運動療法聯(lián)合中藥復方對CHF大鼠AngⅡ的影響

禮 海，馬 金，張 洋，張 艷

運動療法聯(lián)合中藥復方對CHF大鼠AngⅡ的影響

禮 海1，馬 金2，張 洋3，張 艷3

目的 觀察運動療法聯(lián)合中藥復方對慢性心力衰竭(CHF)大鼠血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的影響。方法 建立大鼠CHF模型，檢測AngⅡ、1型受體(AT1)等，通過藥物及運動方案進行干預，利用實時熒光定量PCR及蛋白印跡法等分析標本。結果 AngⅡmRNA表達中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AngⅡ蛋白表達中藥組、中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AT1蛋白表達中藥組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論 AngⅡ，AT1是導致心肌重構的重要靶點，運動療法加中醫(yī)藥治療CHF具有較好療效，可促進病人提高生活質(zhì)量，具有減毒增效的作用。

慢性心力衰竭；中藥復方；運動療法；血管緊張素Ⅱ；1型受體；心肌重構

隨著基礎研究持續(xù)深入，衛(wèi)生醫(yī)療條件普遍改善，人均壽命不斷增長；傳染性疾病發(fā)病率不斷下降，同時社會生活節(jié)奏加快，環(huán)境與心理多因素導致心血管疾病發(fā)病率逐年升高，已成為我國居民首要死亡原因，特別是以慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)為代表的慢性疾病[1]。在臨床治療中多采用藥物治療，西醫(yī)藥物短期效果明顯，但具有較大的毒副作用；中醫(yī)藥治療有效但理論機制尚不明確，運動治療方興未艾[2]。而相關研究證明血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)參與CHF的發(fā)生與發(fā)展，通過分析AngⅡ、1型受體(AT1)等指標，探討研究運動療法聯(lián)合中藥復方對CHF及心肌重構的影響，為今后中醫(yī)藥開發(fā)與疾病進一步治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心購進，普通級12周齡體重200 g～220 g雄性SD大鼠80只，合格證為遼實動2008-0018。

1.2 實驗藥物 參照2010年版國家藥典[3-4]規(guī)定選取藥材，參草通脈顆粒(黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子，比例3∶1∶1∶2∶2∶1∶1)批號遼藥制Z0901013，委托遼寧華源本溪三藥有限公司生產(chǎn)。鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20030514)，每片10 mg。

1.3 造模方法 使用10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔麻醉[5]，經(jīng)氣管插管術后迅速連接小動物呼吸機。大鼠皮膚經(jīng)消毒后，在鼠左側第3肋間橫切長1.5 cm，鈍性分離肌肉，充分暴露心臟，于鼠左冠狀動脈前降支起源點3 mm處進行結扎，觀察心電儀，如胸前導聯(lián)ST段及T波顯著異常，迅速分層縫合，在每層肌肉縫合中及傷口處敷淋灑注射用青霉素鈉，大鼠自主呼吸恢復后，吸痰，停呼吸機。前3 d注射青霉素鈉每日1次，每次2×105U。常規(guī)喂養(yǎng)7 d，第8天起飼料減半；每天游泳至其疲乏，每日1次，共28 d。第29天經(jīng)多普勒超聲心動圖檢測左室射血分數(shù)(LVEF)，LVEF≤60%可診斷為心力衰竭[6]，出現(xiàn)精神萎靡，毛色無光澤列入觀察對象。

1.4 實驗方案 造模成功大鼠，按體重依次排序編號，采用數(shù)字隨機表求余數(shù)法分為中藥組、西藥(鹽酸貝那普利)組、模型組、中藥加運動組、運動組，每組8只。中藥加運動組、運動組與尚未分組且造模成功的大鼠進行適應性運動3 d，不適應跑臺的中藥加運動組與運動組大鼠剔除出組，由未分配組別且適應跑臺、體重接近的大鼠替代，保證每組有8只大鼠。對照(假手術)組僅行開胸，鈍性分離暴露心臟，冠狀動脈前降支起源點2 mm～4 mm處用線勒緊5 s后松開；后70 d常規(guī)飼養(yǎng)。對照組、模型組和運動組大鼠不用藥，每日兩次常規(guī)等容積灌胃蒸餾水；余各組大鼠按人鼠劑量換算公式：劑量(g/kg)=人的劑量(g)×系數(shù)(0.018)/動物體重(kg)灌胃給藥[7]。中藥組與中藥加運動組，每日2次灌胃給予參草通脈顆料、7.2 g生藥/(kg·d)；西藥組給予鹽酸貝那普利片首次灌胃1.2 mL生藥/kg，第2次灌胃1.2 mL蒸餾水，用藥42 d。

1.5 大鼠運動試驗方案 大鼠進行適應性訓練第4天行正式運動，采用Bedford鼠體重/攝氧量回歸方程建立ET模型。耐受負荷(Ek)=m·V2/2(m為大鼠質(zhì)量，v為速度)；潛能(Ep)=m·g·v·t·sinψ(g為重力加速度量，t為時間，ψ為傾斜度)，二者相加之和為運動耐量ET。跑臺傾斜角度為15度，10 m/min(相當于最大氧攝取45%VOzmax)。首次15 min，第2次為30 min，第3次為45 min[8]。運動48 d，每日1次。

1.6 主要試劑及儀器 6周后禁食、不禁水12 h，麻醉處死全部大鼠。取大鼠心肌組織，每只大鼠心肌按標準處理分為若干份，每份100 mg，用于實時定量熒光PCR技術、蛋白印跡分析法檢測AngⅡ、AT1，并于液氮-80 ℃條件下保存待測。

PCR試劑盒由大連TaKaRa公司生產(chǎn)；7500型實時熒光定量pcr儀，由美國Bioneer公司生產(chǎn)；PCR擴增儀，由德國Biometra公司生產(chǎn)。

1.7 實驗步驟

1.7.1 實時熒光定量PCR操作 根據(jù)實驗操作流程，應用ABI7500擴增儀分析結果并計算。利用Prime5.0軟件設計引物序列、擴增產(chǎn)物長度如下表1。

表1 引物序列

1.7.2 蛋白印跡法(Western Blot)實驗步驟 按照試劑盒及儀器要求的操作步驟進行,采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析定量。

1.7.3 實時定量熒光PCR數(shù)據(jù) 采用相對定量法計算，用2-ΔΔCt(Livak)方法比較經(jīng)處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉錄之間的表達差異。公式：△CT(正常)=CT(正常校正樣本)-CT(正常參照樣本)；△CT(實驗)=CT(實驗目標樣本)-CT(實驗參照樣本)；2-ΔΔCt=△CT(實驗)-△CT(正常)計算，計算結果為實驗樣本表達比正常樣本表達的倍率。

2 結 果

實驗各干預方案對CHF大鼠心肌組織對AngⅡ、AT1 mRNA表達與蛋白表達的影響，mRNA表達中AngⅡ、AT1中藥組、西藥組、中藥加運動組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；AngⅡ、AT1中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AngⅡ中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AT1中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖1。

圖1 熒光PCR觸解曲線

蛋白表達中AngⅡ、AT1中藥組、西藥組、中藥加運動組、運動組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；AngⅡ中藥組、中藥加運動組與西藥組比較，AT1中藥加運動組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；AT1中藥組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表1。

注：1為對照組；2為模型組；3為運動組；4為西藥組；5為中藥組；6為中藥加運動組。圖2 Western Blot條帶圖

表1 各組CHF大鼠心肌組織對AngⅡ、AT1 mRNA表達與蛋白表達影響的比較

3 討 論

近年對CHF研究認為是以腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌基因調(diào)控異常，聯(lián)合多種病理因素參與的心肌超負荷運行機制[9]。初期RAS系統(tǒng)通過AngⅡ?qū)崿F(xiàn)強烈血管收縮、增加醛固酮分泌、促進心肌細胞增生，平衡容量和壓力負荷維持正常心功能。有報道證實[9]AngⅡ過度表達造成心肌肥大和誘導心肌細胞凋亡，是導致CHF重要且相對獨立、特異的因素。對細胞直接注射AngⅡ[10-12]，在不依賴血流動力學改變情況下可使心肌顯著增厚，心肌收縮功能降低、硬化，發(fā)生心肌重構，造成CHF發(fā)生。AngⅡ主要與AT1結合而產(chǎn)生具有增加正性肌力及頻率等作用，通過自分泌與旁分泌促進心肌增生及重構，因此兩者是導致CHF發(fā)生的重要靶點。相關實驗發(fā)現(xiàn)，CHF發(fā)生時AngⅡ表達明顯增加[13-14]，多作用于心肌細胞膜上AT1受體，而AT2基本無意義，可導致AT1 mRNA及蛋白表達升高，導致心肌細胞發(fā)生迅速增殖，且細胞體積增大，而心肌產(chǎn)生重構等[16-18]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組實驗大鼠AngⅡ、AT1 mRNA及蛋白表達均顯著增加，而對照組未見明顯增加，證明AngⅡ、AT1與CHF密切相關。而其余治療組檢測結果均優(yōu)于模型組，說明藥物等治療方法有效。中藥加運動組效果較為突出[19]。過去關于CHF病人強調(diào)注意休息，減少運動；近期研究發(fā)現(xiàn)適當運動有利于CHF恢復[20-21]。但相關研究較少，在本實驗進行嘗試，認為康復運動應配合藥物治療，單純運動康復暫不推薦。在藥物控制基礎上，運動療法有助于病人恢復；提高心肌有效做功，為機體有效泵血提高供氧，恢復心臟功能[22-23]。中醫(yī)和西醫(yī)均是有益嘗試。

本實驗中藥加運動組較單純中藥組AngⅡ、AT1水平下降顯著，可能與交感神經(jīng)興奮呈正相關，與動脈壓負相關，增加射血分數(shù)，促進循環(huán)有利于氧氣交換，調(diào)節(jié)心肌細胞外基質(zhì)，可延緩或阻斷心肌重構，降低神經(jīng)興奮，提高最大耗氧量，增加心輸出量，提高生活質(zhì)量，降低住院率[14]。中藥效果與西藥相當，中醫(yī)藥治療更重視整體調(diào)節(jié)。在臨床治療中，西藥多以利尿劑為主，配合強心藥物，長期服用具有明顯毒副作用，且隨著使用時間延長臨床療效受到影響。

中藥具有增效減毒的作用，心衰為病，多心氣不足，運血無力，氣虛血瘀為病，用以益氣活血之法。故治療多用益氣活血之品，毒副作用小。黃芪、人參具有補氣益氣之功，黃芪甲苷、多糖等具有正性肌力、抗心律失常、擴張血管、降低血小板黏附率及降血脂等作用；紅花、三七活血為上；丹參具有補氣行血，活血祛瘀，通經(jīng)止痛，現(xiàn)代研究認為丹參酮有活血保護心肌，改善供血之力，與人參配伍具有強心、擴冠脈、調(diào)心率、抗凝結等作用；益母草活血利水，通經(jīng)絡；葶藶子祛痰平喘，利胸中之水；三七具有調(diào)節(jié)血壓等作用。全方益氣活血，綜合調(diào)節(jié)，營養(yǎng)心肌，兼治相關并發(fā)癥，一舉多得。從整體調(diào)節(jié)心臟功能優(yōu)于西藥固定靶點調(diào)節(jié)治療[24]。通過實驗結果證明：中藥聯(lián)合運動療法能明顯改善心肌重構，有效恢復心功能,且對CHF治療療效較為明顯。因此在臨床治療中，以藥物治療為基礎，若病情穩(wěn)定應盡早加入康復運動療法，通過有計劃的運動訓練提高心肌與全身供氧，可有效恢復心肌功能。改變傳統(tǒng)單純保守藥物治療，避免運動的觀念。

綜上所述，今后治療使用中西藥物應綜合病人病情多角度分析，考慮藥物兼容性，在運動方面如5 min步行法，太極拳原地運動簡易招式，根據(jù)病情循序漸進，綜合治療方能取得較好療效[25-26]，并配合運動康復治療有利于CHF病人康復。

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(本文編輯薛妮)

國家“十一五”科技支撐計劃項目(No，2007BAI20B076)；沈陽市科技計劃項目：益氣活血中藥干預PGC-Ⅰ調(diào)控心衰心肌細胞能量代謝重構的機制研究(No.F13-316-1-10)

1.遼寧省沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院(沈陽 110101)；2.遼寧省衛(wèi)生職業(yè)技術學院；3.遼寧中醫(yī)藥大學

張艷，E-mail：sylh37@163.com

R541.6 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.05.011

1672-1349(2017)05-0555-04

2016-07-29)

引用信息：禮海，馬金，張洋，等.運動療法聯(lián)合中藥復方對CHF大鼠AngⅡ的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(5)：555-558.