開放式組織培養(yǎng)研究進(jìn)展與前景

王凱+張昊

從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)成本、培養(yǎng)環(huán)境、抑菌劑及現(xiàn)階段存在的問題幾個(gè)方面綜述了植物開放式組織培養(yǎng)研究的進(jìn)展，并展望了未來發(fā)展的前景。

【關(guān)鍵詞】污染；開放式組織培養(yǎng)；抑菌劑

1839年，德國生理學(xué)家Theodor Schwann（西奧多·施旺）首次提出“細(xì)胞學(xué)”的概念，指出細(xì)胞有機(jī)體在適宜的外部條件下都具有獨(dú)立發(fā)育的潛能，在其之后，Haberlandt進(jìn)一步提出了“細(xì)胞培養(yǎng)”的概念，提出了植物細(xì)胞全能性理論。自此，開放式組織培養(yǎng)研究迎來高潮，高效植物繁殖技術(shù)空前發(fā)展并帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被廣泛的應(yīng)用于科研與生產(chǎn)各項(xiàng)領(lǐng)域之中。但由于植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于無菌環(huán)境的要求極為嚴(yán)格，僅就目前的科研水平來說，常態(tài)化的保持無菌環(huán)境成本巨大，加之植物的種類、取材的時(shí)間、處理的方法、消毒的方式以及工作臺(tái)的質(zhì)量等都有可能產(chǎn)生污染，因此污染問題的控制成為限制植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以及推廣與普及的瓶頸，迫切需要進(jìn)行研究和提升。本文即從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)成本、培養(yǎng)環(huán)境、抑菌劑及現(xiàn)階段存在的問題出發(fā)，闡述植物開放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景，并提出相關(guān)間接和建議，希望能為組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展提供理論借鑒和參考，略盡綿薄之力。

1 培養(yǎng)條件

在煙草組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，利用自然溫度和太陽輻射光代替日光燈進(jìn)行固體培養(yǎng)，取得了很好的效果，同時(shí)在組培室的設(shè)計(jì)中如何建立理想的利用自然光源的組培室也是至關(guān)重要的，培養(yǎng)器容器也有簡化的相關(guān)報(bào)道，極大降低了成本。在非洲菊組培快繁中讓自然溫度和太陽輻射光來代替日光燈和空調(diào)等設(shè)備，如此就可減少用電量，降低成本，且不影響試管苗的質(zhì)量。

2 減少成本的研究

為進(jìn)一步降低植物組織培養(yǎng)成本，我們分別以自來水、蒸餾水、雨水為材料進(jìn)行試驗(yàn)配制培養(yǎng)基。通過相關(guān)數(shù)據(jù)分析，利用自來水與蒸餾水所配制出來的培養(yǎng)基上的植物生長情況數(shù)據(jù)相近，發(fā)育正常；而用三者進(jìn)行馬鈴薯的培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)雨水所制作出的培養(yǎng)基較自來水以及蒸餾水更有利于植株發(fā)展，雨水所制作的培養(yǎng)基馬鈴薯根多而長、植株深綠、發(fā)育優(yōu)良，更有利于移栽（有些工業(yè)地區(qū)的雨水呈酸性，因此，這些地區(qū)的雨水會(huì)對(duì)植物的生長產(chǎn)生不利影響，不能用來配制培養(yǎng)基）。

除了選取材料以控制植物組織培養(yǎng)成本之外，培養(yǎng)容器的選擇也是減少成本的又一重要方式。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們分別以罐頭瓶、簡易塑料瓶、傳統(tǒng)三角瓶等材料對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)：使用冰盒及塑料盒對(duì)櫻桃和蘋果進(jìn)行瓶外生根試驗(yàn)時(shí)，同使用三角瓶時(shí)作物發(fā)育情況基本相同且生長狀態(tài)更為良好（但是塑料盒容積較大時(shí)，植株褐化嚴(yán)重、少數(shù)愈傷組織變褐，導(dǎo)致植株被污染或壞死）。此外，一次性塑料杯在實(shí)驗(yàn)室雖然同罐頭瓶、簡易塑料瓶等材料數(shù)據(jù)相同，但使用及密封過于繁瑣和耗材，因而不適用于在組織培養(yǎng)中應(yīng)用。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，含糖濃度以及有機(jī)物較低的生長環(huán)境不適宜菌類的生長，所以為實(shí)現(xiàn)營造無菌環(huán)境和減少研究成本兩大目的，需要對(duì)植物種類所需糖濃度和有機(jī)物數(shù)量進(jìn)行相關(guān)研究，選取最合適的環(huán)境進(jìn)行組織培養(yǎng)。

袁麗娜研究發(fā)現(xiàn)，卡拉膠比瓊脂粉更能促進(jìn)東北紅豆杉愈傷組織的增加，而培養(yǎng)基對(duì)于東北紅豆杉值體的影響較小。此外，研究發(fā)現(xiàn)，半固態(tài)的培養(yǎng)基更有利于對(duì)東北紅豆杉的細(xì)胞曾重。解輝在香蕉初代培養(yǎng)采用自然光，半液態(tài)培養(yǎng)基，提高了香蕉培養(yǎng)的增殖倍數(shù)，利于移栽成活，另外還可用棉籽殼、珍珠巖等代替生根培養(yǎng)基的固化物，不僅能降低成本，減少生根過程中愈傷組織的產(chǎn)生，而且還提高了生根率。

現(xiàn)階段植物無糖培養(yǎng)逐漸成為植物組織培養(yǎng)的焦點(diǎn)，出現(xiàn)簡化組織培養(yǎng)、降低污染的全新方向。無糖組織培養(yǎng)技術(shù)克服了常規(guī)組織培養(yǎng)過程中普遍的培養(yǎng)容器中氣體環(huán)境差、易污染等問題。無糖組織培養(yǎng)是利用工程技術(shù)手段調(diào)控組培微環(huán)境的CO2、濃度、光照、濕度等因子，提高組培苗質(zhì)量，山芋在無糖組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中未加入糖，通過人工環(huán)境的控制，用二氧化碳代替蔗糖為植物提供碳源，污染率也隨之降低 ，添加谷氨酸是促進(jìn)無糖培養(yǎng)的一條好途徑。20世紀(jì)80年代后期由日本千葉大學(xué)的古在豐樹教授研究開發(fā)組培新技術(shù)，自開發(fā)以來備受人們的關(guān)注。

3 培養(yǎng)環(huán)境

3.1 pH值

植物形態(tài)生成及器官發(fā)育與pH值的聯(lián)系不可分割，特別是對(duì)培養(yǎng)基的軟硬度、鹽類是否沉淀及外植體生長發(fā)育起到?jīng)Q定性作用。在培養(yǎng)基配制時(shí)pH值大多調(diào)整在5.3-5.7之間（固體培養(yǎng)基約為5.7；液體培養(yǎng)基約為5.3） 。pH值太高會(huì)導(dǎo)致固體培養(yǎng)基過硬而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，反之，pH值太低的話又會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基不易凝結(jié)，同樣不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓殺菌或長時(shí)間的培養(yǎng)均會(huì)使pH值降低。降低培養(yǎng)基的pH值，可促進(jìn)硝酸態(tài)氮的利用量，而提高pH值則使錢態(tài)氮利用率提高。

3.2 光源

使用適當(dāng)?shù)墓庠凑丈渲参?，有助于植物的生一長，但在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，大多不照光。適當(dāng)?shù)墓庠赐ǔＰ枰紤]光照的強(qiáng)度，光周期及光譜性質(zhì)。一般實(shí)驗(yàn)室以14/10小時(shí)的光/暗周期為主。有學(xué)者考察一系列光源對(duì)植物體的影響，指出藍(lán)光有助于莖頂培養(yǎng)的芽體誘導(dǎo)；紅光有助于植物形成不定根。所以藍(lán)光和紅光組合使用，或用全太陽光做為植物生長燈成為實(shí)驗(yàn)室的普遍選擇。這可能和細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)的生理狀態(tài)有關(guān)。

3.3 光

光在植物的生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用，主要體現(xiàn)在光照時(shí)間的長短會(huì)影響百合等植株的休眠狀態(tài)（主要發(fā)生在植株球根的生長和發(fā)育階段）、不同的光環(huán)境會(huì)影響植株的莖葉緊密度和結(jié)實(shí)度以及光照程度會(huì)影響植株表皮顏色的深淺上。有實(shí)驗(yàn)表明，隨著光照強(qiáng)度的增加，植物玻璃化現(xiàn)象逐漸加重，光強(qiáng)達(dá)到40001ux以上時(shí)，組培苗的生長較差。有研究者曾經(jīng)對(duì)蘭州百合進(jìn)行過光照實(shí)驗(yàn)，所設(shè)置的實(shí)驗(yàn)情境為8h黑暗2000LuX16h光照、12h黑暗12h光照兩種。研究發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)環(huán)境有助于降低植株的褐化率，光暗交替培養(yǎng)環(huán)境褐化率則較高，暗處理下的蘭州百合愈傷組織部分呈現(xiàn)為白色或淺黃色，莖葉部分也比光暗交替條件下更為緊密。此外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還證明，黑暗條件下培養(yǎng)180d后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)可提高庸香百合愈傷組織誘導(dǎo)率與分化率。但是需要注意的是，在暗培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)出的植株會(huì)出現(xiàn)明顯的休眠狀況且暗培養(yǎng)環(huán)境下不利于不定芽和小鱗莖的葉片的生長。

3.4 溫度

溫度是影響組織培養(yǎng)的又一個(gè)關(guān)鍵性因素，是影響百合鱗莖休眠的最主要因子。實(shí)驗(yàn)證明，低溫條件下外植物的分化活動(dòng)變得更為活躍，提高了鱗莖的生理活性，從而有助于促進(jìn)該植株的生長和發(fā)育。此外，高溫（28-29℃）培養(yǎng)與叢芽繼代方式實(shí)現(xiàn)了蘭州百合高頻溫燙處理種球可顯著提高‘多安娜及‘普瑞頭幼的耐熱性。一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)相對(duì)濕度容易忽視，導(dǎo)致霉菌及微生物滋生，或造成玻璃質(zhì)化現(xiàn)象，一般濕度以70%為宜。

3.5 水

水分在植物的生長中發(fā)揮著極其重要的作用，植物生長的每一個(gè)階段都離不開水，水分虧缺往往可以加速百合休眠，甚至可以直接引起休眠，所以根據(jù)目的不同可以通過水分來調(diào)控百合的休眠。除此之外物理作用也會(huì)影響百合的生長和分化，微直流可促進(jìn)多種植物培養(yǎng)組織的生長和分化。一般實(shí)驗(yàn)室以14/10小時(shí)的光/暗周期為主，濕度高易滋生霉菌及微生物，或造成組培苗質(zhì)量下降的現(xiàn)象。

4 現(xiàn)階段開放式組培存在的問題

植物組織培養(yǎng)中最容易出現(xiàn)的是污染問題。在植物組培過程中，組培瓶清洗不干凈、培養(yǎng)基滅菌不徹底、接種用具滅菌不嚴(yán)格、超凈工作臺(tái)帶菌太多、無菌操作不規(guī)范、接種室消毒不嚴(yán)格或后期培養(yǎng)室管理不規(guī)范等均會(huì)導(dǎo)致污染的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)人員的操作手段也會(huì)引起污染，要防止實(shí)驗(yàn)人員被微生物感染。

4.1 廣譜性抑菌劑的問題

不同的植物在組培過程中產(chǎn)生的污染菌類不同，菌類的種類及抗性又具有很大的復(fù)雜性，就現(xiàn)階段而言還沒有找到針對(duì)各種污染菌類均有抑制作用的廣譜性抑菌劑，已投入使用的部分抑菌劑有次氯酸鈉，代森錳鋅等?，F(xiàn)階段已有人發(fā)現(xiàn)對(duì)部分植物具有廣譜性殺菌能力的抗菌劑，但是對(duì)于大部分植物的抑菌劑仍未報(bào)道。

4.2 抑菌劑對(duì)組培苗的生長是否有影響

在植物開放組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基加入抑菌劑對(duì)植株生長是否具有抑制作用僅就目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)論證而言還沒有統(tǒng)一定論。目前僅能確定的是針對(duì)某些已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析的植物所篩選出來的抑菌劑是對(duì)植物生長沒有影響的，但是繼代培養(yǎng)之后的變異情況還需要另行分析或?qū)嶒?yàn)研究，尤其是在如今抑菌劑對(duì)苗木的抑制作用的機(jī)理相關(guān)理論尚未突破的情況下。

4.3 開放式組織培養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境問題

迫于技術(shù)條件的限制，現(xiàn)階段的開放式組織培養(yǎng)研究還不十分成熟，培養(yǎng)環(huán)境還沒有達(dá)到自然培養(yǎng)的要求，僅限于在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（只需要進(jìn)行規(guī)范的操作和精確的環(huán)境控制即可），存在較大的局限性，迫切需要在形式上和技術(shù)上予以突破。但目前，開放組培和光自養(yǎng)微繁殖還處于探索階段，其中包括廣譜抑菌劑的篩選和抑菌劑對(duì)組培苗生長影響、培養(yǎng)環(huán)境問題。

5 展望

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的重中之重在于無菌，并且需要昂貴的設(shè)備，技術(shù)要求苛刻，難以廣泛應(yīng)用普及。近些年無數(shù)科學(xué)家探索簡化傳統(tǒng)組織培養(yǎng)，但均未獲得顯著突破。組培污染主要是由于富含營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，給各種菌類提供了適宜的滋生場(chǎng)所。由此，只要將培養(yǎng)基改造成即保證植物組織正常生長，找到一種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜性殺菌劑使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無菌的操作環(huán)境，具有殺菌、抗菌功能的培養(yǎng)基，進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)是完全可能的。近幾年來，已有不少植物組織培養(yǎng)簡化成功，并應(yīng)用于生產(chǎn)。國外已經(jīng)有100多個(gè)以高檔花卉、蔬菜為主的植物品種實(shí)現(xiàn)了組培產(chǎn)業(yè)化。我國僅有香蕉、馬鈴薯、草幕、蘭花等少數(shù)實(shí)現(xiàn)了組培產(chǎn)業(yè)化。

由于一些添加抑菌劑的組培苗會(huì)出現(xiàn)褐化，生長較緩慢，增殖倍數(shù)較低等影響，這是建立開放式組培難以解決的重要環(huán)節(jié)。因此，篩選并研究合適的抑菌劑對(duì)組培苗生長發(fā)育影響生理，從建立具有較高增殖倍數(shù)和生根率的高效開放式組織培養(yǎng)體系，成為組培新技術(shù)研究的焦點(diǎn)。

有理由相信，開放式組織培養(yǎng)若實(shí)現(xiàn)了低配置成本與無菌環(huán)境普及兩大瓶頸，定會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊市場(chǎng)。因而如何實(shí)現(xiàn)其成本減少與無菌環(huán)境普及兩大難題將是未來較長一段時(shí)間內(nèi)的研究重點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)，衷心期望植物培養(yǎng)組織技術(shù)能真正在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)普及，從而為現(xiàn)代大農(nóng)業(yè)的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支持。

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作者簡介

王凱（1991-），男，陜西省安塞縣人。碩士學(xué)位。研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

張昊（1987-），男，陜西省涇陽縣人。碩士學(xué)位。研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

作者單位

延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陜西省延安市 716000