，E-mail：774806463@qq.com

胡立宏(1969-)，研究員， E-mail：lhhu@simm.ac.cn; 陳平(1958-)，女，教授，E-mail：chenpingvip24@163.com

2095-7386(2017)01-0030-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.006

TS 252

A