類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表達(dá)水平及臨床意義①

陳棲棲 田 娟 張 晶 蘇 江

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都610072)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表達(dá)水平及臨床意義①

陳棲棲 田 娟 張 晶 蘇 江

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都610072)

目的：通過研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清IL-37和可溶性PD-1分子的表達(dá)水平，初步探討其與RA的相關(guān)性以及臨床意義。方法：收集RA患者及對(duì)照組人群的外周血，然后采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)30例RA患者(RA標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分≥6)和30名健康對(duì)照組血清中IL-37、sPD-1的表達(dá)水平，結(jié)合分析兩組人群外周血IL-18、IL-6和IL-18BP三種細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過Pearson相關(guān)分析其相關(guān)性。結(jié)果：經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RA組患者外周血中IL-37和sPD-1以及其他幾種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組(P<0.05)；且IL-37與細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6均呈正相關(guān)，sPD-1僅與細(xì)胞因子IL-6呈正相關(guān)，IL-37、sPD-1均與患者病情程度評(píng)分呈正相關(guān)。結(jié)論：IL-37、sPD-1在RA患者中表達(dá)水平升高，且與其他炎性細(xì)胞因子及疾病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，兩者在RA的進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為今后RA治療提供新的依據(jù)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； 白介素-37； 可溶性PD-1； 細(xì)胞因子

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥的自身免疫疾病[1]。主要臨床表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱性。多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變，是我國(guó)最為常見的風(fēng)濕病之一，患病率約為0.4%[2]。白細(xì)胞介素-37(Interleukin-37,IL-37),歸屬IL-1家族，屬于一類抗炎性的細(xì)胞因子，其在機(jī)體自身免疫疾病中能起到保護(hù)作用，主要機(jī)制是抑制過度的炎癥反應(yīng)[3]?？扇苄訮D-1(soluble PD-1,sPD-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)協(xié)同刺激分子。研究表明可溶性協(xié)同刺激分子參與血液循環(huán)，并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，目前國(guó)內(nèi)對(duì)其在自身免疫性疾病中的研究較少[4]。我們通過檢測(cè)和比較RA患者及健康對(duì)照人群血清中IL-37、sPD-1的表達(dá)水平，結(jié)合分析兩組人群外周血IL-18、IL-6和IL-18BP三種細(xì)胞因子的表達(dá)，探討IL-37、sPD-1與RA的相關(guān)性及其臨床意義，為臨床治療RA提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 RA組 依據(jù)歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會(huì)(EULAR)和美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院(ACR)在2010年聯(lián)合修改制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即通過評(píng)估患者其得分≥6分者，即可診斷為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，選取2014年1月～2015年1月在本院住院及門診確診的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者30例。其中男16例，女性14例，平均年齡(48.94±5.1)歲。所有患者均無系統(tǒng)性紅斑狼瘡，無感染性疾病，無急慢性疾病史。

1.1.2 對(duì)照組 隨機(jī)選擇在本院體檢中心進(jìn)行健康體檢的30名健康者作為對(duì)照組，其中男性健康體檢者12例，女性健康體檢者18例，平均年齡(50.34±7.1)歲。且該組除無類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外，在研究對(duì)象的年齡、性別、其他基礎(chǔ)疾病等方面均與RA組具有可比性，且兩組在上述各方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 病例組與對(duì)照組在采血前空腹12 h，采集外周靜脈血2 ml靜置半小時(shí)后采用離心機(jī)進(jìn)行離心(2 000 r/min離心5 min)，離心后用抗凝素管收集上層血漿，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法 運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)IL-37、sPD-1、IL-18、IL-6和IL-18BP等細(xì)胞因子表達(dá)情況，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。直線回歸方程的計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用回歸方程根據(jù)樣品的A值，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。每個(gè)標(biāo)本均需重復(fù)測(cè)量3次，以減少誤差。儀器為ELX800酶標(biāo)儀，由美國(guó)BioTech公司生產(chǎn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清IL-37和sPD-1分子的表達(dá)水平 經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA組患者血清中IL-37和sPD-1的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

2.2 RA相關(guān)細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6分子的表達(dá)水平 經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA組患者血清中3種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 IL-37、sPD-1與3種細(xì)胞因子相關(guān)性分析 經(jīng)相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-37與細(xì)胞因子IL-18(r=0.928，P=0.004)、IL-18BP(r=0.931，P=0.002)、IL-6(r=0.851，P=0.010)均呈正相關(guān)；sPD-1僅與細(xì)胞因子IL-6呈正相關(guān)(r=0.881，P=0.010)，見表2。

2.4 RA與血清IL-37、sPD-1相關(guān)性分析 對(duì)按照ACR及EULAP聯(lián)合制定的RA評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表3)所獲得的患者評(píng)分與RA患者血清中IL-37、sPD-1水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清IL-37與患者病情程度評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.863，P=0.004)，sPD-1與患者病情程度評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.939，P=0.001)，見表4。

圖1 兩組血清IL-37分子的表達(dá)水平Fig.1 Expression of serum IL-37 in two groupsNote: Significantly different from group HC,*.P<0.05.

圖2 兩組血清sPD-1分子的表達(dá)水平Fig.2 Expression of serum sPD-1 in two groupsNote: Significantly different from group HC,*.P<0.05.

GroupsnIL-18(pg/ml)IL-18BP(pg/ml)IL-6(pg/ml)HCgroup3062.34±7.72210.51±24.063.60±0.31RAgroup30140.55±17.431)304.32±29.241)8.14±0.431)t15.0313.5646.90P<0.001<0.001<0.001

Note：Significantly different from group HC,1)P<0.05.

表2 IL-37、sPD-1與細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6相關(guān)性分析

Tab.2 Correlation between IL-37,sPD-1 expression level and serum IL-8,IL-18BP,IL-6

IL-37IL-18IL-18BPIL-6sPD-1IL-18IL-18BPIL-6r0.9280.9310.8510.0620.0120.881P0.0040.0020.0100.6390.9260.010

表3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Tab.3 Diagnostic criteria for rheumatoid arthritis

ClinicalpresentationtypeStandardofthescoresInvolvedjoints0point:(1medium/largejoint);1point:(2-10medium/largejoints);2points:(1-3smalljoints);3points:(4-10smalljoints);5points:(10smalljointsabove)Serologicalindicators0point:(Anti-cycliccitrullinatedpeptideantibodyandrheumatoidfactornegative);2points:(Anti-cy-cliccitrullinatedpeptideantibodiesandrheumatoidfactordetection,oneofwhichislowpositive);3points:(Anti-cycliccitrullinatedpeptideantibodyandrheumatoidfactordetection,atleastoneofwhichishightiterpositive)Synovitisduration0point:(<6weeks);1point:(≥6weeks)Acutephasereactants0point:(ErythrocytesedimentationrateandC-reactiveproteintestresultsarenormal);1point:(ESRorC-reactiveproteinisabnormal)

表4 患者血清IL-37、sPD-1水平與RA評(píng)分相關(guān)性分析

Tab.4 Correlation between IL-13,sPD-1 expression level and RA score

IL-37sPD-1r0.8630.939P0.0040.001

3 討論

RA是一種自身免疫系統(tǒng)疾病，主要病理表現(xiàn)為慢性血管炎和滑膜炎，嚴(yán)重?fù)p害患者關(guān)節(jié)腔血供，目前其病因?qū)W機(jī)制尚不明確，主要病理表現(xiàn)為慢性血管炎和滑膜炎[5]。RA患者滑膜組織中存在眾多巨噬細(xì)胞及其分泌的IL-1、TNF-α、TNF-β等細(xì)胞因子。越來越多的研究表明這些細(xì)胞因子在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了不可或缺的作用[6-9]。IL-37是IL-1家族的新成員，具有抑制先天性炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用[10]。IL-37在正常機(jī)體組織中的表達(dá)較少，但在發(fā)生炎癥的組織中高表達(dá)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)IL-37表達(dá)水平較高。本次實(shí)驗(yàn)亦觀察到RA組患者外周血中IL-37的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組。提示IL-37同RA的發(fā)生具有一定相關(guān)性。

由于IL-37發(fā)現(xiàn)時(shí)間較晚，其抑制機(jī)制的研究尚處于初級(jí)階段，但受到越來越多學(xué)者的關(guān)注，力圖尋找其在自身免疫性疾病治療中的作用。研究表明[11]，細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP和IL-6均參與了RA的疾病進(jìn)程，且IL-37與這幾種細(xì)胞因子具有相關(guān)性。IL-18是IL-1家族中一類致炎性細(xì)胞因子，其在促進(jìn)NK細(xì)胞活性及Th1類炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。IL-37通過與IL-18BP結(jié)合形成的復(fù)合物增強(qiáng)了抑制IL-18誘導(dǎo)生成IFN-γ的能力。IL-6在RA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12,13]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA組患者外周血中IL-37以及其他幾種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-18、IL-18BP、IL-6的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組；且IL-37與IL-18、IL-18BP、IL-6均呈正相關(guān)。另外，通過與RA患者疾病程度的評(píng)分的相關(guān)性研究，亦證實(shí)了IL-37與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致[14]。提示IL-37作為炎癥抑制因子因受炎癥因子刺激而代償性增加，參與了RA的病程發(fā)展，并且IL-37與炎性相關(guān)因子之間相互影響。

雖然，目前RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[15-17],RA是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，在RA免疫病理過程中，T淋巴細(xì)胞的過度活化起著重要作用。目前研究表明[18,19]，功能異常的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫損傷與RA密切相關(guān)，RA病程中T淋巴細(xì)胞的過度活化是其中一個(gè)環(huán)節(jié)。T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)，其中第二信號(hào)需由T細(xì)胞和APC間協(xié)同刺激分子的相互作用啟動(dòng)。而新近發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子PD-1在自身免疫反應(yīng)疾病中，起到保護(hù)機(jī)體的作用，其表達(dá)可緩解促炎癥T細(xì)胞在自身免疫反應(yīng)疾病中的過度反應(yīng)，減緩其對(duì)人體自身組織細(xì)胞的傷害。Wan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，sPD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清、滑膜液中的表達(dá)水平顯著升高。本次研究發(fā)現(xiàn)，RA組患者外周血中sPD-1的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，且sPD-1與患者病情程度評(píng)分呈正相關(guān)，但其與IL-18、IL-18BP、IL-6三種細(xì)胞因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除IL-6細(xì)胞因子外，均無相關(guān)性。提示sPD-1在RA的免疫病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，這為進(jìn)一步研究sPD-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程中的作用和意義提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，健康人體內(nèi)IL-37、sPD-1表達(dá)較少，而在RA患者中表達(dá)水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。IL-37與其他炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-18、IL-18BP具有相關(guān)性。兩者在RA的進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。RA患者體內(nèi)，炎性因子之間形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，作用機(jī)制亦較為復(fù)雜，通過對(duì)這些因子的檢測(cè)可初步評(píng)估RA患者體內(nèi)免疫功能，對(duì)預(yù)后做出判斷，也為今后RA治療提供新的依據(jù)。

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[收稿2016-08-05 修回2016-08-26]

(編輯 倪 鵬)

Expression and clinical significance of serum IL-37 and soluble PD-1 in patients with rheumatoid arthritis

CHENXi-Xi，TIANJuan，ZHANGJing，SUJiang.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital，Chengdu610072，China

Objective:To investigate the relationship between IL-37 and soluble PD-1 in patients with rheumatoid arthritis (RA), and investigate the relationship between IL-37 and soluble PD-1.Methods: Peripheral blood was collected from RA patients and control group.The levels of IL-37 and sPD-1 in 30 RA patients (RA standard score ≥ 6) and 30 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression of IL-18, IL-6 and IL-18BP in the peripheral blood of two groups was analyzed and the correlation was analyzed by Pearson correlation analysis.Results: The results of ELISA detection showed that the expression levels of IL-37 and sPD-1 in the peripheral blood of patients with RA and other inflammatory cytokines such as IL-18, IL-18BP and IL-6 were higher than those of healthy controls (P<0.05).IL-37 was positively correlated with cytokines IL-18, IL-18BP and IL-6；sPD-1 was positively correlated with cytokine IL-6.IL-37 and sPD-1 were positively correlated with the severity of patients.Conclusion: IL-37 and sPD-1 are elevated in RA patients and associated with other inflammatory cytokines and disease severity.Both of them may play an important regulatory role in the progress of RA, and provide a new basis for future RA therapy.

Rheumatoid arthritis;Interleukin-37;Soluble PD-1;Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.022

①本文受四川省衛(wèi)計(jì)委科研課題資助(No.120071)。

陳棲棲(1980年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫方面研究，E-mail：44475135@qq.com。

R593.22

A

1000-484X(2017)03-0422-04