姜黃素聯(lián)合熱療對人黑素瘤A375細(xì)胞毒性的實驗研究

郝慧霞，李桂梅，莎 娜

黑素瘤[1]（melanoma）是由黑素細(xì)胞異常過度增殖引發(fā)的腫瘤，多為惡性，稱為惡性黑素瘤（malignant melanoma)，多發(fā)生于皮膚及皮膚-黏膜交界處、眼脈絡(luò)膜和軟腦膜。大部分轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤對多種化療藥物抵抗[2]，因此，治療惡性黑素瘤是亟待攻克的難題。黑素瘤在中國的發(fā)病率并不是很高，約占全部惡性腫瘤的1%[3]。研究表明[4]，從傳統(tǒng)中藥姜黃中提取的姜黃素，對黑素瘤、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤有較好的療效，且沒有明顯的不良反應(yīng)。

姜黃素是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的一種酚類色素，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用[5]，而熱療可以提高化療藥物的敏感性[6]。本研究詣從細(xì)胞水平上探討姜黃素聯(lián)合熱療對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞毒性是否存在協(xié)同效應(yīng)，為臨床上姜黃素聯(lián)合熱療治療皮膚惡性黑素瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人惡性黑素瘤細(xì)胞株A375（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心），噻唑藍(lán)（MTT）及姜黃素試劑（美國Sigma公司），DMEM（高糖）培養(yǎng)基（Thermo公司），胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取人惡性黑素瘤A375細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，待生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化，機械吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μl，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后備用；調(diào)濃度為4×105/ml人惡性黑素瘤A375細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后備用。

1.2.2 試劑配置 取姜黃素0.1842 g，用100 μl 二甲基亞砜溶解后，再用無水乙醇定容至100 ml，此即為5×103μmol/L姜黃素母液。取5×103μmol/L姜黃素母液2 ml，用培養(yǎng)基定容至100 ml，此姜黃素濃度為100 μmol/L，0.22 μm濾器過濾，分裝每管10 ml、-20℃避光凍存、備用。

1.2.3 細(xì)胞活性比較 取備用細(xì)胞板隨機作為30 μmol/L姜黃素組、單純熱療組（43℃恒溫水浴箱60 min）、30 μmol/L姜黃素聯(lián)合熱療組（加完姜黃素后，放到43℃恒溫水浴箱60 min）和對照組（加相同劑量的培養(yǎng)液），各組移入37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收獲細(xì)胞前4 h，每孔分別加入20 μl MTT，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下再培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜振蕩10 min，于波長570 nm處測定吸光度（A值）。細(xì)胞增殖抑制率[7]=（對照組A值-對照組A值）×100%/對照組A值。

1.2.4 劑量反應(yīng)關(guān)系 取備用細(xì)胞板隨機作為0、10、20、30、40、50 μmol/L的姜黃素聯(lián)合熱療組，在37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，重復(fù)1.2.3實驗步驟。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡（Annexin V-PI雙染法）

取備用細(xì)胞瓶作對照組、30 μmol/L姜黃素聯(lián)合熱療組、50 μmol/L姜黃素聯(lián)合熱療組，在37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機前過40目網(wǎng)調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測，Cell Quest軟件收集細(xì)胞，Modi fi t軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，資料描述均采用xˉ±s表示；多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析；多組率的比較采用非參數(shù)H檢驗；劑量反應(yīng)關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 基本情況

倒置顯微鏡下觀察人惡性黑素瘤A375細(xì)胞（圖1），鏡下可見其貼壁生長，呈梭形或不規(guī)則多角形，形態(tài)飽滿，中央有核，核較圓。常規(guī)胰酶消化后，細(xì)胞逐漸變圓。隨著姜黃素濃度的升高，細(xì)胞變圓脫壁，壞死、漂浮細(xì)胞增多，經(jīng)Giemsa染色，隨著姜黃素濃度的升高，顯微鏡下可見大量A375細(xì)胞核固縮、細(xì)胞核邊緣化、核膜裂解、出現(xiàn)無核細(xì)胞、空泡細(xì)胞（圖2-圖4）。

圖1 正常A375細(xì)胞對照組（×10倍）

圖2 30 μmol/L姜黃素+熱療（×10倍）

圖3 30 μmol/L姜黃素+熱療（Giemsa染色×100倍）

圖4 50 μmol/L姜黃素+熱療（Giemsa染色×100倍）

2.2 細(xì)胞活性比較

與對照組相比，30 μmol/L姜黃素組、單純熱療組、聯(lián)合組的細(xì)胞活性均有不同程度的抑制，以聯(lián)合組的細(xì)胞抑制率最高（45.95%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.47，P＜0.01）。聯(lián)合組的細(xì)胞抑制率顯著高于30 μmol/L姜黃素組和熱療組（P＜0.01），30 μmol/L姜黃素組細(xì)胞抑制率高于熱療組11.71%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 不同處理因素對A375細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 劑量反應(yīng)關(guān)系

A375細(xì)胞經(jīng)10、20、30、40、50 μmol/L的姜黃素聯(lián)合熱療處理后，隨著姜黃素濃度的增加，A375細(xì)胞增殖抑制率也增加，并呈劑量依賴性，姜黃素濃度與A375細(xì)胞增殖抑制率存在正相關(guān)（rs=0.95）（表2）。

表2 不同濃度姜黃素聯(lián)合熱療抑制A375細(xì)胞增殖劑量反應(yīng)關(guān)系

2.4 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

不同處理因素誘導(dǎo) A375細(xì)胞凋亡的毒性效應(yīng)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，與對照組相比，各處理因素組細(xì)胞早期凋亡率均增加。對照組、30 μmol/L姜黃素組、熱療組、30 μmol/L 姜黃素聯(lián)合熱療組細(xì)胞早期凋亡率分別為4.27%、22.01%、17.14%和31.56%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（H=15.37、P＜0.01）。

3 討論

黑素瘤是一種源于皮膚正常黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，發(fā)展迅速，惡性程度高，預(yù)后較差，病死率高[8,9]，其易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的5年生存率低于5%。

姜黃素[5,9]（C21H20O6，分子量368.37）是從姜黃屬植物如姜黃、莪術(shù)等的根或莖中提取的一種有效成分，中醫(yī)認(rèn)為有理氣、清熱和散結(jié)的功效，盛產(chǎn)于東南亞地區(qū)和澳大利亞及我國南部。熱療是一種治療惡性腫瘤有效的輔助方法，其基本原理是利用物理方法將腫瘤區(qū)域或全身組織加熱到42.5～43.5 ℃，并維持一定時間，達(dá)到能破壞腫瘤細(xì)胞又不損傷正常組織的目的。目前熱療已被認(rèn)為繼手術(shù)治療、放療、化療和生物免疫治療后出現(xiàn)的治療腫瘤有效方法[10]，成為腫瘤綜合治療有效的手段之一，同時因熱療不會對環(huán)境產(chǎn)生任何不良影響，因此被稱為“綠色治療”。

我們乘坐電梯并習(xí)以為常，殊不知，它也是一個默默付出不求回報的勞動者，小作者善于挖掘電梯不為人知的另一面，讓詩歌變得新奇有深意。

本次研究結(jié)果顯示，與對照組相比，30 μmol/L姜黃素組、單純熱療組、30 μmol/L姜黃素聯(lián)合熱療組的細(xì)胞活性均有不同程度的抑制，但以聯(lián)合組的細(xì)胞抑制率最高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)。說明姜黃素聯(lián)合熱療有明顯抑制A375細(xì)胞生長、增殖的作用，這與文獻(xiàn)報告基本一致。邱實和譚升順[11]研究顯示，姜黃素能抑制人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的增殖活性，其對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的毒性與姜黃素濃度成正相關(guān)關(guān)系和明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。Weber等[12]研究認(rèn)為姜黃素可以靶向性地抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的誘導(dǎo)活化作用，阻礙細(xì)胞株抗凋亡機制的運行，促使癌細(xì)胞凋亡。也有研究認(rèn)為[13]姜黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過下調(diào)Bcl-2[14]及p53的表達(dá)，從而控制細(xì)胞凋亡。A375細(xì)胞增殖抑制率與姜黃素濃度存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.95），A375細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性，說明姜黃素聯(lián)合熱療對惡性黑素瘤A375細(xì)胞的增殖抑制作用為協(xié)同相加作用，而不是拮抗作用。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，不同處理因素誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的毒性效應(yīng)，一方面顯示30 μmol/L姜黃素聯(lián)合熱療組細(xì)胞早期凋亡率分別高于30 μmol/L姜黃素組和熱療組9.6%和14.42%，這說明熱療具有增敏姜黃素的細(xì)胞毒性作用，姜黃素聯(lián)合熱療對腫瘤細(xì)胞的毒性高于單純姜黃素和熱療作用[15]。熱療對腫瘤細(xì)胞毒性機制較復(fù)雜，目前認(rèn)為熱療一方面增強自然殺傷細(xì)胞活性，促進(jìn)白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子的生成，提高機體免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞消除，另一方面刺激機體高表達(dá)熱休克蛋白，它可參與特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合熱療對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的毒性起協(xié)同相加作用，熱療可加強姜黃素抑制A375細(xì)胞增殖的作用、提高姜黃素誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡的敏感性和增敏姜黃素的細(xì)胞毒性。但細(xì)胞實驗外用于臨床治療，還需要進(jìn)一步的探索和研究。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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