熟地平顫顆粒對帕金森病大鼠行為學(xué)及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

葉 青，王 凱，袁曉蕾，何 靜，周 潔，袁燦興

熟地平顫顆粒對帕金森病大鼠行為學(xué)及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

葉 青1，王 凱2，袁曉蕾1，何 靜1，周 潔1，袁燦興1

目的 觀察熟地平顫顆粒對帕金森病大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)內(nèi)α-突觸核蛋白(α-syn)表達(dá)的影響。方法 采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠腦右側(cè)黑質(zhì)造成偏側(cè)帕金森病(PD)模型。實驗設(shè)立正常對照組、帕金森病模型組、左旋多巴(LD)組、LD+中藥(TCM)組，治療4周后觀察各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間以及異常不自主運動(AIM)評分的變化；采用RT-PCR方法檢測大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-syn基因表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)法檢測黑質(zhì)內(nèi)α-syn、TH蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與治療前比較，PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間較治療前縮短(P<0.05)。與同期PD組比較，LD組第7天、第14天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間均低于PD組，第28天的評分高于PD組(P<0.05)；與同期LD組比較，LD+TCM組自第21天起的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間評分顯著降低(P<0.05)。LD組大鼠用藥后第14天起的AIM評分逐步增高(P<0.01)；LD+TCM組治療前后AIM評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PD組與正常對照組比較α-synmRNA表達(dá)增高，Levodopa組與PD組比較，α-synmRNA明顯增高，LD+TCM組較LD組α-synmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示：PD組較正常對照組α-syn表達(dá)增加sTH表達(dá)降低；LD組與PD組比較，α-syn表達(dá)增加sTH表達(dá)降低；LD+TCM組與LD組比較，α-syn表達(dá)降低sTH表達(dá)增加(P<0.01)。結(jié)論 長期使用左旋多巴可以引起α-syn過表達(dá)，進一步加重中腦黑質(zhì)區(qū)的神經(jīng)損傷，造成行為學(xué)癥狀惡化。熟地平顫顆粒結(jié)合左旋多巴治療PD有明顯的增效減毒作用，中藥通過抑制α-syn的過表達(dá)，減少了黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞的損傷，有效緩解了帕金森病癥狀。

帕金森病；熟地平顫顆粒；行為學(xué)；α-突觸核蛋白；增效減毒

帕金森病是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失為病理特點的神經(jīng)退行性疾病，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)最主要的病理學(xué)特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)路易小體(其主要成分是錯誤折疊的α-突觸核蛋白)形成[1]。左旋多巴(levodopa，LD)替代療法可明顯減輕PD病人的臨床癥狀，但在長期應(yīng)用左旋多巴的過程中，異動癥和癥狀波動等運動并發(fā)癥不可避免[2]，這些并發(fā)癥的產(chǎn)生可能與左旋多巴激活α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)過表達(dá)有關(guān)[3]，過表達(dá)的α-syn可促使α-syn形成寡聚體，已有較多的研究證實α-syn寡聚體等中間體和原纖維具有神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。為解決左旋多巴治療的缺陷，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，本實驗觀察熟地平顫顆粒聯(lián)合左旋多巴對PD大鼠行為學(xué)以及α-syn表達(dá)的影響，探討中藥是否通過抑制α-syn的過表達(dá)從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為今后制定有效的PD防治策略提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 熟地平顫顆粒由熟地黃、桑寄生、天麻、僵蠶、葛根、莪術(shù)、丹參、天南星、全蝎、蜈蚣組成，由江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑(批號：1410302)。取熟地平顫顆粒19.2 g(相當(dāng)于成人1 d用量，含生藥128 g)混合后溶于100 mL生理鹽水中，使每毫升含生藥1.28 g。LD粉劑5 g(批號：SLD6382)和芐絲肼粉劑5 g(批號：SL06492)，由美國Sigma公司提供。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠72只，體重180 g～200 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK滬2015-0015。

1.3 主要試劑和儀器 Benserazide hydrochloride，Levodopa，6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO)、5%天竹牡丹，美國Sigma公司產(chǎn)品；Anti-TYH/TH，Rabbit anti-p-ERK1/2，Rabbit anti-Bax，Rabbit anti-Bcl-2(Ser63，Cell Signaling Technology，USA)，TUNEL試劑盒(Roche公司)。SR-6N 型大鼠腦立體定位儀，日本Narishige；Leica組織切片機RM2235，北京中顯鼎盛科技有限公司；Nikon照相機D7000、Nikon顯微鏡E100，尼康儀器(上海)有限公司；冷凍離心機AllegraX-15R，美國Beckman公司。PMR + Q550 病理圖像分析儀，德國Leica公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 PD大鼠模型制備[5]雄性SD大鼠60只，麻醉后固定于大鼠腦立體定向儀上，參照包新民等[6]編著的大鼠腦立體定位圖譜，采用兩點法造模，黑質(zhì)致密部(SNC)：前囟后4.8 mm，矢狀縫右側(cè)2.0 mm；硬膜下8.0 mm；中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)：前囟后4.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.2 mm，硬膜下8.2 mm。牙科鉆打孔，向兩坐標(biāo)點各注射6-OHDA 6 μg注射速度為1 μL/min，留針10 min。術(shù)后14 d應(yīng)用阿撲嗎啡腹腔注射(0.5 mg/kg)，若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7圈/min則視為成功帕金森病模型[7]。正常對照組大鼠模型制備：雄性SD大鼠12只，用上述同樣方法向右側(cè)SNC和VTA分別注射6 μL生理鹽水。

1.4.2 動物分組及給藥 60只大鼠造模后經(jīng)行為學(xué)測試，成功造模的PD模型大鼠36只，隨機分為帕金森病模型組、左旋多巴組、左旋多巴+中藥組，每組12只，另取12只生理鹽水造模大鼠為正常對照組。左旋多巴組予以左旋多巴/芐絲肼治療(20 mg/kg左旋多巴和2.5 mg/mL芐絲肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的消毒生理鹽水中)，每日20 mg/kg，每日2次腹腔注射；左旋多巴+中藥組在左旋多巴組基礎(chǔ)上給予中藥灌胃，每次灌胃量為7.5 mL/kg，每日2次；帕金森病模型組及正常對照組給予相同劑量的生理鹽水灌胃及生理鹽水腹腔注射，療程為4周。本實驗獲得了上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：No.09047)。

1.4.3 行為學(xué)測試方法

1.4.3.1 APO誘導(dǎo)大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為的評定 3組大鼠均腹腔注射APO 0.5 mg/kg以誘發(fā)大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，用鐘式測轉(zhuǎn)儀測量旋轉(zhuǎn)次數(shù)。記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)總的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間[8]。每7 d觀察1次。

1.4.3.2 異常不自主運動(abnormal involuntary movement，AIM)評分測定 左旋多巴組、左旋多巴+中藥組大鼠，每周1次進行AIM評分[9]，腹腔注射左旋多巴/芐絲肼后立即評分，每30 min評定1次，持續(xù)120 min。將AIM分為4個部分(前肢、口面部、軸性及運動)進行評定，每部分又根據(jù)其有或無及嚴(yán)重程度劃分為五個等級(0分～4分)，其中0分：無；1分：偶爾出現(xiàn)；2分：經(jīng)常出現(xiàn)；3分：持續(xù)存在，刺激使之停止；4分：持續(xù)存在，刺激也不能使之停止。理論上1只大鼠1次用藥后的AIM最高評分為64分。

1.4.4 免疫組化檢測黑質(zhì)內(nèi)α-syn、TH的蛋白表達(dá)變化[10]在末次給藥2 h后，每組取6只大鼠用10%水合氯醛麻醉，麻醉后用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流，取出腦組織后置于同一固定液中后固定12 h，取中腦黑質(zhì)腦段經(jīng)脫水、浸蠟、包埋等步驟制成石蠟塊，石蠟塊切片，片厚5 μm。取上述腦組織切片經(jīng)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原后，分別滴加3%過氧化氫和正常山羊血清封閉抗原，滴加一抗(兔抗大鼠α-syn、TH多克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。隨機采集10個高倍鏡視野，HMIAS-2000 高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析檢測陽性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的平均光密度值(OD) 和灰度值，對α-syn、TH表達(dá)產(chǎn)物進行半定量分析。

1.4.5 Real-time PCR檢測大鼠黑質(zhì)α-syn mRNA表達(dá)

1.4.5.1 大鼠腦組織抽提RNA及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取大鼠紋狀體組織50 mg，加入1 mL Trizol液，充分勻漿，22 ℃，靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，顛倒15 s，22 ℃，靜置3 min，4 ℃，14 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL異丙醇，混勻，22 ℃，靜置10 min，：4 ℃，14 000 r/min離心10 min，棄上液，加入1 mL 4 ℃ 75%乙醇， 4 ℃×10 000 r/min離心5 min，棄上液，真空干燥5 min，用40 μL DEPC處理水溶解，-80 ℃保存。引物序列：Rat-α-synuclein-F(gaagacagtggagggagctg)，Rat-α-synuclein-R(ttccaggattccctcttgtg)，產(chǎn)物長度106；PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.4.5.2 RT-PCR數(shù)據(jù)換算方法 目的基因的相對表達(dá)量可以采用??CT法加以分析。通常以正常或陰性作為對照樣本。CT值—n：擴增循環(huán)?CT=目的基因CT-內(nèi)參CT (注：同一反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴增后)；??CT=觀察樣本?CT-對照樣本?CT=(觀察樣本目的基因CT-觀察樣本內(nèi)參CT)-(對照樣本目的基因CT-對照樣本內(nèi)參CT)樣本的相對表達(dá)量=2-??CT。

1.5 統(tǒng)計方法

1.5.1 行為學(xué)統(tǒng)計 使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)多重比較配對的t檢驗法(Bonferroni法)，可進行每個分組每個時間點上作用的兩兩比較；使用多元方差分析的方法，可進行每個時間點上每個分組之間作用的兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較 與治療前(第0天)比較，PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)各期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LD組用藥后第7天、第14天、第21天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)低于治療前(P<0.01)，第28天評分顯著高于治療前(P<0.05)；LD+TCM組用藥后各期的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐步降低(P<0.01)。與同期PD組比較，LD組第7天、第14天、第21天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)低于PD組(P<0.01)，第28天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)高于PD組(P<0.05)；LD +TCM組自第7天起的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著低于同期PD組(P<0.01)。LD +TCM組第7天、第14天、第21天、第28天的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較同期LD組顯著降低(P<0.05)。詳見圖1。

注：與第0天比較，*P<0.05，**P<0.01；與PD 組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與LD組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)比較

2.2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間比較 與治療前(第0天)比較，PD組大鼠第28天旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間較治療前降低(P<0.05)；LD組用藥后第7天、第14天的旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間降低(P<0.05)，第21天開始升高，至第28天評分顯著高于治療前(P<0.05)；LD+TCM組用藥后各期的旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間逐步降低(P<0.05)。與同期PD組比較，LD組第7天、第14天的旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間低于PD組，第28天的評分高于PD組；LD +TCM組自第7天起的旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間低于同期PD組(P<0.01)。LD +TCM組第7天、第14天的旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間較同期LD組顯著降低(P<0.01)。詳見圖2。

注：與第0天比較，*P<0.05，**P<0.01；與PD 組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與LD組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間比較

2.3 兩組大鼠AIM評分比較 與治療第7天比較，LD組大鼠用藥后第14天、第21和第28天的AIM評分逐步增高(P<0.01)，第21天起AIM評分>20分，出現(xiàn)異動癥；LD+TCM組僅用藥后第21天評分較第7天升高(P<0.05)，其余各期均無差異。與同期LD組比較，LD +TCM組大鼠自第7天起的AIM評分值低于同期LD組(P<0.05)。詳見圖3。

注：與第7天比較，*P<0.05，**P<0.01；與LD組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn、TH表達(dá)比較 α-syn免疫組化染色結(jié)果顯示，各組與正常對照組比較，α-syn表達(dá)明顯增加(P<0.01)；LD組較PD組α-syn表達(dá)明顯增加(P<0.01)；LD +TCM組α-syn表達(dá)數(shù)較之LD組明顯下調(diào)(P<0.01)。TH免疫組化染色結(jié)果顯示，各組與正常對照組比較，TH表達(dá)明顯減少(P<0.01)；LD組較PD組TH表達(dá)明顯減少(P<0.01)；LD+TCM組TH表達(dá)數(shù)較之LD組明顯增加(P<0.01)。詳見表1、圖4、圖5。

表1 各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn、TH表達(dá)比較(±s)

注：①為正常對照組；②為PD組；③為LD組；④為LD+TCM組

注：①為正常對照組；②為PD組；③為LD組；④為LD+TCM組。

2.5 各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn mRNA表達(dá)比較 與正常對照組比較，PD組、LD組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn mRNA表達(dá)增高；與PD組比較，LD組α-syn mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與LD組比較，LD+TCM組α-syn mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖6。

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LD組比較，△P<0.05。

圖6 各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討 論

帕金森病是一種常見于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，以選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失、紋狀體多巴胺含量顯著減少為特征[11]。目前，PD的治療主要為以左旋多巴制劑為主的替代療法，但該方法僅能緩解臨床癥狀，并不能阻止或延緩 PD的進程[12]，同時長期使用該法也存在療效衰減及運動障礙等副作用，嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量[13]。因此，阻止或減緩黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性，減少左旋多巴制劑毒副作用對延緩病情的進展具有重要的意義。

PD的發(fā)病原因至今不明，主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失及神經(jīng)元胞質(zhì)中出現(xiàn)大量以α-syn為主要成分的路易小體和路易軸突[14]。最新研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的α-syn可促使α-syn的蛋白結(jié)構(gòu)由α螺旋變換為β折疊二級結(jié)構(gòu)，后者具有很強的聚合傾向[15]。α-syn寡聚體等中間體和原纖維具有神經(jīng)毒性作用，寡聚體可與突觸囊泡結(jié)合并產(chǎn)生小孔，增加囊泡的通透性，引起鈣離子內(nèi)流、多巴胺外漏以及線粒體膜去極化，致使神經(jīng)元死亡[16]。所以，開發(fā)維持α-syn正常構(gòu)象的藥物，防止其發(fā)生錯誤折疊和聚集，就可以達(dá)到阻止疾病進展的目的。中醫(yī)藥雖然不能徹底治愈PD，但長期臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)熟地平顫方在改善運動癥狀尤其是非運動癥狀方面療效顯著，與左旋多巴合用能明顯延緩帕金森病的進展[17]。

我們在長期的臨床實踐中，以滋補肝腎、通絡(luò)解毒立法，形成熟地平顫方，藥物選用熟地、枸杞、桑寄生、白芍、天麻、僵蠶、莪術(shù)、生南星、全蝎、蜈蚣。諸藥合用，共奏滋補肝腎，搜風(fēng)解毒，通絡(luò)散結(jié)之功。前期實驗證實了熟地平顫顆粒通過抑制ERK通路的過度激活、調(diào)控突觸后多巴胺D1、D2受體介導(dǎo)的直接、間接通路之間的失衡狀態(tài)，從而減輕了PD大鼠的異動癥癥狀。本次試驗發(fā)現(xiàn)長期左旋多巴治療會導(dǎo)致PD大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-syn的過表達(dá)，引起TH的進一步減少，導(dǎo)致行為學(xué)癥狀惡化。熟地平顫顆粒能夠明顯抑制黑質(zhì)內(nèi)α-syn的過表達(dá)狀態(tài)，減少了黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞的損傷，有效緩解了帕金森病癥狀。

[1] Recasens A，Dehay B，Bové J，et al.Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys[J].Ann Neurol，2014，75(3)：351-362.

[2] Lipski J，Nistico R，Berretta N，et al.L-DOPA： A scapegoat for accelerated neurodegeneration in Parkinson’s disease[J].Prog Neurobiol，2011，94(4)：389-407.

[3] Ugen KE，Lin X，Bai G，et al.Evaluation of anαsynuclein sensitized dendritic cell based vaccine in atransgenic mousemodel of Parkinson disease[J].Hum VaccinImmunother，2015，11(4)：922-930.

[4] Mollenhauer B，Trautmann E，Otte B，et al.a-Synuclein in human cerebrospinal fluid is principally derived from neurons of the central nervous system[J].J Neural Transm，2012，119(7)：739-746.

[5] 滕龍，洪芳，何建成．陰虛動風(fēng)證帕金森病異動癥模型大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)及復(fù)方地黃方的干預(yù)作用[J].中國實驗動物學(xué)報，2015，23(1)：26-27.

[6] 包新民，舒思云．大鼠腦立體定位圖譜[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：53.

[7] 李丹，黃議腺，王曉軍，等.左旋多巴誘發(fā)異動癥6-羥基多巴帕金森病大鼠模型的建立及行為學(xué)評價[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，30(2)：236-239.

[8] 曹非，駱芳，張磊．帕金森病行為學(xué)和黑質(zhì)形態(tài)學(xué)實驗研究[J]．腦與神經(jīng)疾病雜志，2012，20(5)：375-378.

[9] 曹學(xué)兵，孫圣剛，徐巖等．左旋多巴治療帕金森病誘發(fā)異動癥的實驗研究[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(6)：505-507.

[10] 玉英，陳薇．補腎止顫方聯(lián)合埋針療法對帕金森病模型大鼠 Bcl-2及Bax表達(dá)的影響[J]．中國老年學(xué)雜志，2015，35(5)：1341-1343.

[11] Burguillos MA，Hajji N，Englund E，et al.Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus evidence in Parkinson’s disease patients[J].Neurobiol Dis，2011，41(1)：177-188.

[12] Martinez-Martín P，Rodriguez-Blazquez C，Paz S，et al.Parkinson symptoms and health related quality of life as predictors of costs：a longitudinal observational study with linear mixed model analysis[J].PLoS One，2015，10(12)：e0145310.

[13] Sharma S，Singh S，Sharma V，et al. Neurobiology of l-DOPA induced dyskinesia and the novel therapeutic strategies[J]. Biomed Pharmacother，2015，70：283-293.

[14] Blesa J，Lanciego JL，Obeso JA.Editorial： Parkinson’s disease： cell vulnerability and disease progression[J].Front Neuroanat，2015，9：125.

[15] Jellinger KA.Interaction between pathogenic proteinsin neurodegenerative disorders[J].J Cell Mol Med，2012，16(6)：1166-1183.

[16] Park SM，Kim KS.Proteolyticclearance of extracellular α-synuclein as a new therapeutic approach against Parkinson disease[J].Prion，2013，7(2)：121-126.

[17] 袁燦興，支惠萍，陳順中.熟地平顫湯結(jié)合西醫(yī)常規(guī)療法治療帕金森病的臨床多中心隨機對照研究[J]. 上海中醫(yī)藥雜志，2010，44(6)：3-6.

[18] Ye Q，Yuan XL，Zhou J，et al.Effect of Zishenpingchan granule on neurobehavioral manifestations and the activity and gene expression of striatal dopamine D1 and D2 receptors of rats with levodopa-induced dyskinesiasl[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：342506.

[15] Ye Q，Yuan XL，He J，et al.Anti-apoptotic effect of Shudipingchan granule in the substantia nigra of rat models of Parkinson’s disease[J].Neural Regeneration Research，2016，11(10)：1625-1632.

(本文編輯郭懷印)

Effects of Shudi Pingchan Granule on Behavior and α-synuclein Expression in Rats with Parkinson’s Disease

Ye Qing，Wang Kai，Yuan Xiaolei，He Jing，Zhou Jie，Yuan Canxing

Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China Corresponding Author：Yuan Canxing

Objective To observe the effect of Shudi Pingchan granule (SPG) on behavior and α-synuclein (α-syn) expression in substantia nigra in rats with Parkinson’s disease (PD). Methods The rat model of hemiparkinsonian was established by injecting 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into substantia nigra of right brain. Then，the rats were divided into normal control group，PD group，levodopa (LD) group，and LD plus SPG group. After 4 weeks of treatment，the number of turns，total duration of turning and abnormal involuntary movement (AIM) scores were observed. The gene expression of α-synuclein was detected by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein expression of α-syn and TH was detected by immunohistochemistry. Results The number of turns in PD group had no significant difference compared with that before treatment(P>0.05)，and total duration of turning shortened (P<0.05).The total duration of turning in LD group on the 7th and 14th day were lower than those in PD group in the same time，but they were higher than those in PD group on the 28th day(P<0.05). The number of turns and total duration of turning in LD+TCM group was significantly lower than those of PD group since the 14th day(P<0.05). The AIMs of LD group increased graduallysince the 14th day(P<0.01). The scores of AIM in LD plus SPG group had no difference compared with that before treatment(P>0.05). Compared with normal control group，α-syn mRNA expression increased significantly in PD group.Compared with PD group，α-syn mRNA significantly increased in LD group. The expression of α-syn mRNA in LD plus SPG group decreased obviously compared with LD group (P<0.05). Compared with the normal control group，α-syn expression increased and TH expression reduced in PD group. Compared with PD group，α-syn expression increased and TH expression decreased in LD group. Compared with LD group，α-syn expression decreased and TH expression increased in LD plus SPG group (P<0.01).Conclusion Long-term use of LD can cause over-expression of α-syn and further aggravatenerve damage in midbrain nigra，which makes the behavioral symptoms worse. SPG and LD treating PD has effect on apparente synergia and attenuation. SPG can effectively alleviate the symptoms of PD by inhibiting over-expression of α-syn，reducing the damage of dopaminergic cells.

Parkinson’s disease；Shudi Pingchan granule；behavior；α-synuclein；apparente synergia and attenuation

國家自然科學(xué)基金面上項目(No.81673726)；國家自然科學(xué)基金青年項目(No.81302926)；上海市科委重大項目(No.15401970100)；上海市衛(wèi)計委杏林新星人才計劃項目(No.ZY3-RCPY-2-2005)

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院(上海 200032)；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)

袁燦興，E-mail：ycanxing@hotmail.com

R541.7 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.04.009

1672-1349(2017)04-0419-06

2016-10-16)

引用信息：葉青，王凱，袁曉蕾，等.熟地平顫顆粒對帕金森病大鼠行為學(xué)及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(4)：419-424.