越鞠丸快速改善帕金森病抑郁的機制研究＊

王省，唐娟娟，陳暢，陶偉偉，薛文達，任荔，劉紅權(quán)，郭小燕，陳剛＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院南京210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心南京210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院南京210001）

越鞠丸快速改善帕金森病抑郁的機制研究＊

王省1，2＊＊，唐娟娟2＊＊，陳暢3，陶偉偉2，薛文達2，任荔2，劉紅權(quán)1，郭小燕2，陳剛2＊＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院南京210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心南京210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院南京210001）

目的：本文主要研究越鞠丸快速改善帕金森病抑郁（Depression of Parkinson’s Disease，DPD）的機制。方法：參照文獻DPD亞急性造模方法，通過抑郁行為學(xué)方法如開場實驗（Open Field Test，OFT）、懸尾實驗（Tail Suspension Test，TST）、強迫游泳實驗（Forced Swimming Test，F(xiàn)ST）和糖水偏好實驗（Sucrose Preference Test，SPT）評價越鞠丸快速起效抗抑郁的作用；同時運用PC12細(xì)胞株進行離體實驗，在細(xì)胞水平基于環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPResponse ElementBinding Protein，CREB）信號通路，探討越鞠丸對1-甲基-4-苯基-1, 2,3,6-四氫吡啶離子（MPP+）引起神經(jīng)元損傷的保護作用。結(jié)果：DPD模型小鼠在TST、FST行為測試中，不動時間較正常小鼠明顯延長（P＜0.01），SPT比率明顯下降（P＜0.01）。越鞠丸能夠減少DPD模型小鼠FST的不動時間（P＜0.05），提高SPT比率（P＜0.01），起效時間為單次給藥后的第3天；MPP+處理的PC12細(xì)胞CREB磷酸化水平降低，與模型組比較，越鞠丸可以提高磷酸化CREB表達（P＜0.01）。結(jié)論：越鞠丸能夠快速改DPD，其作用機制與激活CREB信號、保護神經(jīng)元有關(guān)。

越鞠丸快速抗抑郁帕金森病抑郁

帕金森?。≒arkinson’sDisease，PD）是好發(fā)于老年人的神經(jīng)變性病，臨床主要特征為運動障礙，包括：進行性運動遲緩、肌強直、靜止性震顫和姿勢步態(tài)異常等。國外最新流行病學(xué)資料顯示65歲以上老年人PD的發(fā)病率約1.6%[1]。此外，PD還可伴有大量非運動癥狀（Non-Motor Symptoms，NMS），如：嗅覺減退、便秘、抑郁、睡眠障礙等；其中，抑郁是PD最常見的NMS之一。DPD的發(fā)病率文獻報道不一，其平均發(fā)病率達40%[2]。與運動癥狀相比，抑郁障礙某種程度上對PD患者的生活質(zhì)量影響更大。

目前DPD的治療仍以選擇性5羥色胺再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs）類藥物為主，起效緩慢，服用2周以上才能起效[3]，并且與單胺氧化酶抑制劑（Monoamine Oxidase-B Inhibitor，MAO-BI）類抗PD藥物聯(lián)合使用時易產(chǎn)生5羥色胺反應(yīng)綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺受體激動劑普拉克索具有抗抑郁作用[4]，但存在劑量依賴，服用后易躁狂，給患者的經(jīng)濟壓力較大。因此，快速起效且安全的抗抑郁藥物是DPD治療的重點。近年來，對氯胺酮快速持久抗抑郁作用及其相關(guān)機制的研究，已成為目前抑郁癥研究與開發(fā)非?；钴S的領(lǐng)域。臨床證實亞麻醉劑量的氯胺酮有快速（2 h內(nèi)）起效抗抑郁的作用，且單次給藥后，抗抑郁持續(xù)時間長達2周[5,6]。然而，氯胺酮的成癮性、肝毒性、神經(jīng)毒性等副作用限制了其臨床應(yīng)用。前期研究表明，越鞠丸具有快速持久抗抑郁作用，給藥30 min后即可檢測到海馬區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）顯著提高[7,8]。本研究運用PD亞急性抑郁小鼠模型，通過在體及離體研究方式，探索CREB信號通路參與越鞠丸快速抗抑郁的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年的Balb/c雄性小鼠36只，體質(zhì)量18-24 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：2007000581303。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。動物飼養(yǎng)條件：室溫22-25℃，濕度30%-45%，明暗交替時間為12 h，動物自由飲食進水。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞株培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每24 h更換一次，72 h后用0.25%胰酶消化成細(xì)胞懸液，然后接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)。

1.3 實驗材料

實驗用中藥材購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診，經(jīng)本校藥學(xué)院專家鑒定，為《中國藥典》收載品種。越鞠丸方藥制備：蒼術(shù)、香附、神曲、梔子、川芎各取100 g打碎，置入1 L燒杯中，加入1 L 95%乙醇混合均勻，浸泡12 h后靜置1 h，取上層清液，該過程重復(fù)3次。將3次取得的上層清液過濾，再取清夜放入懸蒸中蒸發(fā)至200 mL后放入56℃烘箱中靜置3 h，得醇提越鞠丸（YJ-E），并保存在-80℃冰箱備用。臨用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。蔗糖購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶離子（MPP+，美國Sigma公司，批號：D048）及1-甲基-4-苯基-1,2,3, 6-四氫吡啶（MPTP，美國Sigma公司，批號：M0896）；DMEM高塘培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：8116332）、胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號：1780400）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：16000-044）。兔抗P-CREB抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：9198S），兔抗β-tubulin抗體（美國Proteintech公司，批號：10094-1-AP），HRP標(biāo)記二抗羊抗兔-HRP（美國Proteintech公司，批號：SA00001-2），CREB抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：#9197），ECL顯影液（上海天能科技有限公司，批號：180-5001B/180-5001W）。

1.4 主要儀器

強迫游泳視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件公司），小鼠飼養(yǎng)籠（30 cm×60 cm×30 cm），玻璃燒杯（直徑18 cm×高25 cm），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南鞏義予華儀器設(shè)備有限公司，產(chǎn)品型號：501），1mL注射器（美國BD公司）。

1.5 實驗分組及模型的制備

1.5.1 動物分組

小鼠隨機分為3組，每組各12只。空白對照組（con），DPD模型組（mod），DPD模型+YJ-E給藥組（mod+YJ-E）。越鞠丸灌胃按照13.5 g·kg-1，隔日給藥，共給藥3次。

1.5.2 帕金森病體外實驗分組

參照陳暢等[9]的PD體外模型建模方法，將小鼠分為空白對照組（con，不予任何處理）；MPTP+處理組（mod），MPTP+濃度及持續(xù)時間為1mmol·L-1×24 h；越鞠丸醇提物（YJ-E）處理組，給藥濃度為1mg·mL-1；MPTP+聯(lián)合YJ-E處理組（mod+YJ-E），提前30min給藥，持續(xù)24 h。

1.5.3 動物模型的制備及給藥

參照Zhang等[10]的DPD亞急性模型造模方法，以MPTP 25mg·kg-1，每日進行腹腔注射，連續(xù)7天，抑郁表型造模成功率約66.7%。

1.6 行為學(xué)評價

1.6.1 蔗糖偏好實驗

根據(jù)Dulawa[11]的方法加稍作改變，所有實驗動物在行為測試前給予兩瓶2%蔗糖溶液適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。給予蔗糖溶液前先進行18 h禁水禁食，然后小鼠單籠飼養(yǎng)，每籠給予一瓶2%的蔗糖溶液和一瓶正常飼養(yǎng)用水，測試2 h后，比較各組蔗糖消耗量。蔗糖消耗計算公式為：蔗糖消耗/%=[（蔗糖攝入量）/（水的攝入量+蔗糖攝入量）]×100%。

1.6.2 懸尾實驗

將單個小鼠尾端用膠布粘在懸掛鉤上面，尾尖距膠布約1 cm。小鼠倒掛在通用隔音行為箱內(nèi)，頭部離箱底約20 cm。小鼠懸尾視頻分析系統(tǒng)3.0版（上海吉量軟件公司）記錄6min內(nèi)小鼠的活動情況，前2min為小鼠的懸尾適應(yīng)期，分析后4min內(nèi)小鼠的不動時間[12]。

1.6.3 強迫游泳實驗

采用Porsolt等[13]報道的方法，將小鼠分別放入玻璃燒杯中，水溫保持在24-26℃。讓小鼠在其中游泳2min后，立刻開始觀察記錄接下來4min內(nèi)小鼠總的不動時間。

1.7 Western blot測定CREB和P-CREB表達

收集待測細(xì)胞，4℃離心：1 000 r·min-1×5min；棄上清，于細(xì)胞沉淀中加入50μLRIPA裂解液，冰水環(huán)境下裂解30min；再次4℃離心12 000 r·min-1×10min，取上清。Thermo Nanodrop 2000紫外分光光度計測定蛋白濃度，20μL管分裝，-80℃保存。Bio-Rad系統(tǒng)，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜條件為4℃，300mA，60min，PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗P-CREB抗體（1∶1 000），兔抗β-tubulin抗體（1∶2 000）4℃過夜。TBST（pH=7.5，10mmol·L-1Tris-HCL，150 mmol·L-1NaCl，0.1%Tween-20）漂洗3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記二抗羊抗兔-HRP（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST漂洗3次。同樣方法孵育CREB抗體（1∶1 000）。蛋白膜上滴加ECL顯影液，置于天能（Tanon 5200）全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)內(nèi)顯影分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對多組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗分析，測量結(jié)果以xˉ±s表示，P＜0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帕金森病抑郁的模型評價

與對照組相比，模型組小鼠OFT總里程數(shù)無明顯差異（圖1A），模型組小鼠OFT中央活動時間也無明顯差異（圖1B），排除了焦慮障礙以及因活動障礙導(dǎo)致的對后續(xù)抑郁行為學(xué)影響。在SPT實驗中，與對照組相比，模型組小鼠SPT比值下降（P＜0.01，圖1C）；在TST實驗中，與對照組相比，模型組不動時間明顯延長（P＜0.01，圖1D）；FST實驗顯示，與對照組相比，模型組不動時間明顯延長（P＜0.01，圖1E）。

2.2 越鞠丸對帕金森病抑郁小鼠抑郁樣行為的作用

結(jié)果顯示，在FST行為絕望實驗中（圖2A），越鞠丸間斷給藥3天后，漂浮時間較模型組明顯降低（P＜0.01）；在SPT實驗中（圖2B），與模型組相比，越鞠丸組SPT值明顯升高（P＜0.01）。

2.3 越鞠丸對MPP+離體模型PC12細(xì)胞CREB表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，1mmol·L-1MPP+可明顯降低PC12細(xì)胞P-CREB表達（P＜0.01）。1mg·mL-1YJ-E預(yù)給藥可明顯上調(diào)P-CREB水平（P＜0.01），而對CREB表達無明顯作用。YJ-E對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護作用可能與上調(diào)P-CREB相關(guān)。詳見圖3。

圖1 帕金森病抑郁小鼠行為學(xué)測試結(jié)果

圖2 越鞠丸給藥第3天各組小鼠行為學(xué)測試結(jié)果

圖3 越鞠丸對模型動物CREB的調(diào)節(jié)作用

3 討論

目前DPD的發(fā)病機制仍不明確，目前主要有心理應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)生化學(xué)說。心理應(yīng)激反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為DPD是患者因軀體疾病導(dǎo)致社會功能減退和社會地位下降所產(chǎn)生的情感障礙，是一種繼發(fā)于運動障礙的心因性反應(yīng)。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，DPD的病理生理過程與運動癥狀的病理生理過程并不平行，抑郁的嚴(yán)重程度跟黑質(zhì)、紋狀體神經(jīng)元變性、額葉-紋狀體環(huán)路功能失效和多巴胺的缺失程度相關(guān)[14-17]。因此，DPD有其神經(jīng)遺傳、解剖及生化改變的生物學(xué)基礎(chǔ)。

目前，神經(jīng)可塑性假說獲得更廣泛的認(rèn)同[18]。該假說認(rèn)為抗抑郁治療引起的神經(jīng)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)特定基因，包括由CREB引起的基因表達變化，及相關(guān)的突觸可塑性、神經(jīng)營養(yǎng)因子和海馬神經(jīng)新生等神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的改變是抗抑郁作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。抑郁癥的病理則由情感相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)可塑性對不良適應(yīng)（如：應(yīng)激）造成。根據(jù)該假說，常規(guī)的單胺類抗抑郁藥物實現(xiàn)神經(jīng)可塑性的改善需要長時間的作用，而快速抗抑郁作用是通過迅速改善BDNF、CREB等相關(guān)的神經(jīng)可塑性來實現(xiàn)的[19]。與此相一致，我們發(fā)現(xiàn)越鞠丸可以迅速增強BDNF的表達[20]。后期研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸快速抗抑郁與激活PKA-CREB-BDNF信號通路相關(guān)[21]。

MPP+是MPTP在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，能夠被多巴胺轉(zhuǎn)運體選擇性地攝入黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)，促進活性氧簇ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失，因此被廣泛用于PD離體模型的制備。PC12細(xì)胞能夠表達酪氨酸羥化酶并合成多巴胺，常用作研究多巴胺能神經(jīng)元的工具細(xì)胞。MPP+可顯著抑制PC12細(xì)胞存活，誘導(dǎo)其凋亡[22]。

前期初步研究發(fā)現(xiàn)越鞠丸快速抗抑郁作用不僅與其激活CREB信號及其增強的神經(jīng)可塑性密切相關(guān)，還能快速提高海馬區(qū)垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide，PACAP）的表達。國內(nèi)外關(guān)于PACAP在神經(jīng)精神疾病上的最新研究成果提示，PACAP在調(diào)控應(yīng)激和抑郁情緒障礙發(fā)揮樞紐作用。本研究團隊前期的實驗研究表明經(jīng)MPP+處理的PD離體模型中，PACAP、P-CREB的表達均呈下降趨勢；越鞠丸預(yù)處理的PD離體模型內(nèi)，PACAP、P-CREB均較模型組明顯升高[9]。因此結(jié)合本實驗，PACAP可能是越鞠丸發(fā)揮抗抑郁作用的關(guān)鍵分子。

抑郁共病是目前抑郁癥發(fā)病的常見形式，軀體共病抑郁現(xiàn)象日趨明顯。越鞠丸為金元四大家之一朱丹溪所創(chuàng)，始載于《丹溪心法》，功善行氣解郁，臨床常用于郁證的治療?；诒狙芯繄F隊的前期研究，越鞠丸發(fā)揮快速起效抗抑郁與激活海馬區(qū)PKA-CREB-BDNF信號通路、提高PACAP表達相關(guān)[9,21]。本文成功構(gòu)建了DPD亞急性模型，并進一步在該模型動物上發(fā)現(xiàn)了越鞠丸的快速起效抗抑郁作用，拓寬了越鞠丸的應(yīng)用范圍，為臨床應(yīng)用越鞠丸改善DPD提供了有力證據(jù)。

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TheM echanism Study of the Rapid Antidepressant Effectsof Yueju Pillon Depression of Parkinson’sDisease

Wang Xing1,2,Tang Juanjuan2,Chen Chang3,TaoWeiwei2,XueWenda2,Ren Li2,Liu Hongquan1, Guo Xiaoyan2,Chen Gang2
(1.Affiliated Hospitalof Integrated TraditionalChineseandWestern Medicine, Nanjing University ofChineseMedicine,Nanjing 210028,China; 2.CenterforTranslationalSystemsBiology and Neuroscience,Key Laboratory of IntegrativeMedicinefor Brain Diseases,CollegeofBasicMedicine,Nanjing University ofChineseMedicine,Nanjing 210023,China; 3.The Third Affiliated HospitalofNanjing University ofChineseMedicine,Nanjing 210001,China)

This study aimed atexploring themechanism of the rapid antidepressanteffectsof Yueju pillon depression of Parkinson’s disease(DPD).The fast antidepressant effects of Yueju pill in this study was evaluated by behavior tests, such as open field test(OFT),tail suspension test(TST),forced swimming test(FST)and sucrose preference test(SPT) according to themodelingmethod of subacute DPD in the literature.In vitro experimentwas implemented using PC12 cells.Moreover,the protective effects of Yueju pillon 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+)induced neural injurywith the engagement of cAMP response element binding protein(CREB)were expounded.As a result,itwas found that the immobility time of themice in themodel group was significantly longer than that in the normal group in TST and FST tests(P＜0.01),and the SPT ratio of mice in the model group remarkably decreased(P＜0.01).In addition,the immobility time of DPDmicewas shortened in the FST testafter administering Yueju pill(P＜0.05),while the SPT ratio was increased(P＜0.01).Yueju pill took the effectson the third day after a single administration.The phosphorylation of CREB(p-CREB)in MPP+induced PC12 cellswas decreased in comparison with themodel group,while the expression ofp-CREBwas up-regulated with the administration of Yueju pill(P＜0.01).In conclusion,DPDwas quicklymitigated after the treatment of Yueju pill,the activation of CREB signaling pathway and its neuroprotective effectsmay be the mechanism behind it.

Yueju pill,rapid antidepression,depression of Parkinson’sdisease

10.11842/wst.2017.02.016

R2-03

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-24

修回日期：2017-01-02

＊國家自然科學(xué)基金委面上項目（81673625）：基于PACAP-CREB信號通路的越鞠丸快速抗抑郁機制研究，負(fù)責(zé)人：陳剛。

＊＊王省與唐娟娟為共同第一作者。

＊＊＊通訊作者：陳剛，教授，主要研究方向：中醫(yī)藥快速抗抑郁的機制和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。