基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討二至丸“異病同治”治療圍絕經(jīng)期綜合征及異常子宮出血的作用機(jī)制

伍娟娟 韋美秀 劉銳

二至丸原名“女貞丸”,由等份女貞子、墨旱蓮組成,首載于《扶壽精方》,明代王三才在《醫(yī)便》中將其更名為二至丸。女貞子甘、苦、涼,功能滋補(bǔ)肝腎,涼血止血;墨旱蓮甘、酸、寒,有補(bǔ)益肝腎、明目烏發(fā)之效。兩藥同歸肝、腎經(jīng),均為臨床常用補(bǔ)陰藥,兩藥組方可加強(qiáng)補(bǔ)益肝腎,滋水涵木之功?！夺t(yī)方集解》言其能“補(bǔ)腰膝,壯筋骨,強(qiáng)陰腎,烏髭發(fā)”,是補(bǔ)肝益腎,滋陰止血的經(jīng)典方劑。

圍絕經(jīng)期綜合征(menopausal syndrome,MPS)是指婦女絕經(jīng)前后卵巢功能衰退,雌激素分泌減少或水平波動(dòng)而導(dǎo)致的一系列自主神經(jīng)功能紊亂或伴有神經(jīng)心理癥狀的臨床綜合征[1-2],臨床常見(jiàn)圍繞月經(jīng)紊亂或出現(xiàn)烘熱汗出、煩躁易怒、心悸失眠、精神倦怠、腰酸背痛等與絕經(jīng)相關(guān)的不適癥候[3],研究表明約80 %的女性會(huì)出現(xiàn)不同程度的更年期癥狀[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)性激素替代療法通過(guò)調(diào)整體內(nèi)雌激素水平能有效改善患者不適癥狀,但長(zhǎng)期使用會(huì)增加乳腺癌、靜脈血栓、子宮內(nèi)膜癌等風(fēng)險(xiǎn)[5]。異常子宮出血(abnormal uterine bleeding,AUB)是婦科常見(jiàn)病,臨床上常表現(xiàn)為非行經(jīng)時(shí)陰道不規(guī)則出血,量或多或少,可引起不同程度的貧血、盆腔炎性疾病、影響女性生育等多種并發(fā)癥,對(duì)女性的生活質(zhì)量及身心健康造成嚴(yán)重影響。該病多發(fā)于圍絕經(jīng)期,與下丘腦—垂體—卵巢軸功能障礙導(dǎo)致無(wú)排卵密切相關(guān)[6]。圍絕經(jīng)期女性卵巢功能衰退,卵巢內(nèi)剩余卵泡對(duì)垂體促性腺激素反應(yīng)性降低,雌激素分泌減少,無(wú)排卵前黃體生成素(luteinizing hormone,LH)峰的形成,引起無(wú)排卵,此時(shí)子宮內(nèi)膜受到單一雌激素的影響而無(wú)孕激素對(duì)抗常導(dǎo)致異常子宮出血的發(fā)生[7]。

MPS屬中醫(yī)“絕經(jīng)前后諸證”范疇,中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本,婦女絕經(jīng)前后腎氣漸衰,天癸近竭,腎精虧虛、陰陽(yáng)失調(diào)、沖任氣血不足為本病基本病機(jī)[8],臨床上使用二至丸加味治療肝腎虧虛型MPS能有效改善患者潮熱汗出、失眠等臨床癥狀,降低卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平,同時(shí)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雌激素補(bǔ)充治療相比無(wú)增加患者子宮內(nèi)膜癌等風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢(shì)[9-10]。AUB相當(dāng)于中醫(yī)所言“崩漏”,崩漏為經(jīng)亂之甚,中醫(yī)認(rèn)為沖任二脈損傷不能制約經(jīng)血為其基本病機(jī),究其原因,或腎氣不固,不能調(diào)經(jīng)攝血;或熱擾沖任,迫血妄行;或肝腎功能失調(diào),血海蓄溢失常等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療上常以口服性激素藥物或診斷性刮宮為主,性激素治療因胃腸道反應(yīng)及肝功能損害等不良反應(yīng)一般不宜長(zhǎng)期使用[11],且停藥易復(fù)發(fā),而手術(shù)方法患者接受度不高,使其治療存在一定局限性。臨床上將二至丸聯(lián)合西藥治療肝腎虧虛型AUB療效率高,且在月經(jīng)周期的恢復(fù)上有顯著優(yōu)勢(shì)[12]。

“異病同治”是指具有相同病機(jī)的不同疾病能采用同一方法治療的法則,“證同則治同,證異則治異”,中醫(yī)治病不拘泥于病的異同,而著眼于病機(jī)的異同[13]。MPS和AUB雖屬于不同疾病,但其發(fā)病均與卵巢功能衰退、內(nèi)分泌失調(diào)密切相關(guān),從中醫(yī)辨證論治角度分析,肝腎虧虛為其二者共有病機(jī),二至丸在治療MPS和AUB方面發(fā)揮了獨(dú)特優(yōu)勢(shì),符合中醫(yī)“異病同治”的理念。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用生物信息網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)反應(yīng)藥物對(duì)疾病的干預(yù)機(jī)制,從整體探索中藥和機(jī)體的作用關(guān)系,切合中醫(yī)整體論的思想[14]。本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從“異病同治”角度探討二至丸治療MPS和AUB的作用機(jī)制,為臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 二至丸藥物活性成分及潛在作用靶點(diǎn)的獲取

以“女貞子”“墨旱蓮”為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php/)中進(jìn)行檢索,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18作為篩選條件,初步篩選出二至丸藥物活性成分。進(jìn)一步檢索獲取藥物活性成分潛在作用靶點(diǎn),利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 MPS及AUB疾病靶點(diǎn)的獲取

分別以“perimenopausal syndrome、climacteric syndrome、Menopausal syndrome、Menopausal symptoms”及“metrorrhagia 、AUB”為關(guān)鍵詞,通過(guò)GeneCards(https://www,genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,獲得MPS及AUB的相關(guān)疾病靶點(diǎn),分別將獲取疾病靶點(diǎn)整合去重后篩選,利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html/)對(duì)疾病靶點(diǎn)取交集,得到MPS及AUB的共有靶點(diǎn)。

1.3 藥物—活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Venny 2.1.0對(duì)二至丸潛在作用靶點(diǎn)與MPS及AUB的共有靶點(diǎn)取交集,并繪制韋恩圖,得到二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點(diǎn),根據(jù)潛在作用靶點(diǎn)篩選出對(duì)應(yīng)的二至丸藥物活性成分,將藥物、活性成分及作用靶點(diǎn)等信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,構(gòu)建二至丸異病同治治療MPS及AUB的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)在線平臺(tái),物種選擇“Homo sapiens”(人類),“medium confidence”(中等置信度)為0.4作為篩選條件,其余參數(shù)保持默認(rèn)值,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI),將結(jié)果以TSV文件格式導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0平臺(tái)進(jìn)行拓?fù)浞治?根據(jù)度值(Degree)篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用Metascape平臺(tái)(https://metascape.org/)對(duì)二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析,將結(jié)果導(dǎo)入Excel表格,數(shù)據(jù)按Pvalue值以升序進(jìn)行排序,以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),利用微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)分別對(duì)GO富集的前10個(gè)及KEGG富集的前20個(gè)條目進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),從TCMSP下載藥物活性成分的mol2格式,Pymol軟件去水、加氫、去配體殘基,使用Autodock 4.2.6進(jìn)行對(duì)接,獲取靶點(diǎn)與活性成分的最低結(jié)合能,并使用 Pymol 2.5.0進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 二至丸藥物活性成分及潛在作用靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)TCMSP共檢索到二至丸共有23種藥物活性成分,其中女貞子活性成分13個(gè)、墨旱蓮活性成分10個(gè),刪除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)活性成分后得到女貞子、墨旱蓮有效活性成分各8個(gè),其中共有活性成分2個(gè),見(jiàn)表1。進(jìn)一步利用 TCMSP對(duì)藥物活性成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè),分別獲得女貞子、墨旱蓮對(duì)應(yīng)活性成分靶點(diǎn)321及264個(gè),合并后刪除重復(fù)靶點(diǎn)得到195個(gè)。

表1 二至丸藥物活性成分

2.2 MPS及AUB疾病靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得MPS及AUB相關(guān)靶點(diǎn)3490、485個(gè),以相關(guān)性分?jǐn)?shù)(Relevance score)大于等于中位數(shù)為條件進(jìn)行篩選,最終選取得到MPS及AUB相關(guān)靶點(diǎn)1745及182個(gè),利用Venny 2.1.0對(duì)疾病靶點(diǎn)取交集,并進(jìn)行可視化,得到疾病共有靶點(diǎn)110個(gè),見(jiàn)圖1。

圖1 MPS及AUB疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 藥物—活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將二至丸潛在作用靶點(diǎn)與MPS及AUB共有靶點(diǎn)取交集,得到28個(gè)交集靶點(diǎn),即為二至丸異病同治治療MPS及AUB的潛在作用靶點(diǎn),見(jiàn)圖2。根據(jù)潛在作用靶點(diǎn)反向篩選出對(duì)應(yīng)的二至丸藥物活性成分,其中女貞子9個(gè)、墨旱蓮6個(gè),其中共有活性成分2個(gè)。利用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建藥物—活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)由40個(gè)節(jié)點(diǎn)、72條邊構(gòu)成,其中包含28個(gè)交集靶點(diǎn)、2個(gè)藥物及10個(gè)藥物活性成分。利用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將藥物活性成分按照Degree值進(jìn)行排序,前5位的活性成分分別為槲皮素(quercetin,degree=27)、木犀草素(luteolin,degree=12)、山奈酚(kaempferol,degree=9)、金合歡素(acacetin,degree=5)及β-谷甾醇(beta-sitosterol,degree=4),以上活性成分可能為二至丸治療MPS及AUB的關(guān)鍵活性成分。

圖2 疾病共有靶點(diǎn)與二至丸靶點(diǎn)交集韋恩圖

注綠色箭頭及圓形分別代表女貞子及其活性成分,藍(lán)色箭頭及圓形分別代表墨旱蓮及其活性成分,紅色圓形為藥物共有成分,粉色菱形為藥物與疾病交集靶點(diǎn)。圖3 二至丸異病同治治療MPS及AUB的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將28個(gè)藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)包括28個(gè)節(jié)點(diǎn)、193條邊,其中孤立節(jié)點(diǎn)1個(gè),以medium confidence>0.4為篩選標(biāo)準(zhǔn),將篩選結(jié)果以TSV文件格式導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,利用Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?計(jì)算出該網(wǎng)絡(luò)平均 Degree 值為3.6,平均接近中心性為0.431511,平均介數(shù)中心性為0.036032。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化,網(wǎng)絡(luò)中點(diǎn)的大小及顏色深淺與度值的大小呈正相關(guān),度值越大顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大(見(jiàn)圖4)。根據(jù)Degree值大小篩選出排名前10的靶點(diǎn)作為二至丸異病同治治療MPS及AUB的核心靶點(diǎn),包括EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α等,見(jiàn)表2。

圖4 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)前10位靶點(diǎn)拓?fù)浞治?/p>

2.5 GO和KEGG富集分析

對(duì)28個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,共得到651條GO富集條目(P<0.05),其中生物過(guò)程(biological processes,BP)575條,主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞遷移的上調(diào)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、腺體發(fā)育、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答等生物過(guò)程;細(xì)胞組分(cell components,CC)18條,主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物等;分子功能(molecular function,MF)60條,涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控劑結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活劑結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性等,分別對(duì)BP、CC及MF前10個(gè)條目進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖5。KEGG富集分析得到96條相關(guān)通路(P<0.05),對(duì)前20條通路進(jìn)行可視化展示,見(jiàn)圖6,可見(jiàn)主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。

圖5 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點(diǎn)GO富集分析

圖6 二至丸異病同治治療MPS及AUB潛在作用靶點(diǎn)KEGG富集分析

2.6 分子對(duì)接

選取關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素及山奈酚為對(duì)接配體,根據(jù)文獻(xiàn)從核心靶點(diǎn)中篩選出EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA為對(duì)接受體,進(jìn)行對(duì)接并獲取最低結(jié)合能,一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合能越低,其對(duì)接能力越強(qiáng),通常以結(jié)合能<-5.0 KJ/mol(約為-1.2 Kcal/mol)作為結(jié)合性良好的篩選標(biāo)準(zhǔn)[15]。結(jié)果顯示,二至丸關(guān)鍵活性成分與EGFR、ESR1、HIF-1α、IL-1β、VEGFA的對(duì)接結(jié)合能均小于-5.0 KJ/mol,其中槲皮素與HIF-1α(PDB ID:4h6j)、木犀草素與ESR1(PDB ID:1 err)、山奈酚與VEGFA(PDB ID:1 mjv)親和力最高,其結(jié)合能分別為-4.1 Kcal/mol、-4.87 Kcal/mol、-4.47 Kcal/mol,見(jiàn)表3。分別選取各靶點(diǎn)與其對(duì)接結(jié)合能最低的活性成分繪制對(duì)接模式圖,見(jiàn)圖7。

注A:木犀草素-EGFR;B:木犀草素-ESR1;C:槲皮素- HIF-1α;D:山奈酚- IL-1β;E:木犀草素- VEGFA。圖7 藥物有效成分—靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖

表3 二至丸關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能(Kcal/mol)

3 討論

MPS及AUB為兩種不同的疾病,但其發(fā)病均與卵巢功能衰退,雌激素分泌減少密切相關(guān),中醫(yī)病機(jī)以肝腎虧虛為多見(jiàn)。二至丸具有養(yǎng)陰清熱止血,補(bǔ)益肝腎之功,臨床運(yùn)用該方治療肝腎虧虛型MPS及AUB療效確切[16-18]?，F(xiàn)代研究表明,二至丸具有抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、護(hù)肝、雌激素樣作用等多種作用藥理學(xué)作用[19]。目前臨床上常用于MPS、AUB等婦科病,同時(shí)也應(yīng)用于腎病、皮膚病及內(nèi)分泌疾病等多個(gè)領(lǐng)域,具有“一方多用、異病同治”的特點(diǎn)。本研究基于“異病同治”理論,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法,探討二至丸異病同治治療MPS及AUB的可能作用機(jī)制。

本研究對(duì)二至丸有效成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行挖掘篩選,得到二至丸潛在活性成分14個(gè),潛在作用靶點(diǎn)195個(gè),與MPS及AUB的共有靶點(diǎn)為28個(gè)。藥物—活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示,槲皮素、木犀草素、山奈酚等為二至丸異病同治治療MPS及AUB的關(guān)鍵活性成分。研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎及抗細(xì)胞凋亡等作用[20-21]。Jiao W等[22]人研究顯示,槲皮素可通過(guò)上調(diào)絕經(jīng)期大鼠卵巢及顆粒細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)等氧化應(yīng)激相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)水平,以增加卵巢抗氧化能力。還可通過(guò)減弱脂質(zhì)過(guò)氧化水平,保護(hù)顆粒細(xì)胞免受鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[23]。顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的重要原因,槲皮素通過(guò)抑制PERK/CHOP信號(hào)通路減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞凋亡[24],發(fā)揮治療作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),IL-6等促炎因子在生殖年齡較大的小鼠卵巢中表達(dá)水平升高[25],這些因子可能促進(jìn)卵巢慢性炎癥及組織纖維化,破壞卵巢功能[26],提示炎癥在卵巢衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用,槲皮素通過(guò)抑制NF-κB炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),降低炎癥因子水平,發(fā)揮抗炎效果[27]。槲皮素、木犀草素、山柰酚均屬天然類黃酮化合物,類黃酮化合物其結(jié)構(gòu)與雌激素具有極高的相似性[28],因此具有一定的雌激素樣作用,補(bǔ)充槲皮素能改善卵母細(xì)胞質(zhì)量及卵泡發(fā)育[29],低濃度的槲皮素能增加雌二醇的生物合成[30],另外木樨草素能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌[31],山奈酚可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)始基卵泡的活化及細(xì)胞增值[32]。同時(shí)山萘酚作為抗氧化劑,通過(guò)增加超氧化物歧化物(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽還原酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性促進(jìn)體外培養(yǎng)的次級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育[33]。

對(duì)二至丸異病同治治療MPS及AUB的共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選,得到EGFR、TP53、ESR1、VEGFA、MMP9、IL-1β、HIF-1α、MMP2、CCND1、MYC共10個(gè)核心靶點(diǎn)。其中ESR1是雌激素受體ERα亞型的編碼基因,ERα主要表達(dá)于卵泡膜細(xì)胞上,調(diào)節(jié)雌激素的促增生作用,ESR1水平上調(diào)可影響其編碼蛋白ERα的表達(dá),進(jìn)而影響血清雌二醇的水平的變化,從而對(duì)卵泡的發(fā)育、成熟及排出產(chǎn)生影響。VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族的一員,其血管形成及血管重塑作用能為卵泡的發(fā)育提供充足營(yíng)養(yǎng)及氧氣支持,并促進(jìn)類固醇激素的釋放。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)卵巢注射VEGF能促進(jìn)卵巢卵泡發(fā)育,使排卵前卵泡數(shù)量增加[34],并且具有抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用[35]。研究認(rèn)為生理情況下,IL-1β在FSH及LH的介導(dǎo)下通過(guò)誘導(dǎo)卵泡成熟、調(diào)節(jié)卵巢類固醇生成等方面,參與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,IL-1β具有較強(qiáng)的抗促性腺激素作用,可通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞孕酮分泌及雌激素、雄激素、LH受體的形成發(fā)揮阻止卵泡閉鎖的作用[36]。馬小紅等[37]研究報(bào)道,卵巢早衰患者血清IL-1β水平低于正常婦女,IL-1β可能是引起自身免疫性卵巢早衰的重要因素。HIF-1α是細(xì)胞在缺氧環(huán)境中產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子,在卵巢內(nèi),HIF-1α可通過(guò)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞自噬、凋亡等細(xì)胞死亡途徑,導(dǎo)致卵泡閉鎖,引發(fā)POI[38],通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α功能,阻斷或減少其促凋亡及自噬作用可發(fā)揮卵巢保護(hù)功能。VEGF為HIF-1α下游靶基因,研究證實(shí)[39],在缺氧條件下HIF-1α調(diào)節(jié)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄激活,促進(jìn)血管生成。由此推斷二至丸主要通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素水平、促進(jìn)卵泡發(fā)育、抑制顆粒細(xì)胞凋亡、阻止卵泡閉鎖等途徑改善卵巢功能,從而對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征及異常子宮出血發(fā)揮治療作用。

GO功能顯示,二至丸異病同治治療MPS及AUB主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞遷移的上調(diào)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、腺體發(fā)育等生物過(guò)程。KEGG富集分析結(jié)果提示,AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等是二至丸治療治療MPS及AUB的重要通路。AGEs 是非酶糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物,其在卵巢中積累可通過(guò)促蛋白損傷、氧化應(yīng)激及炎癥導(dǎo)致卵母細(xì)胞損傷[40]。AGEs與RAGE形成結(jié)合AGE-RAGE 信號(hào)通路,介導(dǎo)NADPH氧化酶(oxidase,Nox)和NF-κB激活,促進(jìn)細(xì)胞中OS和炎癥的惡性循環(huán),導(dǎo)致卵巢衰老[41]。PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的增殖與凋亡中起重要作用,實(shí)驗(yàn)研究顯示補(bǔ)腎活血中藥可上調(diào)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)分子PI3K、p-Akt及上游細(xì)胞因子IGF-1、IRS-1的表達(dá),加快顆粒細(xì)胞有絲分裂信號(hào)傳遞,促進(jìn)顆粒細(xì)胞增值,從而促進(jìn)卵泡生長(zhǎng),改善卵巢功能[42]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是PI3K/Akt信號(hào)通路下游重要蛋白,mTOR參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、卵巢顆粒細(xì)胞增殖、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡等過(guò)程[43]。MAPK信號(hào)通路包括JNK、p38和ERK三個(gè)途徑,參與卵母細(xì)胞成熟分裂等過(guò)程,促進(jìn)卵泡成熟。

綜上所述,二至丸可能通過(guò)槲皮素、木犀草素、山奈酚等有效成分,作用于EGFR、ESR1、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等靶點(diǎn),介導(dǎo)AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化、抗炎、抑制顆粒細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)激素水平、促進(jìn)卵泡發(fā)育等作用,改善卵巢功能,發(fā)揮“異病同治”治療肝腎陰虛型MPS及AUB的作用,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)二至丸的治療作用進(jìn)行初步驗(yàn)證,并經(jīng)過(guò)分子對(duì)接進(jìn)一步證實(shí),以期為臨床應(yīng)用提供理論支持。