十字花科植物中黑芥子酶的研究進(jìn)展

孫艷偉，張澤生，2，3，王田心，2，*，李雨蒙，秦程廣

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457）

十字花科植物中黑芥子酶的研究進(jìn)展

孫艷偉1，張澤生1，2，3，王田心1，2，*，李雨蒙1，秦程廣1

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457）

黑芥子酶是一種存在于十字花科植物中用以水解硫代葡萄糖苷的酶，且水解產(chǎn)物因具有抗癌作用而受到廣泛關(guān)注。對(duì)黑芥子酶的分布、結(jié)構(gòu)及活性等方面進(jìn)行了概述，著重介紹了十字花科植物中黑芥子酶的提取及活性測(cè)定方法，并簡(jiǎn)述了黑芥子酶的應(yīng)用。

十字花科植物；黑芥子酶；硫代葡萄糖苷；研究進(jìn)展

隨著人們生活水平的提高，居民膳食結(jié)構(gòu)中高糖、高脂食品攝入逐漸增多，過(guò)多的能量攝入可能導(dǎo)致癌癥、動(dòng)脈硬化等慢性病的發(fā)生，因此近年來(lái)防癌抗癌及慢性病防治一直是醫(yī)學(xué)界及營(yíng)養(yǎng)界的研究熱點(diǎn)。十字花科蔬菜是我國(guó)常見的八大蔬菜之一，品種繁多，因其普遍含有天然抗癌物質(zhì)而受到廣泛關(guān)注。十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷可被黑芥子酶高效降解得到異硫氰酸酯等代謝產(chǎn)物[1]，研究表明異硫氰酸酯類物質(zhì)不僅是形成十字花科蔬菜特有風(fēng)味的化合物，還具有參與植物防御及人類癌癥預(yù)防等生物活性[2-5]。近年來(lái)，黑芥子酶作為降解硫代葡萄糖苷的重要酶源，成為抗癌研究的新方向。本文主要綜述了國(guó)內(nèi)外十字花科植物中黑芥子酶的研究進(jìn)展，旨在為黑芥子酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 黑芥子酶概述

1.1 黑芥子酶及其分布

黑芥子酶（myrosinase，EC3.2.1），又稱 β-硫代葡萄糖苷酶，是一種普遍存在于十字花科植物中可將硫代葡萄糖苷高效降解的酶類[6-7]。它性質(zhì)穩(wěn)定，在十字花科植物的根、莖、葉、幼苗及種子中普遍存在，分布在特定的黑芥子酶細(xì)胞中[4]。另外，在一些以十字花科蔬菜為食的昆蟲、哺乳動(dòng)物組織、真菌及其多型擬桿菌等腸道細(xì)菌中都有黑芥子酶的存在[8-11]，研究表明胃腸道細(xì)菌來(lái)源的黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷產(chǎn)生異硫氰酸酯的轉(zhuǎn)化量較低（1%～40%）[12-13]。國(guó)內(nèi)外對(duì)黑芥子酶的基因方面也進(jìn)行了大量研究，其中擬南芥的黑芥子酶基因研究最多，并進(jìn)行了相關(guān)黑芥子酶基因的克隆方面的研究[14-15]。

1.2 黑芥子酶的結(jié)構(gòu)及同工酶

黑芥子酶的本質(zhì)是一種糖蛋白，十字花科植物中存在多種黑芥子酶，不同來(lái)源的黑芥子酶其表觀分子質(zhì)量、亞基數(shù)目和側(cè)鏈中糖鏈含量的高低不同[16-17]，導(dǎo)致不同來(lái)源的黑芥子酶對(duì)相同硫苷的降解率[18]和硫苷的降解產(chǎn)物組分[19]存在差異。黑芥子酶通常以同工酶的形式存在，據(jù)報(bào)道，大多數(shù)黑芥子酶同工酶是二聚物，其子單位的分子量介于65 kDa～75 kDa之間[20-23]，但相關(guān)研究表明山葵來(lái)源的黑芥子酶是由12個(gè)子單位構(gòu)成，每個(gè)子單位的分子量大約是45 kDa[24]。迄今為止，黑芥子酶被認(rèn)為是由MA、MB和MC 3種基因所編碼，其中MA基因編碼的黑芥子酶是以游離的二聚體形式存在，MB和MC基因編碼的黑芥子酶與其他的蛋白質(zhì)混合在一起，以復(fù)合體的形式存在。黑芥子酶復(fù)合體主要包括黑芥子酶、黑芥子酶結(jié)合蛋白（Myrosinase-binding protein，MBP）、黑芥子酶協(xié)助蛋白（Myrosinase-associated protein，MyAP）[25]。

1.3 黑芥子酶的活性及影響因素

不同來(lái)源的黑芥子酶活性存在很大差異，丁艷等[26]在體外研究不同來(lái)源黑芥子酶的添加對(duì)油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷降解產(chǎn)物的影響，研究表明，來(lái)源于西蘭花的黑芥子酶可導(dǎo)致硫苷的降解產(chǎn)物增加，尤其是抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)種類的增加；而來(lái)源于芥藍(lán)的黑芥子酶會(huì)大大提升異硫氰酸類化合物的產(chǎn)量。也有研究表明即使同一來(lái)源的黑芥子酶對(duì)不同結(jié)構(gòu)的硫代葡萄糖苷同樣存在著反應(yīng)底物的選擇性和活性差異[27]。黑芥子酶在植物的不同組織和發(fā)育階段有不同的生物活性，研究表明種子及幼苗時(shí)期黑芥子酶的活性最高[28]。另外，不同發(fā)育階段黑芥子酶的活性也有所差別，王志英等[29]研究?jī)煞N甘藍(lán)種子的發(fā)芽過(guò)程，發(fā)現(xiàn)黑芥子酶的活性分別在發(fā)芽第一天和第三天達(dá)到最高，且隨著種子發(fā)芽黑芥子酶的含量先上升后下降。

pH值、溫度、維生素C、壓力及光照等因素都會(huì)影響黑芥子酶的活性。研究表明，在pH值5～8的范圍內(nèi)，黑芥子酶可將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰酸酯，而pH值酸性環(huán)境中，黑芥子酶會(huì)誘導(dǎo)硫代葡萄糖苷水解成硫氰酸酯、腈類等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)[30]；黑芥子酶在高溫條件易變性失活，不同來(lái)源的黑芥子酶最適溫度不同，研究表明，甘藍(lán)源的黑芥子酶最適溫度為60℃，而辣根源的黑芥子酶最適溫度是35℃[31]；維生素C能夠激活黑芥子酶，不同來(lái)源的黑芥子酶最適的維生素C濃度不同[32]，丁艷等研究油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷的酶解條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的維生素C有激活黑芥子酶的功能，濃度增加后，異硫氰酸酯的生成量反而降低[33]；最新的研究表明，施加適度的壓力（200 MPa～400 MPa）可以有效保持黑芥子酶的活性，以便將其用于后續(xù)的硫代葡萄糖苷水解過(guò)程[34]；光照對(duì)黑芥子酶活性起著正調(diào)控作用[35]；另外，酶的底物也是影響黑芥子酶活性的重要因素[36]。

1.4 硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)

在植物細(xì)胞內(nèi)，硫代葡萄糖苷和黑芥子酶是彼此分離的，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，而黑芥子酶以黑芥子酶蛋白顆粒的形式存在于黑芥子酶細(xì)胞中。當(dāng)植物組織受到損傷或者病蟲侵害時(shí)，黑芥子酶被釋放出來(lái)，與硫代葡萄糖苷直接接觸，并使其降解為異硫氰酸酯、硫氰酸根離子、腈類、惡唑烷硫酮等有生物活性的物質(zhì)[37]。其中一些降解產(chǎn)物表現(xiàn)出毒素作用，可以抗病或抵御蟲的侵害，因此，硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)被認(rèn)為是十字花科植物重要的防御系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)十字花科植物與環(huán)境之間的相互作用，研究表明昆蟲、病原體、酸雨、干旱、鹽及重金屬脅迫會(huì)引起硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)的變化，從而影響植物防御[38]；硫代葡萄糖苷的降解產(chǎn)物還可以影響十字花科蔬菜的品質(zhì)，賦予其特有的氣味；另外，異硫氰酸酯具有殺菌、防癌等生物活性，目前的研究主要集中于其肺癌、血癌、食道癌及乳腺癌等方面的功效[39-42]。

2 黑芥子酶的提取及分離純化

現(xiàn)在應(yīng)用較普遍的是從十字花科種子中提取黑芥子酶，Ghawi等[43]在芥菜籽中提取出了黑芥子酶，提取方法為：首先將十字花科蔬菜的種子粉碎，取種子粉末加入緩沖溶液（pH為7.5，0.2 mol/L Tris-HCl，包含0.5 mmol/L EDTA、1.5 mmol/L二硫蘇糖醇、0.4 g交聯(lián)聚維酮），冰浴提取15 min后，低溫離心取上清，采用硫酸銨沉淀，冰浴30 min，使其飽和度達(dá)到90%，低溫離心，沉淀復(fù)溶于Tris-HCl緩沖液中，混合物采用纖維素膜和Tris-HCl緩沖液在4℃條件下透析24 h，以去除多余的硫酸銨等鹽類，離心去除不溶性雜質(zhì)，制備粗酶液，樣品冷凍干燥備用。

另外，也可以從十字花科植物的食用部分提取黑芥子酶。Jwannyd等[44]在辣根中分離出2種黑芥子酶；Okunade[34]在蘿卜根中提取出了黑芥子酶，并研究了在冷藏過(guò)程中的蘿卜中黑芥子酶的活性；從食用部分提取黑芥子酶大致的步驟與上述方法相同，只是前面的處理有些差異。提取方法[14]如下：取食用部分的組織用榨汁機(jī)榨汁，加入pH 7.2的提取緩沖液（10 mmol/L磷酸鉀，3 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA 和 5%甘油），在冰上以最大速度攪拌，用紗布過(guò)濾，再用低溫離心40 min，棄去沉淀，在上清液中加入適量硫酸銨以達(dá)到55%～85%飽和度，之后過(guò)Sephadex G-50凝膠色譜柱，用33 mmol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，最后將得到的黑芥子酶提取物濃縮后于-80℃放置，備用。

3 黑芥子酶的活性測(cè)定

黑芥子酶的活性主要通過(guò)測(cè)定葡萄糖的生成量或底物濃度變化來(lái)決定的，測(cè)定葡萄糖生成量可以用葡萄糖試劑盒、分光光度計(jì)和氣相色譜等方法。測(cè)量底物濃度的方法有：分光光度計(jì)和高效液相色譜等方法[45]。

3.1 測(cè)定葡萄糖的生成量

通過(guò)測(cè)定葡萄糖生成量來(lái)決定黑芥子酶的活性，最簡(jiǎn)單常用的方法是采用葡萄糖試劑盒，反應(yīng)完成后，在340 nm處測(cè)吸光度。黑芥子酶活力單位定義為：在pH7.5，25℃且底物為黑芥子硫苷酸鉀（sinigrin）的條件下，每分鐘催化底物得到1 μmol葡萄糖所需要黑芥子酶的量[34]。Ghawi等[46]用試劑盒測(cè)定綠色卷心菜中黑芥子酶活性時(shí)，采用的D-葡萄糖試劑盒，試劑盒反應(yīng)液為 1.51 mL，組成為：0.5 mL NADP 和 ATP、10 μL己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶、0.9 mL 7 mmol/L抗壞血酸水溶液及50 μL黑芥子酶樣品。之后讓反應(yīng)液平衡5 min，加入50 μL 0.6 mol/L黑芥子硫苷酸鉀溶液，此過(guò)程會(huì)生成NADP，導(dǎo)致吸光度的變化，最后在340 nm處測(cè)吸光度。Sooyeon等[47]測(cè)定蘿卜中黑芥子酶的活性也是采用葡萄糖試劑盒法。另外，通過(guò)分光光度計(jì)法及氣相色譜法測(cè)定葡萄糖的生成量是國(guó)內(nèi)外普遍的測(cè)量方法。需要注意的是，通過(guò)測(cè)定葡萄糖生成量來(lái)決定黑芥子酶活性的方法簡(jiǎn)便快速、容易操作，但需防止樣品中其他葡萄糖和糖苷鍵的干擾[48-49]。

3.2 測(cè)定底物濃度變化

測(cè)量底物濃度變化來(lái)決定黑芥子酶活性時(shí)，酶活力單位的定義為：在pH6.5，37℃條件下，每分鐘催化1 μmol的底物所需要酶的量[50]。測(cè)量底物濃度的方法有分光光度計(jì)法和高效液相色譜法等[45]。Li等[51]在研究從辣根中提取的黑芥子酶活性時(shí)，采用的是分光光度計(jì)法：反應(yīng)液由33.3 mmol/L pH6.5的磷酸緩沖液及0.2 mmol/L黑芥子硫苷酸鉀溶液組成，將反應(yīng)液加入到石英比色皿里，之后把比色皿放到37℃的分光光度計(jì)平衡1 min后，加入100 μL黑芥子酶提取液，每隔3 min在227 nm處測(cè)吸光度，之后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算酶的活性。另外，也有人采用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定底物濃度。但由于植物可能存在多種形式的硫代葡萄糖苷，所以采用測(cè)定底物濃度來(lái)決定黑芥子酶活性的方法在測(cè)量時(shí)容易遺漏部分硫代葡萄糖苷，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[48-49]。

4 黑芥子酶的應(yīng)用

4.1 在人體抗癌方面的應(yīng)用

雖然十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷及其代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯，可以發(fā)揮體內(nèi)抗氧化作用，有效降低多種癌癥的發(fā)病幾率[52]，但是我們?nèi)粘Ｊ秤玫氖只剖卟硕际羌訜崤胝{(diào)的，會(huì)使得可以將硫代葡萄糖苷高效降解的黑芥子酶變性失活，且硫代葡萄糖苷也有一定的損失，所以日常通過(guò)食物攝入的硫代葡萄糖苷利用率極低[53-55]。為了保證每日這種抗癌物質(zhì)的攝入，可以利用黑芥子酶在體外對(duì)硫代葡萄糖苷進(jìn)行高效降解，得到異硫氰酸酯等抗癌成分，制備成純制劑，每日進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)充[56-57]。因此，對(duì)黑芥子酶的深入研究及利用，對(duì)于更好地進(jìn)行人體抗癌防癌有很重要的意義。

4.2 油菜籽餅粕脫毒

油菜籽餅粕富含蛋白質(zhì)和氨基酸，但硫代葡萄糖苷的存在限制了其在食品及飼料方面的應(yīng)用，大量的油菜籽餅粕被用作肥料，造成了資源的浪費(fèi)。硫代葡萄糖苷雖然本身無(wú)毒，但油菜籽餅粕及牲畜腸道微生物中都含有黑芥子酶，能夠?qū)⒘虼咸烟擒战到馍煽範(fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，容易造成毒副作用[58]。因此，要想促進(jìn)油菜籽餅粕的利用，必須對(duì)其進(jìn)行脫毒，但如果采取強(qiáng)酸、高溫等條件，又會(huì)造成油菜籽餅粕中其他營(yíng)養(yǎng)成分的損失。采用外源黑芥子酶，對(duì)油菜籽餅粕進(jìn)行脫毒處理，條件溫和，既能降低硫代葡萄糖苷的含量，又能保護(hù)其他營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞[25]。丁艷等[26]比較分析了7種黑芥子酶降解油菜籽餅粕中的硫代葡萄糖苷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油菜籽黑芥子酶是較好的降解油菜籽餅粕中硫苷的酶源，雖然油菜籽黑芥子酶活性略低于西蘭花黑芥子酶，但其降解產(chǎn)物中腈類、惡唑類等有害物質(zhì)含量最低。

4.3 形成風(fēng)味物質(zhì)

黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物是形成十字花科植物風(fēng)味物質(zhì)的主要成分。研究表明，黑芥子硫苷酸鉀存在于雪菜中，本身并沒有味道，它是雪菜的風(fēng)味前體物質(zhì)。在雪菜的腌制過(guò)程中，由于植物組織細(xì)胞被破壞，使得黑芥子酶與硫代葡萄糖苷接觸，水解產(chǎn)生了異硫氰酸酯，具有辛辣味和芳香味。是形成雪菜典型風(fēng)味的主要物質(zhì)[59]。另外，芥末和辣根的辣味也是在黑芥子酶作用下產(chǎn)生的異硫氰酸酯類所形成的；榨菜的香味成分比較復(fù)雜，但經(jīng)鑒定其中由黑芥子酶與硫代葡萄糖苷作用下的水解產(chǎn)物所產(chǎn)生的睛類、異硫氰酸酯類等是使榨菜具有其特征香氣的主要成分[60-61]。

5 展望

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)黑芥子酶的研究日漸深入，不僅僅是黑芥子酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)方面，還有黑芥子酶基因的研究及克隆方面，都取得了大量的研究成果。但在以下兩個(gè)方面的研究有待加強(qiáng)：

1）酶的活性位點(diǎn)不同導(dǎo)致不同來(lái)源黑芥子酶對(duì)底物的選擇性存在明顯差異。酶活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)不同，造成了其在與硫代葡萄糖苷接觸反應(yīng)時(shí)，水解的能力存在差異，酶的活力也就不同。因此十字花科植物中黑芥子酶的活性位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

2）據(jù)目前的研究，黑芥子酶主要是從十字花科植物中來(lái)提取，工藝比較復(fù)雜，產(chǎn)量低，經(jīng)濟(jì)效益不高，并不能滿足產(chǎn)品生產(chǎn)的需要，迫切需要研究開發(fā)新的方法去大量生產(chǎn)所需的酶，比如利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建合適的工程菌等方法。

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The Research Progress of Myrosinase in Cruciferous Plants

SUN Yan-wei1，ZHANG Ze-sheng1，2，3，WANG Tian-xin1，2，*，LI Yu-meng1，QIN Cheng-guang1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Food Safety&Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，Tianjin 300457，China）

Myrosinase exists in cruciferous plants extensively and it catalyses the hydrolysis of glucosinolates.The myrosinase-mediated breakdown products of glucosinolates have been considered as promising compounds for fighting cancer，which has attracted much attention.In this review，myrosinase was firstly overviewed，including its distribution，structure，activity and so on.Then an introduction was made on the methods of myrosinase extraction and myrosinase activity array，followed by outlooks of its application and future direction in the research.

cruciferous plant；myrosinase；glucosinolate；research progress

2016-08-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.048

天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金（2015lG24）

孫艷偉（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。

*通信作者：王田心（1985—），男（漢），博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。