線粒體DNA D-環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤患者預后的關系研究

趙桂敏，劉麗宏，高玉環(huán)，吳曉琳，高 哲，刁蘭萍

·論著·

線粒體DNA D-環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤患者預后的關系研究

趙桂敏，劉麗宏，高玉環(huán)，吳曉琳，高 哲，刁蘭萍*

背景 線粒體DNA(mtDNA)D-環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的積累可能與患癌風險和疾病預后有關。目的 探討mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP與非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者預后的關系。方法 選取2000—2007年河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液科接受治療的NHL患者190例(NHL組)，其中彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)108例(DLBCL亞組)，T細胞淋巴瘤(TCL)82例(TCL亞組)；同時收集體檢健康者159例為對照組。記錄NHL組患者性別、年齡、Ann Arbor分期、病理類型(B細胞型、T細胞型)、有無B癥狀、乳酸脫氫酶(LDH)水平、國際預后指數(shù)(IPI)，檢測NHL組與對照組mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP。NHL患者預后采用多因素Cox比例風險回歸模型進行分析。結果 不同Ann Arbor分期、病理類型、有無B癥狀、不同LDH、IPI NHL患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組與DLBCL亞組患者73、200、315位點等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組與TCL亞組患者73、16362、249、315位點等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同146、199、309、315、16304位點等位基因頻率NHL患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多因素Cox比例風險回歸模型結果顯示，年齡〔HR=2.104,95%CI(1.095,4.403)〕、IPI〔HR=1.827,95%CI(1.098,3.034)〕、16304位點〔HR=0.523,95%CI(0.276,0.889)〕與NHL患者預后有回歸關系(P<0.05)。結論 mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP 16304位點與NHL患者預后相關，可通過檢測mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP 16304位點預測NHL患者預后。

淋巴瘤,非霍奇金；DNA,線粒體；多態(tài)性,單核苷酸；預后

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是第5位最常見的腫瘤[1]，2003—2007年我國NHL占所有腫瘤相關死亡的2.15%[2]。目前認為，免疫相關因素、家族血液腫瘤組織學、體質(zhì)指數(shù)與患癌風險有關[3-4]。氧化應激通路基因多態(tài)性也被確定與NHL的風險有關[5-6]。罹患腫瘤的風險與氧化應激增加,從而導致DNA損傷有關[7]。雖然NHL可以治愈，但仍有部分患者常規(guī)化療后未能達到完全緩解[8]。目前常用預后指數(shù)如國際預后指數(shù)(IPI)、濾泡IPI(FIPI)等不能準確預測預后[1]。許多腫瘤標志物已確定為NHL的預測因子，但很少應用在臨床常規(guī)檢查[9]。

人類線粒體基因組是一個16 kb閉環(huán)雙分子，包含37個基因，其中包括兩個核糖體RNA和一套完整的22個轉移RNA[10]。線粒體DNA(mtDNA)與核DNA相比更容易受到損傷和突變，歸因于其高濃度的活性氧(ROS)、缺乏保護組蛋白和mtDNA修復能力有限[11]。體細胞mtDNA突變與各種退行性疾病和腫瘤有關[12]，在許多腫瘤中，體細胞mtDNA突變和多態(tài)性位于一個所謂mtDNA D-環(huán)區(qū)非編碼區(qū)[13]。這個部位重要的作用是調(diào)控mtDNA的復制和表達，因為其包含復制的前導鏈起源和轉錄的主要啟動子[14]。腫瘤患者D-環(huán)區(qū)序列發(fā)生變化已被廣泛研究[15]，但只有少數(shù)單核苷酸多態(tài)性(SNP)被選定可預測腫瘤的風險，而且其預測價值仍不明確[16]。D-環(huán)區(qū)包含1個1 122 bp長度的核苷酸(核苷酸16024～16569 和1～576)。本研究檢測NHL患者mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP，并評估其對NHL預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2000—2007年河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液科接受治療的NHL患者190例為NHL組，其中男121例，女69例；年齡32～74歲，平均年齡(57.6±9.2)歲；彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)108例(DLBCL亞組)，T細胞淋巴瘤(TCL)82例(TCL亞組)。同時收集體檢健康者159例為對照組，其中男86例，女73例；年齡20～73歲，平均年齡(58.7±10.0)歲。本研究獲得河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院人體組織研究委員會的監(jiān)督和批準，受試者入組前均獲得知情同意。

本研究背景：

淋巴瘤是原發(fā)于淋巴結和結外淋巴組織的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，淋巴瘤的治療模式已經(jīng)從單純的放化療進入靶向藥物治療的時代，隨著單克隆抗體藥物(如針對抗CD20的利妥昔單抗)的應用，使彌漫大B細胞淋巴瘤等B細胞淋巴瘤的緩解率明顯提高，但仍有部分患者緩解率低或緩解后短期復發(fā)。對于T細胞淋巴瘤，目前臨床尚無特異性靶向藥物應用，預后較B細胞淋巴瘤差。對于彌漫大B細胞淋巴瘤及外周T細胞淋巴瘤兩種最常見類型淋巴瘤，目前采用國際預后指數(shù)(IPI)來評價疾病預后，即年齡>60歲、Ann Arbor分期Ⅲ/Ⅳ期、結外病變>1處、乳酸脫氫酶(LDH)水平升高、行為狀態(tài)ECOG評分≥2分，是5個不良的IPI指標，評分越高，預后越差，但臨床實踐證明，IPI不能準確預測預后，尤其是“利妥昔單抗時代”。近年來，通過對線粒體DNA(mtDNA)功能的普遍認識及與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關研究的逐漸豐富，發(fā)現(xiàn)mtDNA單核苷酸多態(tài)性(SNP)與淋巴瘤預后相關。因此有關mtDNA SNP與淋巴瘤預后的研究可以從基因水平提供思路，來尋找新的可能影響預后的標志，以便更好評價預后、尋求新的治療手段。

1.2 觀察指標 記錄NHL組患者性別、年齡、Ann Arbor分期、病理類型(B細胞型、T細胞型)、有無B癥狀(發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量減輕)、乳酸脫氫酶(LDH，速率法L→P，參考范圍120～250 U/L)、IPI(0或1為低危、2為低中危、3為中高危、4或5為高危)[1]。檢測NHL組與對照組mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP。

1.3 樣本采集 入院后空腹采集肘靜脈血5 ml，置于試管〔乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝〕，放置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將血標本倒入離心管中，加入蒸餾水至45 ml，吹打混勻，將離心管置于離心機，2 500 r/min離心15 min(離心半徑20 cm)。取出離心管，棄去上清液，加入少量0.1% Triton-X，用吸管進行吹打混勻，后加0.1% Triton-X至45 ml，再次將離心管置于離心機，2 500 r/min離心15 min(離心半徑20 cm)。棄上清液，可見沉淀物，此為白細胞。

1.4 基因組DNA提取 加入3 ml DNA提取液，吹打混勻，加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)150 ml，微振，再加入400 μl PK液，微振，水浴過夜。加入5 mol/L氯化鈉溶液(NaCl)1 200 μl，2 500 r/min離心15 min(離心半徑20 cm)。倒上清液入已裝有8 ml的無水乙醇的玻璃瓶中，數(shù)秒后看到DNA絮狀物析出。將絮狀物(即DNA)析出完全，將其移至1.5 ml的經(jīng)高壓滅菌的EP管中(已盛有70%乙醇溶液1 ml)。12 000 r/min離心5 min(離心半徑20 cm)，棄乙醇溶液，倒置EP管，晾干。

1.5 聚合酶鏈式反應(PCR) 根據(jù)引物合成的Tm值，尋找退火溫度的范圍，浮動范圍不超過10 ℃，設多個溫度梯度，調(diào)整Taq DNA聚合酶、上下游引物和DNA模板劑量，經(jīng)多次預實驗，最后經(jīng)凝膠電泳，選擇條帶最明亮，無非特異擴增條帶時的體系為最佳反應條件。試劑采用PCR無色體系預混試劑盒(美國Promega公司)，本實驗反應體系為50 μl，組成如下：Master Mix 25 μl，Primer F 2.5 μl，Primer R 2.5 μl，Template DNA 2 μl，Water 18 μl。反應條件:95 ℃ 5 min解鏈→(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×40個循環(huán)→72 ℃ 5 min延伸?；蚪MDNA使用向?qū)Щ蚪MDNA提取工具立即提取(Promega,Madison,WI)并存儲在-20 ℃冰箱。利用上游引物5′-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3′(核苷酸16190～16209)和下游引物5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′(核苷酸602～583)從mtDNA D-環(huán)區(qū)擴增成一個982 bp產(chǎn)物。PCR按照PCR混合試劑盒協(xié)議進行測序前純化。用染料終結者循環(huán)測序反應試劑盒進行循環(huán)測序，然后把產(chǎn)物置于ABIPRISM基因分析儀3100上分離(Applied Biosystem)。通過反復分析兩鏈多態(tài)性被證實。

1.6 隨訪 電話隨訪截至2012-10-01，隨訪時間3～60個月，主要終點事件為死亡。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，不同臨床病理特征患者5年生存率比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗；采用多因素Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，以風險比(HR值)及其95%CI表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床病理特征NHL患者5年生存率比較 不同性別、年齡NHL患者5年生存率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同Ann Arbor分期、病理類型、有無B癥狀、不同LDH、IPI NHL患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 不同臨床病理特征NHL患者5年生存率比較(%)

Table 1 Comparison of five-year survival rates of NHL patients with different clinicopathological features

臨床病理特征例數(shù)5年生存率χ2值P值性別03870581 男121369 女69351年齡(歲)19010156 ≤60106422 >6084225AnnArbor分期(期)23262<0001 Ⅰ～Ⅱ50508 Ⅲ～Ⅳ140155病理類型73820005 B細胞型108504 T細胞型82337B癥狀109310001 無79589 有111333LDH27946<0001 正常123581 升高67182IPI33951<0001 0～2133494 3～55750

注：LDH=乳酸脫氫酶，IPI=國際預后指數(shù)

2.2 對照組與DLBCL、TCL亞組患者SNP位點等位基因頻率比較 從對照組和NHL組患者血液樣本的982 bp mtDNA D-環(huán)區(qū)檢測到140個位點存在SNP，其中26個位點微小等位基因頻率高于5%。對照組與DLBCL亞組患者73、200、315位點等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。對照組與TCL亞組患者73、16362、249、315位點等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.3 不同SNP位點等位基因頻率NHL患者5年生存率比較 26個SNP位點在序列數(shù)據(jù)中均檢測到同質(zhì)的單峰值，預后與加入?yún)⒖假Y源庫AC_000021 26個SNP之間的關系被檢測。依據(jù)每個SNP位點的等位基因?qū)HL患者分為兩組,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。不同146、199、309、315、16304位點等位基因頻率NHL患者5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1、表4)。

表2 對照組與DLBCL亞組患者SNP位點等位基因頻率比較〔n(%)〕

注：DLBCL=彌漫大B細胞淋巴瘤

表3 對照組與TCL亞組患者SNP位點等位基因頻率比較〔n(%)〕

注：TCL= T細胞淋巴瘤

圖1 不同SNP位點NHL患者生存曲線

Table 4 Comparison of five-year survival rates of NHL patients with different SNP sites allele frequencies

位點例數(shù)5年生存率χ2值P值14639360047 C23548 T1677719961390013 C17501 T1739630964910011 C插入a11179 C7920231554930019 C插入b179141 C1101630466760010 C270 T163155

注：a包括1 C、2 C、3 C插入，b包括 1 C、2 C插入

2.4 多因素Cox比例風險回歸分析 以NHL患者預后(賦值：生存=0，死亡=1)為因變量，以性別(男=0，女=1)、年齡(≤60歲=0，>60歲=1)、Ann Arbor分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、病理類型(B細胞型=0，T細胞型=1)、B癥狀(無=0，有=1)、LDH(正常=0，升高=1)、IPI(0～2=0，3～5=1)、146位點(C=0，T=1)、199位點(C=0，T=1)、309位點(C插入=0，C=1)、315位點(C插入=0，C=1)、16304位點(C=0，T=1)為自變量，代入多因素Cox比例風險回歸模型，結果顯示，年齡、IPI、16304位點與NHL患者預后有回歸關系(P<0.05，見表5)。

表5 NHL患者預后影響因素的多因素Cox比例風險回歸分析

Table 5 Multivariate Cox proportional hazards regression analysis of prognostic factors in NHL patients

變量βSEWaldχ2值HR值95%CIP值性別0133018903211211(0529，2791)0560年齡0744033350132104(1095，4403)0024AnnArbor分期1253069932151759(0949，3266)0075病理類型0306021515210624(0104，1072)0193B癥狀0377043123442063(0774，5047)0118LDH0382050425742041(0785，5374)0125IPI0625026149161827(1098，3034)0026146位點0126020803641262(0568，2788)0540199位點0196032508031578(0644，3866)0330309位點0336025416040724(0457，1164)0184315位點0389054725692163(0807，5513)010616304位點0532040539360523(0276，0889)0044

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同性別、年齡NHL患者5年生存率無明顯差異，提示性別、年齡與NHL預后無關。但不同Ann Arbor分期、病理類型、有無B癥狀、不同LDH、IPI NHL患者5年生存率差別較大，提示分期晚、T細胞型、有B癥狀、LDH水平升高、高IPI為NHL患者不良預后的因素。既往研究在某些腫瘤中已經(jīng)確定了與腫瘤風險和預后相關的mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP[17]。本研究通過檢測mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP，以評估其預測NHL風險的能力。對照組與NHL患者比較73 A、315 C等位基因頻率增高，提示核苷酸微小等位基因73、315位點與NHL風險降低有關，這表明攜帶這些等位基因可抵抗患NHL風險。對照組與DLBCL亞組患者比較200 G等位基因頻率明顯減低，提示200位點特異性與DLBCL的風險增加有關。對照組與TCL亞組患者比較16362 C、249 Del等位基因頻率增高，提示16362、249位點特異性與TCL的風險降低相關。mtDNA復制和表達受mtDNA D-環(huán)區(qū)調(diào)控，因為其是復制起始位點。D-環(huán)區(qū)轉錄調(diào)控區(qū)SNP如何增加腫瘤風險的真正機制仍然未知，這個區(qū)域的SNP可能影響mtDNA復制，導致電子傳遞鏈的改變，這引起高ROS釋放和核基因組損傷以及腫瘤發(fā)生和發(fā)展[18]。

本研究進一步選擇mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP評估其預測NHL患者預后能力。不同146、199、309、315、16304位點等位基因頻率NHL患者5年生存率有明顯差異，提示mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP影響NHL患者預后。進一步進行多因素Cox比例風險回歸分析，結果顯示年齡、IPI、16304位點為NHL患者的獨立預后影響因素。單因素分析患者年齡與NHL預后無關，可能是因為一部分年輕患者為侵襲性更高的TCL，從而影響NHL患者生存率，多因素分析提示年齡與NHL預后有關，年齡越大預后越差。IPI作為NHL常用預后指數(shù)，目前廣泛應用于臨床，本研究也進一步驗證了IPI與預后相關。同時發(fā)現(xiàn)新的預后因素16304位點，但尚需在臨床實踐中進一步驗證。研究顯示，16304位點SNP，食管鱗癌發(fā)生體細胞突變[19]，16304位點SNP屬于控制16192-16270-16304-150區(qū)域主題區(qū)分線粒體單倍型U5亞型[20]。不同mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP位點似乎表現(xiàn)出獨特的致癌作用和腫瘤預后，這種現(xiàn)象也在肝細胞癌和非小細胞肺癌觀察到，每種腫瘤與預后和腫瘤風險相關的SNP是不同的[21]。與腫瘤風險及預后相關的SNP位點均位于高變區(qū)(HV)，生殖系突變熱點和腫瘤mtDNA優(yōu)先發(fā)生突變[22]。核苷酸16362、16304位點屬于HV-Ⅰ而其他屬于HV-Ⅱ。HV的功能性意義尚不清楚，但是其對腫瘤發(fā)展起重要作用。

總之，mtDNA D-環(huán)區(qū)SNP與NHL患癌風險及預后有關，通過分析D-環(huán)區(qū)SNP可能有助于識別發(fā)展為NHL風險較高及高危預后的患者亞組，從而有助于改善這些患者的治療決策。

作者貢獻：趙桂敏進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，進行結果的分析與解釋，撰寫論文；吳曉琳進行數(shù)據(jù)收集、整理；高哲進行統(tǒng)計學處理；劉麗宏、刁蘭萍負責論文的修訂；高玉環(huán)負責文章的質(zhì)量控制及審校；刁蘭萍對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Single Nucleotide Polymorphisms in the D-Loop Region of Mitochondrial DNA and Prognosis of Non-Hodgkin Lymphoma Patients

ZHAOGui-min,LIULi-hong,GAOYu-huan,WUXiao-lin,GAOZhe,DIAOLan-ping*

DepartmentofHematology，F(xiàn)ourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhang050000,China

*Correspondingauthor：DIAOLan-ping，Chiefphysician；E-mail:diaolanping@163.com

Background Accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNP) in the displacement loop (D-Loop) of mitochondrial DNA (mtDNA) might be associated with cancer risk and disease prognosis.Objective To discuss the relationship between the prognosis of non-Hodgkin lymphoma (NHL) patients and the SNP in D-Loop of mtDNA.Methods We enrolled 190 NHL patients(NHL group) who received treatment in Department of Hematology,Fourth Hospital of Hebei Medical University from 2000 to 2007,including 108 diagnosed with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL),the DLBCL subgroup,and 82 with T-cell lymphoma (TCL),the TCL subgroup.At the same time 159 healthy controls undergoing physical examination in the hospital during the same period were selected as the control group.The patient′s gender,age,Ann Arbor staging,type of pathology (B-cell type,T-cell type),B symptoms,lactate dehydrogenase (LDH) levels,and value of international prognostic index (IPI) in NHL group were recorded.The SNP in D-Loop of mtDNA in NHL group and control group were detected.The prognosis of NHL patients was analyzed by using a Cox proportional hazard regression model.Results The differences in 5-year survival rate among different Ann Arbor staging,type of pathology,B symptoms,LDH levels and value of IPI in NHL patients were statistically significant(P<0.05).The differences in 73,200 and 315 sites allele frequencies between the control group and the DLBCL subgroup were statistically significant (P<0.05).The differences in 73,16362,249,315 sites alleles frequencies between the control group and the TCL subgroup were statistically significant (P<0.05).The differences in 5-year survival rate among different 146,199,309,315 and 16304 sites allele frequencies in NHL patients were statistically significant (P<0.05).Multivariate Cox proportional hazards regression analysis showed that age〔HR=2.104,95%CI(1.095,4.403)〕,value of IPI〔HR=1.827,95%CI(1.098,3.034)〕,and 16304 site〔HR=0.523,95%CI(0.276,0.889)〕 were significantly associated with the prognosis of NHL patients (P<0.05).Conclusion The 16304 SNP site in D-Loop of mtDNA is associated with the prognosis of NHL patients,which can be used to predict the prognosis of NHL patients.

Lymphoma,non-Hodgkin；DNA,mitochondrial；Polymorphism,single nucleotide；Prognosis

河北省科技支撐計劃資助項目(135200)

R 733.41

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.11.012

2016-08-18；

2017-01-20)

050000河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液科

*通信作者：刁蘭萍，主任醫(yī)師；E-mail:diaolanping@163.com

趙桂敏，劉麗宏，高玉環(huán)，等.線粒體DNA D-環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤患者預后的關系研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(11)：1335-1340.[www.chinagp.net]

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