免疫抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2表達(dá)的影響

毛亞男 王 雯 王 東 張 波

(安徽醫(yī)科大學(xué),合肥230032)

免疫抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2表達(dá)的影響

毛亞男 王 雯①王 東①?gòu)?波

(安徽醫(yī)科大學(xué),合肥230032)

目的：研究地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2受體表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別給予不同濃度的地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯刺激細(xì)胞24 h，CCK-8檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞毒性作用，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Dectin-1和TLR2 mRNA表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dectin-1和TLR2蛋白水平變化。結(jié)果：不同劑量的地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯作用細(xì)胞24 h后均對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用(P<0.05)，且隨著藥物濃度增加毒性作用越大。地塞米松降低Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，上調(diào)TLR2受體轉(zhuǎn)錄和翻譯(P<0.05)；環(huán)磷酰胺對(duì)巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄翻譯無(wú)明顯影響(P>0.05)；霉酚酸酯和環(huán)孢素A能夠同時(shí)下調(diào)Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：不同免疫抑制劑對(duì)模式識(shí)別受體表達(dá)的調(diào)節(jié)作用具有差異性，通過(guò)選擇性調(diào)節(jié)各自靶點(diǎn)PRRs的表達(dá)抑制機(jī)體對(duì)各種真菌病原體的免疫識(shí)別過(guò)程，同時(shí)也能夠抑制巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，共同介導(dǎo)免疫抑制功能。

免疫抑制劑；Dectin-1；TLR2；巨噬細(xì)胞

天然免疫細(xì)胞、模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)及細(xì)胞因子等共同構(gòu)成了復(fù)雜有機(jī)的先天性免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。病原微生物入侵機(jī)體后，其表面病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)首先激活巨噬細(xì)胞等天然免疫前哨細(xì)胞表面的PRRs,進(jìn)而活化細(xì)胞內(nèi)部相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、分泌細(xì)胞因子、趨化中性粒細(xì)胞等吞噬細(xì)胞到達(dá)感染部位，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，吞噬、殺滅并清除入侵的致病微生物[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，C型凝集素受體家族成員Dectin-1和TLR2在抗真菌感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，成為真菌感染免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[2]。

免疫抑制劑是器官移植及自身免疫性疾病的常規(guī)用藥，其中地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯是目前臨床常用的四種免疫抑制劑，通過(guò)不同的作用機(jī)制抑制機(jī)體的免疫功能。眾所周知，長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑造成的侵襲性真菌感染一直是免疫抑制患者面臨的重要問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著免疫抑制患者的生存。有關(guān)免疫抑制劑對(duì)模式識(shí)別受體Dectin-1和TLR2調(diào)節(jié)作用的研究報(bào)道很罕見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探討上述四種免疫抑制劑對(duì)Dectin-1和TLR2表達(dá)的影響，從模式識(shí)別水平了解不同免疫抑制劑引起真菌感染作用機(jī)制之間的區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物公司細(xì)胞庫(kù)；環(huán)磷酰胺購(gòu)自Sigma公司；霉酚酸酯、環(huán)孢素A購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；超純RNA提取試劑盒，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，PCR Mixture(CWbio.Co.Ltd)；抗小鼠 PE-Dectin-1 抗體，抗小鼠PE-TLR2抗體(Miltenyi biotec)；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8細(xì)胞增殖毒性實(shí)驗(yàn) 快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%EDTA胰蛋白酶消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×105個(gè)/ml密度接種于96孔板中，每孔加100 μl 細(xì)胞懸液，邊緣孔以PBS緩沖液填充，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組：等量完全培養(yǎng)基；地塞米松：(20、50、100、200、500 μg/ml)；環(huán)磷酰胺：(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/ml)；環(huán)孢素A：(2.5、5、10、20、50 μg/ml)；霉酚酸酯：(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/ml)。干預(yù)24 h后棄凈原培養(yǎng)基，每孔加入110 μl CCK-8工作液(10 μl CCK-8溶液/100 μl完全培養(yǎng)基比例配制)繼續(xù)培養(yǎng)2 h。測(cè)定450nm吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，分析不同免疫抑制劑對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞毒性的影響。

1.2.2 藥物干預(yù)及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分5組：①空白對(duì)照組：加入等量完全培養(yǎng)基；②地塞米松組：分別加入不同濃度地塞米松(20、50、200 μg/ml)；③環(huán)磷酰胺組：分別加入不同濃度環(huán)磷酰胺(0.05、0.2、0.5 μg/ml)；④環(huán)孢素A組：分別加入不同濃度環(huán)孢素A(2.5、5、10 μg/ml)；⑤霉酚酸酯組：分別加入不同濃度霉酚酸酯(0.1、0.25、0.5 μg/ml)。干預(yù)24 h后，結(jié)束藥物刺激。提取細(xì)胞總RNA采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Dectin-1和TLR2 mRNA表達(dá)水平的變化；收集細(xì)胞利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同免疫抑制劑對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表達(dá)的影響。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá) 按照超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。按照世紀(jì)康為HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min→(95℃變性15 s→ 60℃退火/延伸1 min)×40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，序列如下：①Dectin-1 ：(F)5′-AGACTTCAGCACTCAAGACATCCA-3′，(R)5′-CAGGATTCCTAAACCCACTGCAA-3′；②TL-R2：F5′-CCCACTTCAGGCTCTTTGAC-3′，(R)5′-GCCACTCCAGGTAGGTCTTG-3′；β-actin：(F)5′-TGAA-GATCAAGATCATTGCTCCTCC-3′，(R)5′-CTAGA-AGCATTTGCGGGGACGATG-3′。待反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCT進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dectin-1、TLR2蛋白的表達(dá) 干預(yù)24 h后，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，PBS漂洗后重懸細(xì)胞，分別加5 μl抗小鼠PE-Dectin-1抗體和抗小鼠PE-TLR2抗體，室溫避光20 min進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，PBS漂洗離心，棄掉殘余抗體，上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 不同種類(lèi)和劑量免疫抑制劑對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響 CCK-8細(xì)胞增殖-毒性試驗(yàn)結(jié)果(如圖1)顯示：地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯作用細(xì)胞24 h后均對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用，且隨著藥物濃度的增加，毒性作用越大。所有加藥組的細(xì)胞生存率與空白對(duì)照組比較，P<0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

2.2 不同種類(lèi)和劑量免疫抑制劑對(duì)細(xì)胞Dectin-1、TLR2 mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量的地塞米松、環(huán)孢素A和霉酚酸酯單獨(dú)干預(yù)24 h后，RAW264.7巨噬細(xì)胞中Dectin-1 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組相比都降低(P<0.05)，而三種濃度的環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞中Dectin-1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)；圖3結(jié)果顯示：地塞米松單獨(dú)干預(yù)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，低、中、高三種濃度的地塞米松均能提高細(xì)胞TLR2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，尤以50 μg/ml濃度作用最為明顯。低、中、高三種濃度的環(huán)孢素A和霉酚酸酯均能下調(diào)巨噬細(xì)胞TLR2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，不同劑量(0.05、0.2、0.5 mg/ml)的環(huán)磷酰胺刺激細(xì)胞24 h后，TLR2 mRNA水平與空白對(duì)照組比較，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 四種免疫抑制劑對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of four immunosuppressants on proliferation of RAW264.7 cellsNote: DEX.Dexamethasone；CTX.Cyclophosphamide； CsA.Cyclosporin A； MMF.Mycophenolate mofetil.

GroupsCellsurvivalrate(%)Controlgroup100DEX10μg/ml93.16±4.021)DEX50μg/ml90.52±3.071)DEX100μg/ml77.16±6.321)DEX200μg/ml65.41±8.251)DEX500μg/ml37.73±6.461)CTX0.05mg/ml101.03±7.131)CTX0.2mg/ml90.80±7.211)CTX0.5mg/ml70.77±1.521)CTX1.0mg/ml64.90±9.661)CTX2.0μg/ml35.90±2.831)CsA2.5μg/ml90.40±7.711)CsA5μg/ml74.01±4.541)CsA10μg/ml66.57±7.781)CsA20μg/ml59.12±9.131)CsA50μg/ml33.03±6.061)MMF0.1μg/ml97.40±3.66MMF0.25μg/ml69.33±2.231)MMF0.5μg/ml59.60±5.081)MMF1.0μg/ml33.42±8.801)MMF2.0μg/ml5.69±0.511)

Note：Compared with the control group,*.P<0.05.

圖2 四種免疫抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞Dectin-1 mRNA的影響Fig.2 Effect of immunosuppressants on expression of Dectin-1 ±s,n=6)Note: Compared with the control group,*.P<0.05.

圖3 四種免疫抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2 mRNA的影響Fig.3 Effect of immunosuppressants on expression of TLR2 ±s,n=6)Note: Compared with the control group,*.P<0.05.

圖4 四種免疫抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞Dectin-1(A-D)、TLR2(E-H)蛋白平均熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of four immunosuppressants on MFI of Dectin-1(A-D)，TLR2(E-H) protein on RAW264.7 macrophagesNote: Gray lines.The control group;Black lines.The experiment group.

2.3 不同種類(lèi)和劑量免疫抑制劑對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞表面Dectin-1、TLR2蛋白表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如下圖(圖4A～4H)所示：RAW264.7巨噬細(xì)胞自身表達(dá)極低水平的Dectin-1蛋白，TLR2表達(dá)水平明顯高于Dectin-1蛋白水平。200 μg/ml的地塞米松干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞表面Dectin-1蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，TLR2蛋白水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；環(huán)磷酰胺處理后細(xì)胞表面Dectin-1和TLR2蛋白熒光強(qiáng)度與空白組無(wú)明顯變化(P>0.05)；而10 μg/ml的環(huán)孢素A以及0.5 μg/ml的霉酚酸酯單獨(dú)刺激細(xì)胞24 h后，細(xì)胞表面Dectin-1和TLR2蛋白的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

免疫抑制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，主要用于治療自身免疫性疾病以及移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)，促進(jìn)移植物的存活。然而長(zhǎng)期大量應(yīng)用免疫抑制劑則會(huì)造成患者免疫力低下，真菌感染的發(fā)病率和病死率明顯增加，嚴(yán)重威脅免疫抑制患者的生存。免疫抑制劑種類(lèi)繁多，根據(jù)作用方式可將其分為皮質(zhì)類(lèi)固醇家族抗炎藥、鈣調(diào)神經(jīng)蛋白抑制劑、細(xì)胞毒性或抗增殖性藥物以及特異性抗體。地塞米松、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A和霉酚酸酯是目前臨床上最為常用的具有代表性的四種免疫抑制劑，通過(guò)不同的作用機(jī)制抑制免疫細(xì)胞的功能，而這些免疫抑制作用是否涉及調(diào)節(jié)天然免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物PAMPs的模式識(shí)別過(guò)程以及不同免疫抑制劑對(duì)模式識(shí)別受體影響之間的差別目前尚不明確。

PRRs對(duì)真菌病原體PAMPs的識(shí)別過(guò)程是抵御真菌感染的始動(dòng)環(huán)節(jié)，進(jìn)一步啟動(dòng)機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3]，TR2和C型凝集素受體Dectin-1是天然免疫系統(tǒng)中的重要PRRs，能夠識(shí)別一系列真菌病原體，協(xié)同誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的抗真菌免疫反應(yīng)，在宿主的防御機(jī)制中發(fā)揮著核心性的作用[2]。Dectin-1和/或TLR2受體發(fā)生基因突變、缺失或受到抑制都將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抵御真菌感染的能力減弱。早前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Dectin-1缺陷的造血干細(xì)胞移植受體[4]以及Dectin-1早期終止密碼子Y238X突變患者[5]，更容易罹患侵襲性真菌感染。Dectin-1參與真菌感染的重要性在小鼠模型中也得到了證明：Dectin-1缺陷導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法啟動(dòng)有效的炎癥反應(yīng)來(lái)控制真菌的播散[6]。氣管內(nèi)接種煙曲霉孢子的TLR2基因敲除小鼠較正常組而言呼吸窘迫癥狀更加嚴(yán)重，真菌負(fù)荷也明顯高于對(duì)照組[7]。而新型隱球菌感染TLR2-/-和Myd88-/-小鼠模型，感染動(dòng)物體內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-12p40和/或IFN-γ水平明顯減少[8]。這些結(jié)果充分說(shuō)明了Dectin-1和TLR2在機(jī)體抵抗真菌感染性疾病方面的重要性。

地塞米松是具有強(qiáng)大免疫抑制功能的長(zhǎng)效類(lèi)糖皮質(zhì)激素，能夠增加信號(hào)蛋白IB的基因轉(zhuǎn)錄，阻斷鈣離子載體對(duì)單核和其他淋巴細(xì)胞起作用，調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達(dá)并抑制吞噬細(xì)胞向炎癥局部移動(dòng)，從而發(fā)揮免疫抑制作用[9]。早在2003年，Willment等[10]發(fā)現(xiàn)地塞米松是Dectin-1 mRNA表達(dá)的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，且僅在24 h時(shí)下調(diào)Dectin-1 mRNA表達(dá)水平。而有關(guān)地塞米松對(duì)模式識(shí)別受體TLR2影響的結(jié)果則不盡相同，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為地塞米松顯著上調(diào)TLR2的表達(dá)水平[11]，也有文獻(xiàn)稱地塞米松對(duì)TLR2的表達(dá)無(wú)明顯影響[12]或呈現(xiàn)出抑制性的調(diào)節(jié)作用[13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松單獨(dú)干預(yù)24 h對(duì)正常狀態(tài)下的RAW264.7巨噬細(xì)胞Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而地塞米松對(duì)TLR2受體的轉(zhuǎn)錄和翻譯卻起上調(diào)作用。此外，我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)大劑量地塞米松對(duì)巨噬細(xì)胞具有明顯的毒性作用。由此我們推測(cè)地塞米松通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制Dectin-1的表達(dá)，干擾機(jī)體的免疫識(shí)別，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑類(lèi)的廣譜抗腫瘤藥，也是目前免疫抑制作用最強(qiáng)、應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞毒性免疫抑制藥。與糖皮質(zhì)激素不同，環(huán)磷酰胺主要?dú)鏐淋巴細(xì)胞，抑制T淋巴細(xì)胞的功能，干擾細(xì)胞的增殖功能，介導(dǎo)快速的、非選擇性的抗原敏感性小淋巴細(xì)胞的殺傷，進(jìn)而發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制作用。早前Yang等[14]發(fā)現(xiàn)接受環(huán)磷酰胺干預(yù)的曲霉菌感染小鼠模型與僅單純接種曲霉菌的小鼠感染模型相比，Dectin-1表達(dá)水平受到抑制，真菌負(fù)荷相對(duì)增加。栗方等[15]也得出了相似的結(jié)論，并同時(shí)證明環(huán)磷酰胺下調(diào)TLR2和TLR4的轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果顯示體外應(yīng)用環(huán)磷酰胺干預(yù)細(xì)胞，對(duì)正常狀態(tài)巨噬細(xì)胞中的Dectin-1和TLR2 mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯影響，但是隨著環(huán)磷酰胺濃度的增加，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制功能越明顯。我們考慮導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與各自的試驗(yàn)條件不同如給藥劑量、藥物干預(yù)時(shí)間以及體內(nèi)外微環(huán)境的不同有關(guān)。

環(huán)孢素A也能夠通過(guò)影響天然免疫的模式識(shí)別過(guò)程發(fā)揮免疫抑制作用，但是相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道太少且結(jié)果存在爭(zhēng)議：我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)皮下注射環(huán)孢素A的大鼠TLR2和TLR4 mRNA和蛋白水平和空白組比較明顯升高[16]；而Greenblatt等[17]認(rèn)為Dectin-1是環(huán)孢素A作用機(jī)制的上游元件，環(huán)孢素A對(duì)細(xì)胞因子IL-10表達(dá)的下調(diào)作用主要是通過(guò)抑制Dectin-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，從而介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞的抗真菌免疫功能的調(diào)控，而與TLR2/Myd88通路無(wú)關(guān)。環(huán)孢素A屬于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，是一種特異性T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)藥，能夠選擇性下調(diào)T淋巴細(xì)胞相關(guān)因子如IL-2、TNF-α的釋放，削弱宿主的體液/細(xì)胞免疫。本研究結(jié)果證明環(huán)孢素A能夠抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的毒性作用具有劑量依賴性。此外，環(huán)孢素單獨(dú)作用細(xì)胞能夠下調(diào)Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，抑制Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其中大劑量的環(huán)孢素對(duì)Dectin-1 mRNA表達(dá)水平的抑制作用尤為明顯，說(shuō)明環(huán)孢素A能同時(shí)抑制Dectin-1和TLR2信號(hào)通路，從而發(fā)揮免疫抑制功能。

霉酚酸酯是器官移植領(lǐng)域常用的免疫抑制劑，主要通過(guò)次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的活性，抑制T/B淋巴細(xì)胞增殖并減少B淋巴細(xì)胞分泌相關(guān)抗體發(fā)揮強(qiáng)效的、選擇性的免疫抑制功能。霉酚酸酯是否能夠影響宿主的模式識(shí)別受體表達(dá)水平介導(dǎo)免疫抑制功能，目前尚不清楚。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，霉酚酸酯同環(huán)孢素作用相似，也能夠下調(diào)正常狀態(tài)細(xì)胞Dectin-1、TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出一定的免疫抑制作用，且這一抑制效應(yīng)具有明顯的濃度依賴性。

綜上所述，四種免疫抑制劑均對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有抑制作用。而不同免疫抑制劑對(duì)天然免疫系統(tǒng)模式識(shí)別過(guò)程的影響則具有一定的差異性：地塞米松能夠下調(diào)正常狀態(tài)下Dectin-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)；體外環(huán)磷酰胺干預(yù)并不影響巨噬細(xì)胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄翻譯；霉酚酸酯和環(huán)孢素A能夠同時(shí)下調(diào)Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。因此我們認(rèn)為在模式識(shí)別水平，不同免疫抑制劑發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的作用機(jī)制也不盡相同，通過(guò)選擇性調(diào)節(jié)各自靶點(diǎn)PRRs的表達(dá)抑制機(jī)體對(duì)各種真菌病原體的免疫識(shí)別功能。

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[收稿2016-05-09 修回2016-06-07]

(編輯 許四平)

Effects of immunosuppressants on Dectin-1 and TLR2 expression in macrophages

MAOYa-Nan,WANGWen,WANGDong,ZHANGBo.

AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective:To study the effects of dexamethasone,cyclophosphamide,cyclosporin A and mycophenolate mofetil on the expression of Dectin-1 and TLR2 receptor in RAW264.7 cell line.Methods: In vitro culturing RAW264.7 macrophages,the cells were given different doses of dexamethasone and cyclophosphamide,cyclosporin A and mycophenolate mofetilfor 24 h.The influence of different immunosuppresants on cell proliferation was detected by CCK-8 assay.Dectin-1,TLR2 mRNA and protein levels of change were detected with RT-PCR technique and flow cytometry.Results: CCK-8 cell proliferation toxicity experiment results showed that with the increase of the dose of dexamethasone,cyclophosphamide,Cyclosporin A and mycophenolate mofetil,the different degree of inhibition of RAW264.7 cell proliferation in mice can be saw after the intervention of 24 h (P<0.05).After 24 h of dexamethasone stimulation,Dectin-1 mRNA and protein level decreased,TLR2 mRNA and protein levels elevated (P<0.05).However cyclophosphamide had no obvious influence on Dectin-1 and TLR2 (P>0.05).Mycophenolate mofetil and cyclosporin A could both inhibit the expression of Dectin-1 and TLR2 (P<0.05).Conclusion: There are significant differences among the regulatory functions of various immunosupressants on the expression of pattern recognition receptors.Different immunosuppressive agents exert their inhibitory effects on immune recognition process of fungal pathogens not only by selectively regulating their target PRRs expression,but also by inhibiting the growth and proliferation of macrophages.

Immunosuppressant agent;Dectin-1;TLR2;Macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.010

毛亞男(1988年-)，女，碩士，主要從事感染與免疫方面的研究，E-mail：1035999640@qq.com。

及指導(dǎo)教師：張 波(1966年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫與呼吸機(jī)方面的研究，E-mail：zhangbohuxi@sina.com。

R563.1 R392.5

A

1000-484X(2017)03-0365-05

①空軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京100142。