低溫對葡萄酒香氣成分和酵母代謝的影響

原苗苗，趙新節(jié)，孫玉霞

1(齊魯工業(yè)大學，山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南，250353)2(山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室，農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南，250100)

低溫對葡萄酒香氣成分和酵母代謝的影響

原苗苗1,2，趙新節(jié)1，孫玉霞2*

1(齊魯工業(yè)大學，山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南，250353)2(山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室，農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南，250100)

適當?shù)牡蜏孛{迫使酵母的代謝受到不同機制的調控而做出相應的反應，產(chǎn)生不同含量的代謝產(chǎn)物，進而影響葡萄酒的品質。低溫發(fā)酵有利于提高葡萄酒的香氣和感官特性，主要是乙酸酯和乙基酯類的增加，高級醇和揮發(fā)酸含量的降低。該文從葡萄酒香氣成分、相關代謝及基因表達的角度，分析低溫對葡萄酒品質的影響，并結合適合低溫發(fā)酵的非釀酒酵母，為低溫發(fā)酵葡萄酒提供理論依據(jù)。

低溫；葡萄酒；香氣成分；酵母；代謝；基因表達；非釀酒酵母

香氣是評判葡萄酒品質的重要特征之一。葡萄酒的香氣可以分為3類：品種香或初級香氣，由葡萄品種決定；發(fā)酵香或次級香氣，由酵母和細菌在酒精和乳酸發(fā)酵期間產(chǎn)生；陳釀香或三級香氣，源于陳釀過程中香氣物質之間的轉化。其中酒精發(fā)酵過程中微生物(主要是酵母菌)代謝產(chǎn)生的數(shù)百種化合物對葡萄酒的香氣成分起到了主導作用。

葡萄汁的化學成分和發(fā)酵條件是影響酵母菌代謝的2個最主要因素。通常認為，低溫用于葡萄酒發(fā)酵可以增加和更多地保留揮發(fā)性香氣成分，一個簡單的解釋可能是，低溫發(fā)酵保留的初級和次級風味物質比正常溫度發(fā)酵的高。因此，低溫發(fā)酵的葡萄酒的酒香和口感的提高可以歸功于萜類化合物更多的保留，揮發(fā)性酯類和C6-C10中鏈脂肪酸酯的產(chǎn)量增加，高級醇和揮發(fā)酸的含量降低。然而，溫度也會影響酵母的生長速度和發(fā)酵速率，溫度越低，發(fā)酵時間越長。發(fā)酵速率的變化也可以改變酵母和細菌的生態(tài)、乙醇敏感性和酵母代謝。雖然發(fā)酵溫度顯著影響酵母生長速率和其中心代謝[1]，但是發(fā)酵溫度對酵母增香化合物的生物合成途徑的影響仍不明確。

葡萄酒低溫發(fā)酵增加了發(fā)酵緩慢或停滯的概率，可以通過選擇適合低溫發(fā)酵的葡萄酒酵母來降低這些風險，同時保持良好的葡萄酒質量。一些非釀酒酵母(Non-Saccharomyces,NSC)比釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)能更好地適應低溫。NSC在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對葡萄酒風味物質的形成發(fā)揮著重要作用，尤其是發(fā)酵早期的NSC代謝作用會生成酯類、高級醇、甘油、醛和琥珀酸等影響葡萄酒感官特點的重要成分使葡萄酒具有更加復雜的口感和香氣。

本文綜述了低溫對葡萄酒香氣成分的種類和含量的影響，低溫對香氣成分相關的代謝途徑、關鍵酶及其基因表達的影響，以及適合低溫發(fā)酵的非釀酒酵母，旨在為更好地研究低溫下的發(fā)酵機制，提高葡萄酒品質提供理論依據(jù)。

1 低溫對葡萄酒香氣成分的影響

由葡萄酒酵母合成的揮發(fā)性化合物包括高級醇(雜醇、杏仁和花香)，中鏈和長鏈揮發(fā)酸(脂肪、干酪和汗味)，乙酸酯和乙基酯(果香和花香)，醛類(奶油、水果和堅果的芳香)等等。

1.1 醇類

高級醇可以通過合成代謝由糖代謝中間體合成，或者通過多步代謝反應——艾利希途徑，由支鏈氨基酸合成。丙醇和異丁醇在0～5 ℃質量濃度極低，檢測到的最高質量濃度為48 mg/L；戊醇的濃度隨著溫度的降低而降低，0 ℃發(fā)酵時戊醇的產(chǎn)量約為30 ℃的1/10。低溫通常導致高級醇濃度的降低，這被認為對產(chǎn)品質量有積極影響。

1.2 酯類

低溫發(fā)酵的葡萄酒中，酵母產(chǎn)生的花香(脂肪酸乙酯)和果香(乙酸酯)增加，并且保持著高水平的品種香氣(萜類)。這是由于揮發(fā)性化合物的穩(wěn)定性增加，蒸發(fā)損耗減少，以及酵母的代謝差異，即改變脂肪酸合成來改變細胞膜的組成。乙酸酯類是由高級醇和乙酰輔酶A縮合而成的。這個反應由基因ATF1和ATF2編碼的乙?；D移酶催化的；此外，IAH1和TIP1 編碼的酯酶對葡萄酒中乙酸酯的最終濃度也有重要的影響[2-4]。乙基酯類，如丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和乳酸乙酯，給葡萄酒帶來理想的果香和花香。它們是乙醇和?；o酶A縮合產(chǎn)生的，是由?；D移酶催化的反應，這些?；D移酶是由基因EHT1、EEB1和YMR210W編碼的[3-6]。同樣葡萄酒中乙基酯的最終濃度也與由IAH1和TIP1編碼的酯酶密切相關[2-4]。

15 ℃和28 ℃兩個發(fā)酵溫度的最大差異在于乙基酯的產(chǎn)量[7]，它在15 ℃時濃度非常高，這與其他研究葡萄酒揮發(fā)性化合物的報告一致[8]。4種有積極感官作用的揮發(fā)性化合物在28 ℃的濃度明顯高于 15 ℃，分別是乙酸-2-甲基丁酯、2-甲基丁酸乙酯 (香蕉和菠蘿的果香)、2-苯乙醇和2-苯乙醇乙酸酯 (花香)。GAMERO等人的實驗結果表明[9]，大多數(shù)菌株在28 ℃時乙酸酯的產(chǎn)量增加，即使其相應的醇在 12 ℃產(chǎn)量高，這可能表明在較高的溫度下增加了乙酰轉移酶 (ATF) 的活性。除癸酸乙酯外，在低溫發(fā)酵明顯更有利于乙基酯生產(chǎn)[9]。

1.3 酸類

揮發(fā)性脂肪酸也有助于葡萄酒的香氣。脂肪酸是細胞膜的重要成分和更復雜分子的前體，如磷脂。它們是通過乙酰輔酶A的重復縮合，由脂肪酸合成酶復合體催化合成。

蘋果酸、乙醇和一些高級醇 (異丁醇和異戊醇) 的含量隨溫度升高而增加。乙酸的濃度在低溫下減少。琥珀酸的濃度在21 ℃也很高。對有機酸進行主成分分析時，沒有觀察到明顯的分組；高級醇也得出了同樣的結論。溫度對自然發(fā)酵的葡萄酒的影響較大，這可能是由于溫度和其他因素之間的相互作用，例如葡萄表皮天然存在的酵母種群。18 ℃適宜發(fā)酵，因為高級醇和有機酸的含量是適當?shù)?。不管使用何種酵母，稍微低于20 ℃的溫度是葡萄酒發(fā)酵的最適溫度。

酵母細胞適應低溫條件的一個策略是增加中鏈脂肪酸(MCFA)的百分比。如果 MCFA 的增加是低溫生長的菌株中最顯著的變化，那么辛酸(C8)的存在是耐冷酵母Saccharomyceskudriavzevii與S.cerevisiae相比最主要的特征[10]。

細胞質膜脂肪酸分析表明，干酵母具有相似的不飽和度水平，介于70%和80%之間，無中鏈脂肪酸 (MCFA)，長鏈飽和脂肪酸 (SFA) 是整個發(fā)酵中最頻繁的膜脂肪酸。脂質成分隨生長溫度的變化而改變。S.cerevisiae菌株通過脂肪酸不飽和度的變化對低溫下的最佳膜流動性進行調節(jié)。然而，沒有觀察到Saccharomycesbayanus在不同生長溫度下不飽和脂肪酸 (UFA) 百分比的變化，但其 MCFA 在低溫下的濃度較高。

1.4 其他香氣成分

一般來說，乙醛和乙酸的減少是低溫發(fā)酵的主要優(yōu)點之一。預適應接種產(chǎn)生的乙醛和乙酸比只使用發(fā)酵起始劑的含量低。

在一些“簡單”或“非芳香”葡萄品種，如長相思葡萄，在酒精發(fā)酵過程中所合成的特征性品種香氣，被證明是揮發(fā)性硫醇[11]。3種主要的揮發(fā)性芳香硫醇——4-巰基-4-甲基異丁基酮(4MMP)、3-巰基-1-己醇(3MH)和 3-巰基己醇乙酸酯 (3MHA)，被認定為構成這種葡萄酒的“黃楊樹”、“葡萄柚”和“百香果”的特點。這些化合物也存在于瓊瑤漿、雷司令、鴿籠白、小芒森、赤霞珠和美樂葡萄釀造的葡萄酒中。2種硫化合物 (4MMP和3MH)以硫-半胱氨酸共軛物的非揮發(fā)形式存在于葡萄汁中。揮發(fā)性硫醇在酒精發(fā)酵期間被酵母從相應的硫-半胱氨酸共軛物釋放[11]。最近使用遺傳篩選手段的研究鑒定出試驗菌株的4個基因影響揮發(fā)性硫醇4MMP的釋放。然而，酵母半胱氨酸相關前體轉化為香氣的機制尚不清楚。

當酒精發(fā)酵在20 ℃時，葡萄酒的4MMP和3MH的最終濃度比13 ℃的高。之前HOWELL等在合成培養(yǎng)基中研究了發(fā)酵溫度(18和28 ℃)對不同酵母菌株4MMP釋放量的影響，發(fā)現(xiàn)高溫(28 ℃)對2株酵母的4MMP水平有積極的影響。發(fā)酵溫度28 ℃與18 ℃的這些比較結果與發(fā)酵溫度20 ℃和13 ℃的結果一致。

在MASNEUF等的研究中，3MHA的濃度在高溫發(fā)酵的樣品中較高[12]。3MHA的水平也與3MH的數(shù)量密切相關。因此，對3MHA來說，溫度似乎沒有影響酵母代謝，但通過3MH的濃度間接影響3MHA的水平。

2 低溫對酵母代謝及相關基因表達的影響

EUGENIA等對與Saccharomycesbayanusvar.uvarum釀酒特性相關的蛋白質組結果進行了分析[13]。分子功能的蛋白質分類顯示13 ℃條件下有24種不同的類別，其中8種是13 ℃獨有的；而在25 ℃條件下確定了16種不同的類別，但它們都不是獨有的。這些13 ℃獨有組是(1)抗氧化活性；(2)氨基酸結合；(3)異構酶活性；(4)連接酶活性；(5)蛋白標記；(6)肽結合；(7)核糖核蛋白復合體結合；(8)金屬簇結合；占總數(shù)的10%。特別令人感興趣的代表是抗氧化活性組，能夠去除細胞中的自由基，以減少分子損傷。正如先前所述，葡萄酒是天然化合物的混合，如黃酮類和多酚類，具有重要的抗氧化活性。他們的數(shù)據(jù)支持了低溫發(fā)酵時生產(chǎn)這些化合物的酶體系上調的假說。

生物過程的基因本體分類發(fā)現(xiàn)了70類：27類是13 ℃下獨有的，17類是25 ℃下獨有的。所描述的類別數(shù)量很高，表明葡萄酒發(fā)酵過程中不同蛋白質活動的變化。通過對13 ℃下的類別進一步檢查， 有許多代謝過程涉及葡萄酒香氣， 如(1)細胞醛代謝過程；(2)細胞脂代謝；(3)脂代謝過程；(4)細胞芳香化合物代謝過程；(5)氮化合物代謝過程。大多數(shù)的獨有類別構成了有助于積累葡萄酒香氣等代謝產(chǎn)物的主要途徑，直接關系到葡萄酒的質量。

對于25 ℃條件下，所描述的專屬類別是：(1)發(fā)酵；(2)細胞生長；(3)多糖代謝過程；(4)能量儲備/代謝過程；(5)乙醇代謝過程，所有這些類別都涉及到發(fā)酵過程的不同步驟，從細胞生長到乙醇的合成。

耐冷酵母S.bayanusvar.uvarum在13 ℃表達上調的蛋白質是丙酮酸脫羧酶、甘油-1-磷酸水解酶2、乙醛脫氫酶(Ald6p、Ald3p)、硫胺素合成酶(Thi13p)、羥甲基轉移酶和蛋氨酸合成酶，包括芳香化合物的代謝。這些酶活性促進了甘油、異戊醇和 2-苯乙醇乙酸酯的合成代謝，與S.bayanusvaruvarum在13 ℃發(fā)酵的葡萄酒中獨特的感官特征具有一致性。

2.1 糖代謝

葡萄汁中的主要糖類，葡萄糖和果糖發(fā)酵成乙醇和CO2為酵母生長提供能源和碳化合物。葡萄酒釀造過程主要是葡萄汁中的糖類轉化成乙醇。酵母的糖代謝是主要代謝過程，決定最終乙醇含量，并在很大程度上決定葡萄酒的感官特征。在酵母乙醇發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵作用和其他代謝活動同時存在，酵母除了將葡萄汁中92%～95%的糖發(fā)酵成乙醇、CO2和熱量外，還能夠利用另外5%～8%的糖產(chǎn)生一系列其他化合物，即乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物。其中最主要的副產(chǎn)物為甘油和乙酸，其次是以酯類為主的香氣物質。

甘油是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要代謝物之一，為葡萄酒品質帶來甘甜、柔順和豐滿的口感，降低葡萄酒的澀味。甘油參與酵母的滲透調節(jié)和對低溫生長的適應。甘油的產(chǎn)生平衡了胞內NADH/NAD的比值,并且甘油和海藻糖一樣,可以充當抗凍劑。S.cerevisiae甘油的合成是通過NAD+依賴的3-磷酸甘油脫氫酶 (GPD基因編碼)催化磷酸二羥丙酮 (DHAP) 的還原，然后由3-磷酸甘油磷酸酶 (GPP基因編碼)催化3-磷酸甘油脫磷酸產(chǎn)生的。實驗證明低溫誘導細胞內甘油的合成是立即被激活的，而且4 ℃比12 ℃的產(chǎn)量更高[14]。

乙酸是主要的揮發(fā)酸，給葡萄酒帶來不良的感官性質。葡萄糖在糖酵解途徑中產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶作用下產(chǎn)生乙醛，再經(jīng)乙醛脫氫酶產(chǎn)生乙酸。細胞質乙醛脫氫酶異構體由ALD2、ALD3和ALD6編碼。ALD4 和ALD5編碼線粒體乙醛脫氫酶異構體，在以乙醇為碳源的情況下發(fā)揮作用。ALD2和ALD3的表達受葡萄糖抑制。來源于酵母乙酸代謝的香氣成分(如乙酸乙酯和乙酸異戊酯)由位于脂質顆粒的醇乙?；D移酶(由ATF1編碼)作用產(chǎn)生[9]。

另外，S.cerevisiae面對從營養(yǎng)限制到溫度改變的環(huán)境變化時會積累諸如糖、糖原和海藻糖，還有甘油等物質[15]。與此相符，面包酵母(Baker’s yeast)分別在10 ℃和0 ℃培養(yǎng)后，觀察到糖原和海藻糖的累積。高含量的海藻糖已被證明保護細胞免受凍傷；事實上，在冷凍和解凍后，無法累積海藻糖的突變體會更迅速地死亡。

復雜的轉錄和翻譯后修飾機制調節(jié)儲備糖(reserve carbohydrates)的合成和降解，聯(lián)合控制S.cerevisiae的代謝與細胞生長。D.bruxellensis和S.cerevisiae在儲備糖代謝動力學上的差異可能對糖酵解代謝流的控制有重要影響，值得進一步研究。暴露在寒冷中并沒有使D.bruxellensis胞內海藻糖水平有任何上升，相反，糖原得以積累。這種情況與S.cerevisiae不同，已經(jīng)證明低溫時S.cerevisiae的這兩種糖含量都增加了，未檢測到D.bruxellensis胞內甘油的累積，這與報道過的S.cerevisiae的相反[14]。

4 ℃處理激發(fā)了D.bruxellensisHOG(高滲透壓甘油)MAP激酶途徑的活化。低溫脅迫時S.cerevisiae通過降低膜流動性來激活此途徑，與高滲透壓脅迫和二甲基亞砜處理的結果一致，它們都產(chǎn)生相同的刺激來誘導這條途徑[16]。

S.bayanusvar.uvarum、S.kudriavzevii和S.cerevisiae3個菌種的總體代謝比較結果顯示,2個耐冷菌種和S.cerevisiae的主要區(qū)別是糖代謝[17]。Sk和Su菌株有較高含量的葡萄糖和果糖，并且大多數(shù)的中間體位于糖酵解(C6糖)、戊糖磷酸途徑和海藻糖代謝的上游部分，也就是說這些菌株在較低溫度有較高的糖吸收。Sk和Su高濃度的葡萄糖、果糖和其他生化途徑的中間體可能與緩慢的糖酵解代謝有關，主要是己糖轉化成丙糖的水平(釀酒酵母中濃度更高)。

2.2 氮代謝

葡萄汁中的氮由有機氮(氨基酸)和無機氮(銨)組成。最佳發(fā)酵溫度的研究表明銨是生物量生產(chǎn)首選的氮源，而氨基酸是穩(wěn)定期優(yōu)先利用的，其中大部分的氮化合物是專門用于細胞維持。然而，在BELTRAN等[18]的研究中，氨基酸在低溫發(fā)酵過程中的指數(shù)階段消耗殆盡。在S.cerevisiae全部轉錄的分析中，當生長溫度從30 ℃降低到10 ℃時，與氮運輸和氨基酸代謝相關的基因大量上調。對這種不同的氮消耗量的一個解釋可能是在低溫下糖緩慢地流入糖酵解途徑(緩慢的發(fā)酵速度)，這導致可用于氨基酸生物合成的碳骨架不足。

13 ℃發(fā)酵時香氣物質產(chǎn)量的增加可能部分由于其合成基因表達的差異，參與埃利希路徑氨基酸代謝的基因，如BAT2(編碼細胞質轉氨酶異構體)，PDC6(編碼少量的丙酮酸脫羧酶異構體)和ADH6(編碼NADP依賴的乙醇脫氫酶)，以及那些涉及支鏈氨基酸降解的基因(ILV2、ILV5和ILV6)，都在13 ℃發(fā)酵的中后期比在25 ℃表達的更高。

酵母代謝主要依靠透過酶來驅動養(yǎng)分的攝取。膜透性酶的溫度依賴性很高，因為溫度的變化會導致它們結構的構象變化。GAP1和MEP2，編碼2個分別運輸氨基酸和銨的重要透性酶，是富氮培養(yǎng)基中氮代謝抑制(NCR)機制使基因下調的好例子。

在氨基酸消耗過程中，存在2種溫度下氨基酸消耗量的差異。谷氨酰胺和色氨酸是發(fā)酵中消耗的主要氨基酸(超過50%)。谷氨酰胺在25 ℃的消耗量比13 ℃多，而色氨酸在低溫下消耗較多。在低溫生長中，色氨酸的攝取是限速步驟。編碼高親和力的色氨酸透性酶Tat2p的基因過量表達賦予酵母細胞良好的低溫生長能力。在低溫下攝取增多的是精氨酸和谷氨酸。當細胞放到氮抑制的環(huán)境時這些氨基酸的攝取被抑制。

另一個重要發(fā)現(xiàn)是發(fā)酵溫度影響NCR的機理。細胞對氮的攝取由被稱為氮代謝抑制(NCR)的機制調控。當培養(yǎng)基中存在良好的氮源時，一些涉及較差的氮源的吸收和利用的基因轉錄受到抑制，其相應的產(chǎn)物被滅活和降解。NCR通過抑制一些利用較差的氮源的基因轉錄使細胞能夠選擇最好的氮源。乙醇的存在也影響NCR的有效性。乙醇毒性和低溫的一個共同特征是細胞的膜組成被修改，可能極大地削弱了膜功能。因此，主要位于細胞質膜的氮源的傳感系統(tǒng)可能受到這兩種情況的影響。

綜上所述，發(fā)酵溫度對菌株的氮調控有影響。低溫生長的細胞中決定有機/無機氮消耗量的比值和氨基酸消耗模式的NCR系統(tǒng)不太有效。低發(fā)酵溫度對酵母細胞的影響與限氮的葡萄汁的作用相似。最可信的解釋是低溫降低膜的流動性，這影響透性酶的活性和氮的攝取。

2.3 脂代謝

細胞的存活取決于他們快速適應變化的環(huán)境的能力。細胞質膜組成的變化可能是酵母的適應反應，因為它明顯受環(huán)境因素的影響，如溫度、氧氣、營養(yǎng)限制和生長率。這些細胞質膜的變化主要是脂質成分的改變。真核生物細胞膜的主要脂質成分為磷脂、甾醇、鞘脂和甘油脂。酵母的膜脂肪酸組成，和許多其他微生物的一樣，溫度越低膜脂肪酸組成越不飽和。

溫度明顯影響酵母的生長和發(fā)酵動力學。在2種培養(yǎng)基中25 ℃時的發(fā)酵率和最大酵母數(shù)量比13 ℃的高，但13 ℃的細胞活力高于25 ℃的。酵母在低溫下的活力更好可能與細胞膜的不同組成有關。酵母低溫發(fā)酵顯示了2種調節(jié)膜流動性的替代策略：要么增加不飽和脂肪酸組成，要么增加中鏈脂肪酸(MCFA)。增加酵母細胞中脂肪酸的不飽和度能改善乙醇耐受性和提高細胞活力。

此外，TAI等人[19]觀察到，通常在低溫恒化器和分批培養(yǎng)的研究中只有參與脂質代謝的基因組是明確的。低溫培養(yǎng)通過僵硬化來增加膜脂分子的需求。據(jù)說酵母已經(jīng)形成了幾個策略來保持細胞膜適當?shù)牧鲃有?。最常研究的涉及到增加脂肪?FA)的不飽和度和減少平均鏈長[20]。LPEZMALO等[17]的數(shù)據(jù)揭示了細胞在低溫下生長會增加不飽和脂肪酸(UFA) C14和C16(十四碳烯酸和棕櫚油酸)，但降低其他不飽和脂肪酸(亞油酸C18:2和亞麻酸C18:3)。結果是脂肪酸鏈長的總體減少作為提高膜流動性的主要策略。12 ℃下培養(yǎng)的細胞內中鏈脂肪酸(MCFA)辛酸(C8:0)的增加也支持了這一結果。

12 ℃生長的S.cerevisiae產(chǎn)生的磷脂酰膽堿(PC) 的代謝產(chǎn)物含量較低，如甘油磷脂酰膽堿(GPC)、2-棕櫚酰甘油磷脂酰膽堿和1-油酰甘油磷酰膽堿。REDON等人[21]和TRONCHONI等人[10]也報道了在低溫培養(yǎng)時這種菌的磷脂酰膽堿(PC)/磷脂酰乙醇胺(PE)的比率降低。至于甾醇途徑，為抵消12 ℃生長的細胞的膜硬度的措施是增加麥角甾醇，并且降低其中間體角鯊烯和羊毛甾醇。

肌醇是酵母細胞必不可少的一種磷脂前體，可以構成磷脂酰肌醇(PI)、鞘脂和糖基磷脂酰肌醇的錨點。眾所周知，磷脂成分在適應低溫發(fā)酵中起著至關重要的作用[22]。LPEZ-MALO等[22]的研究結果為細胞在低溫生長時對肌醇更高的需求提供了清楚的證據(jù)。在低溫和肌醇限制的條件下，選育出一株商業(yè)葡萄酒酵母，與親本菌株相比，這個菌株的生長能力和發(fā)酵活性在低溫下都得到了提高，具有明顯的生理上和分子上的變化。在合成 PI中使用的肌醇要么來自6-磷酸葡萄糖，要么來自培養(yǎng)基。然而，沒有檢測到肌醇生物合成基因或運輸基因的轉錄組和基因組的改變。唯一的例外，可能是在馴化菌株中觀察到的GIT1的劇烈下調。這個基因編碼細胞質膜透性酶，此酶能調節(jié)作為肌醇和磷酸鹽來源的甘油磷酸肌醇和甘油磷酰膽堿的吸收。這個菌株的肌醇需求較低，可能會導致用作肌醇來源的化合物進行轉運的基因的下調。

2.4 其他代謝

上述低溫馴化菌株的另一種代謝變化是胞外和胞內甘露糖蛋白含量的增加。這些甘露糖蛋白通過糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 連接到細胞壁，并且對細胞壁的完整性和細胞生存能力是必要的。盡管 GPI 靶點蛋白的合成不足與低溫下的適應性低可能有聯(lián)系，但研究結果表明，甘露糖蛋白直接參與寒冷適應。在馴化菌株中，甘露糖蛋白基因的過度表達與細胞壁中甘露糖蛋白含量的增加和發(fā)酵末期釋放的甘露糖蛋白增加有關。膜脂成分的改造能力和更好的甘露糖蛋白合成能力似乎對于這個菌株的寒冷適應至關重要。

谷胱甘肽/谷氧還蛋白系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物是區(qū)別生長在12 ℃和28 ℃的S.cerevisiae的另一組代謝產(chǎn)物，能幫助細胞解活性氧(ROS)的毒。溫度從30 ℃降到10 ℃時，SOD1、CTT1 和 GSH1 的 mRNA 水平顯著升高。谷胱甘肽/谷氧還蛋白系統(tǒng)的基因轉錄性能在 LCR(Late Cold Response抗冷反應后期)期間被激活。在同一葡萄酒酵母對低溫反應的蛋白質組研究中，SALVADO等[23]也檢測到更高的濃度 Yhb1(酵母類血紅蛋白樣的蛋白質)，有抗氧化脅迫功能。

3 適合低溫發(fā)酵的非釀酒酵母

葡萄汁發(fā)酵是一個由不同種屬的酵母順序作用的復雜的過程，早期階段由NSC的生長支配，隨后利用S.cerevisiae[25]。雖然S.cerevisiae在葡萄酒發(fā)酵中始終占據(jù)主導地位，但溫度的下降會影響其競爭力。顯而易見，降低溫度的直接效應是減緩酵母細胞的代謝活動，這就會導致低溫時生長量的減少和發(fā)酵過程的延長。浸漬技術，特別是發(fā)酵前冷浸漬，對發(fā)酵初始階段葡萄汁中微生物的組成和性質起關鍵作用[26]，已經(jīng)證明了低溫能改變S.cerevisiae和NSC之間的競爭，可能導致培養(yǎng)基中S.cerevisiae的一些必需營養(yǎng)物不足[27]，這可能由于一些NSC的親糖性質或S.cerevisiae受到NSC釋放的乙醛和乙酸的抑制[28]。對這一時期種群變化的理解是至關重要的，因為任何變化都可能影響酒精發(fā)酵性能和獲得的葡萄酒的質量[29]。

盡管使用純培養(yǎng)的S.cerevisiae有容易控制和發(fā)酵一致的優(yōu)點，用純種酵母單一培養(yǎng)生產(chǎn)的葡萄酒缺乏本土酵母帶來的復雜的風味，風格上的獨特性和年份的變化。這一事實引起研究者和釀酒師之間無休止的爭論，NSC的生長仍然被認為是不可控制的風險或提高葡萄酒質量的機會。不過值得注意的是，世界上許多品質上乘葡萄酒的發(fā)酵過程中有不同種類的NSC在其中或多或少地發(fā)揮了作用，因此，使用NSC與S.cerevisiae的混合發(fā)酵被認為是一種用來提高葡萄酒質量的有效方式，而又可以減少產(chǎn)生發(fā)酵中止或酒變質的風險[30]。然而這種做法為研究人員和釀酒師帶來新的挑戰(zhàn)，如選擇合適的NSC菌株、合適的接種方式和接種時間，各種酵母的比例以及潛在的微生物相互作用等。

3.1 耐冷酵母

一些種類的NSC比S.cerevisiae能更好地適應低溫，耐冷酵母Saccharomycesbayanusvar.uvarum和Saccharomyceskudriavzevii就是這樣。S.uvarum(Saccharomycesbayanusvar.uvarum)更耐冷，可以產(chǎn)生較少的乙酸，降低戊醇含量，但甘油、琥珀酸、蘋果酸、異丁醇、異戊醇和許多次級化合物的含量較高。由S.uvarum菌株生產(chǎn)的葡萄酒的芳香強度高于S.cerevisiae生產(chǎn)的葡萄酒[31]，具體地說，S.uvarum產(chǎn)生的 2--苯乙醇、2-苯乙醇乙酸酯和乳酸乙酯含量較高[32]。

3.2 漢遜酵母

NSC對葡萄酒感官品質的影響一般與釀造過程中它們的存在和持續(xù)性有關[33]。在14±1 ℃下冷浸漬顯示，酵母總數(shù)顯著增加，相應地這也反映在糖消耗上，14±1 ℃ 發(fā)酵前冷浸漬促進了Hanseniaspora的選擇性生長，主要是H.uvarum和Candida較小程度的生長，特別是C.zemplinina。與這些觀察一致，其他應用不同的前發(fā)酵低溫 (10～15 ℃) 的研究得出結論中冷浸漬有利于H.uvarum的發(fā)展[26]。然而其生長對葡萄酒感官品質的影響有很大的爭議[30,34]。很有可能，H.uvarum對葡萄酒品質的貢獻或危害主要取決于種群的大小。在目前的研究中，發(fā)酵前冷浸漬過程中觀察到的Hanseniaspora比例較高，可能與葡萄酒酸度和苦味的增加有關。

3.3 假絲酵母

冷浸漬期間第二個數(shù)量上增加的NSC是C.zemplinina，最初被發(fā)現(xiàn)于貴腐葡萄中。據(jù)報道，它是耐滲透壓和親果糖的，通常生產(chǎn)少量的乙酸和大量的甘油[35]，這一結果與ZOTT等[36]一致， 他報告了C.zemplinina在4 ℃和10 ℃紅葡萄汁冷浸漬中的優(yōu)勢地位。其他研究也描述了C.zemplinina生產(chǎn)高濃度的丙酮酸，在與S.cerevisiae順序發(fā)酵和純培養(yǎng)發(fā)酵時增加葡萄酒中Vitisin A的水平[37]，低溫浸漬過程中存在的高比例的C.zemplinina和S.cerevisiae種群可以提高赤霞珠和馬爾貝克葡萄葡萄酒的色度和紫色色調。

一些假絲酵母屬(Candida)已被公認為能耐受釀酒條件，與S.cerevisiae一起進行葡萄汁混合發(fā)酵[38]，也有研究者報道了這些酵母在低溫發(fā)酵葡萄酒中的應用[39]，發(fā)現(xiàn)Candida能積極影響葡萄酒活性生物大分子的組成，如多糖和甘露糖蛋白[40]，從而增加了葡萄酒品質提升的可能性。

3.4 畢赤酵母

發(fā)酵前冷浸漬期間也存在5種Pichia酵母，由于能產(chǎn)生揮發(fā)酚和菌膜，一些Pichia酵母并不受歡迎[41-42]。然而某些Pichia酵母的重要性已經(jīng)吸引了研究者的興趣，因為它們可以促進葡萄酒的香味和口感特性[43]。Pichia酵母屬以其所生產(chǎn)的乙酸乙酯脫穎而出[44]，并能產(chǎn)生大量的乙酸異戊酯。

3.5 克勒克酵母

MENDOZA等[45]發(fā)現(xiàn)，在S.cerevisiae和Kloeckeraapiculata混合培養(yǎng)中，Kloeckeraapiculata在15 ℃獲得最高的生物量，而S.cerevisiae的最大生物量在25 ℃。HEARD和FLEET[46]觀察到Kloeckeraapiculata在20 ℃以下發(fā)酵時生長和生存的更好，在10 ℃發(fā)酵時占主導地位。

各種NSC，如Candida,Hanseniaspora和Pichia，在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的多糖總量高于S.cerevisiae[40,47]。與此一致，在14 ℃下進行發(fā)酵前冷浸漬的赤霞珠葡萄酒中，NSC數(shù)量大，產(chǎn)生的多糖含量高，葡萄酒收斂性低。

4 結論與展望

對于葡萄酒，其獨特的香氣是揮發(fā)性的品種香氣和發(fā)酵香氣相結合的結果。一般來說，在低溫下生產(chǎn)的葡萄酒有更多的果香味，這是由于酯的合成增加或轉化降低。低溫發(fā)酵時乙酸酯(乙酸異戊酯和乙酸己酯)和脂肪酸乙酯的含量比20 ℃高，而醛酮類、揮發(fā)性酸和雜醇含量低。此外，降低發(fā)酵溫度導致短鏈脂肪酸(C4-C8)乙酯的產(chǎn)量顯著增加。在低溫下也保持了品種香氣(萜烯，不由酵母合成)的水平，這使得我們更容易辨別出低溫和常溫發(fā)酵的葡萄酒的味道。這些結果說明了發(fā)酵溫度在最終葡萄酒的酒香成分中的重要性，這不僅與溫度依賴性的香氣有關，而且還與酵母細胞的重要代謝干預有關。

酵母在低溫有較高的糖吸收，糖酵解緩慢，海藻糖、糖原等儲備糖合成增加，HOG-MAPK途徑被激活，甘油產(chǎn)量增加。低溫使酵母對氮的喜好改變，降低了NCR系統(tǒng)的有效性，影響透性酶活性和氮的攝取。參與艾利希途徑氨基酸代謝的基因在低溫發(fā)酵中后期表達量較高。低溫影響酵母細胞膜脂肪酸組成，主要是通過減小鏈長，增加中鏈脂肪酸來提高膜流動性。低溫對酵母糖代謝、氮代謝和脂代謝的這些影響，有利于提高葡萄酒的感官特性。

盡管在過去幾年中研究者已使用轉錄組學或蛋白質組學等高通量方法來闡明釀酒酵母對低溫的反應，這些代謝變化可能是由于溫度對酵母轉錄和(或)轉錄后的作用。然而一個代謝產(chǎn)物的合成與降解可能有多個基因參與，驗證并明確其與溫度密切相關的關鍵基因及其調控因子仍然是今后工作的重點。目前對低溫的研究主要集中在S.cerevisiae方面。實際上葡萄酒生產(chǎn)國依靠NSC(分離于葡萄表皮、葡萄園土壤、發(fā)酵葡萄汁)自然發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒無論在復雜感、結構、香氣、地域特色等方面都具有一定的優(yōu)勢。NSC具有多樣的產(chǎn)酶能力和獨特的生物轉化能力，對生產(chǎn)具有獨特芳香的葡萄酒極具開發(fā)潛力，NSC能分泌果膠酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白質水解酶等多種胞外酶，產(chǎn)生醇類、酯類、酸類、萜烯類等風味成分。因此對于NSC及其對葡萄酒品質影響的研究具有深遠的意義。但低溫對NSC香氣生產(chǎn)及其代謝機理的研究很少，可以先從酶學水平上探究其對香氣成分代謝的影響，再從分子水平上進行進一步研究。

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Theeffectsoflowtemperatureonwinearomacompoundsandyeastmetabolism

YUAN Miao-miao1,2,ZHAO Xin-jie1,SUN Yu-xia2*

1 (Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China ) 2 (Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of Novel Food Resources Processing,Ministry of Agriculture,Jinan 250100,China)

Proper low temperature stress can influence yeast metabolism through different mechanisms,and different amounts of metabolites will be produced due to corresponding reaction,thereby the quality of the wine will be changed.Low temperature fermentation can improve wine aromas and organoleptic properties,mainly increasing the contents of acetate and ethyl esters and decreasing the contents of higher alcohols and volatile acids.In order to provide some reference for low temperature fermentation,the studies focused on wine aroma components,relative yeast metabolism and gene expression were reviewed herein.The influence of low temperature on wine quality was analyzed and combined with non-Saccharomyces cerevisiae suitable for low temperature fermentation.

low temperature; wine; aroma components; yeast; metabolism; gene expression; non-Saccharomyces cerevisiae

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014924

碩士研究生(孫玉霞副研究員為通訊作者，E-mail：sunyuxia1230@163.com)。

山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GNC113010)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項基金(SDAIT-06-14)

2017-06-08，改回日期：2017-09-12