玉米紋枯病生防菌DZSY21的抗病機(jī)制

蘇 博，江胡彪，喬建禮，潘 潔，許 偉，武安寧，丁 婷，*

(1.安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036； 3.南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植保農(nóng)化研究所，河南 南陽(yáng) 473083)

玉米紋枯病生防菌DZSY21的抗病機(jī)制

蘇 博1，江胡彪2，喬建禮3，潘 潔2，許 偉2，武安寧2，丁 婷2，*

(1.安徽省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036； 3.南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植保農(nóng)化研究所，河南 南陽(yáng) 473083)

為明確杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSY21對(duì)玉米紋枯病的抗病機(jī)制，利用抗生素標(biāo)記法分析了DZSY21菌體在玉米葉鞘組織中的定殖情況，通過(guò)小區(qū)接種試驗(yàn)，研究不同生育期玉米葉鞘引入DZSY21對(duì)玉米抗紋枯病的作用，并采用分光光度法和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同生育期玉米葉鞘組織中的多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶活性以及PR-1、PR-2a基因的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明：菌株DZSY21引入玉米葉鞘后，可在其體內(nèi)定殖，與玉米葉鞘組織形成和諧的共生關(guān)系，在一定程度上增強(qiáng)玉米對(duì)紋枯病的抗性；DZSY21在玉米葉鞘的定殖能提高玉米葉鞘組織防御酶PPO、POD和PAL的活性，同時(shí)誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達(dá)。該研究結(jié)果為揭示生防細(xì)菌DZSY21的生防機(jī)理及應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

玉米紋枯病；多酚氧化酶；過(guò)氧化物酶；苯丙氨酸解氨酶；防衛(wèi)反應(yīng)基因；定殖

玉米紋枯病(maize sheath blight)是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的土傳性病害，在國(guó)內(nèi)外玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生且危害嚴(yán)重，嚴(yán)重制約玉米產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的提高。目前，主要是利用化學(xué)藥劑防治該病，然而化學(xué)農(nóng)藥在使用過(guò)程中容易造成環(huán)境污染、藥害、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)、農(nóng)田生態(tài)平衡和生物多樣性被破壞等問(wèn)題[1-2]。植物內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)在植物體內(nèi)，受寄主植物的保護(hù)，有較穩(wěn)定的生存環(huán)境，不易受環(huán)境條件的影響，可以在植物體內(nèi)獨(dú)立地繁殖和傳遞，更易發(fā)揮其生物學(xué)功能[3-8]。有益的植物內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或生防載體菌。目前，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物控制植物病害的研究已成為熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)將從杜仲中分離的內(nèi)生細(xì)菌DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)引入玉米葉鞘組織，研究不同生育期DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)玉米抗紋枯病的影響，分析其在玉米葉鞘的定殖情況，并檢測(cè)了玉米葉鞘組織多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)活性以及脅迫響應(yīng)基因(PR-1、PR-2a)的表達(dá)情況，初步明確了杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSY21對(duì)玉米紋枯病的抗病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

杜仲內(nèi)生細(xì)菌編號(hào)為DZSY21(BacillussubtilisDZSY21)，NCBI登錄號(hào)為KP777560，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏編號(hào)：CGMCC NO. 11749)。玉米紋枯病菌YWSZ12(RhizoctoniasolaniYWHB12)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供，玉米紋枯病菌YWSZ12自安徽省宿州市感染玉米紋枯病的玉米植株上分離獲得。

1.2 供試玉米品種

玉米自交系昌7-2。

1.3 供試培養(yǎng)基和化學(xué)藥劑

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 L。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA固)：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂15～20 g，水1 L，pH 7.2～7.5。

肉湯固體培養(yǎng)基(LB固)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15～20 g，水1 L。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(NA液)：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，水1 L，pH 7.2～7.5。

20%井岡霉素水溶性粉劑(浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司)：用無(wú)菌水配成50 μg·mL-1溶液，貯藏備用。

1.4 DZSY21菌懸液制備

菌株DZSY21接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為160 rpm·min-1，于37 ℃培養(yǎng)8～10 h，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中DZSY21的菌體濃度至1.0×106cfu·mL-1，獲得DZSY21菌懸液。

1.5 菌株DZSY21在玉米葉鞘組織中的定殖

1.5.1 定性檢測(cè)

玉米種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，種植方式為壟栽，壟面寬70 cm，壟距30 cm，株距30 cm，行距60 cm，每壟栽植20粒健康玉米種子(昌7-2)，共栽植2壟。待玉米均長(zhǎng)至大喇叭口期，每壟分別選取長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)亩嗫糜衩字仓赀M(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照(CK)：在玉米植株貼近地面的第1個(gè)葉鞘上噴灑5 mL無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。DZSY21菌懸液處理(S)：將5 mL DZSY21菌懸液直接噴灑于健康玉米植株貼近地面的第1個(gè)葉鞘表面，保濕培養(yǎng)24 h。每個(gè)處理5株玉米，3個(gè)重復(fù)。接種DZSY21菌懸液24 h后，對(duì)上述2種處理的玉米葉鞘進(jìn)行取樣，樣本送安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心進(jìn)行處理以及透射電鏡觀察(HT-7700透射電鏡，加速電壓80 kV)，記錄DZSY21菌體在玉米葉鞘組織中的生長(zhǎng)情況。

1.5.2 定量檢測(cè)

菌株標(biāo)記：采用卡那霉素法標(biāo)記，將供試菌株DZSY21轉(zhuǎn)入含2.5 μg·mL-1卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，逐步篩選出在200 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)、對(duì)病原真菌有拮抗作用的DZSY21突變體菌株。

篩選方法：將100 μL DZSY21菌株培養(yǎng)液均勻涂于含2.5 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，選取生長(zhǎng)良好的菌落，移至卡那霉素濃度相同的培養(yǎng)基上繼代2次，以獲得穩(wěn)定的抗性，然后轉(zhuǎn)入含高濃度卡那霉素的LB培養(yǎng)基，直至在200 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基上獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的突變體菌株。

抗性突變株拮抗作用測(cè)定：利用對(duì)峙生長(zhǎng)法，測(cè)定抗性突變株對(duì)玉米紋枯病菌的拮抗作用，以原始菌株DZSY21為對(duì)照，最終獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)、對(duì)玉米紋枯病菌的拮抗活性無(wú)明顯改變的DZSY21突變體菌株。

玉米紋枯病菌的制備：將玉米莖稈剪為長(zhǎng)約5 cm、寬約2 cm的節(jié)段，在1%的蔗糖溶液中浸泡30 min，倒掉多余的溶液，把玉米莖稈分裝在三角瓶中，12l ℃滅菌30 min后接種紋枯病菌，28 ℃，培養(yǎng)4 d備用。

DZSY21突變株在玉米體內(nèi)定殖的定量檢測(cè)：將DZSY21突變株在含200 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，濃度約為6×105cfu·min-1。待玉米長(zhǎng)至大喇叭口期，分別選取長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)亩嗫糜衩字仓赀M(jìn)行以下2種處理：DZSY21突變株菌懸液處理組(S)：將5 mL DZSY21突變株菌懸液直接噴灑于健康玉米植株貼近地面的第1個(gè)葉鞘表面，保濕培養(yǎng)12 h后，接種滅菌的玉米莖稈(不接種玉米紋枯病菌)于相同部位，保濕培養(yǎng)12 h。DZSY21突變株+玉米紋枯病菌的混合處理組(SB)：將5 mL DZSY21突變株菌懸液直接噴灑于玉米葉鞘表面，保濕培養(yǎng)12 h后，接種帶有玉米紋枯病菌的玉米莖稈于相同部位，保濕培養(yǎng)12 h。以上2種處理均于接種后1、3、5、7、10、15 d取樣，分離玉米葉鞘組織中的DZSY21抗性突變株。定量稱(chēng)取玉米葉鞘樣品0.5 g，在0.1% HgCl2溶液中浸泡5 min，無(wú)菌水洗滌干凈，放入研缽內(nèi)，加入4.5 mL無(wú)菌水充分研磨，得到0.1 g·mL-1的母液；用無(wú)菌水將母液依次稀釋至0.01、0.001 g·mL-1，吸取100 μL 0.001 g·mL-1的稀釋液涂布于含200 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。用最后1次洗滌的無(wú)菌水涂抹平板檢測(cè)樣品消毒是否徹底。

1.6 菌株DZSY21對(duì)玉米紋枯病的防效測(cè)定

1.6.1 玉米紋枯病菌的制備

玉米紋枯病菌的制備方法同1.5.2節(jié)。

1.6.2 防治效果測(cè)定

玉米種植方法同1.5.1節(jié)。共設(shè)5個(gè)處理，每種處理5株玉米，3次重復(fù)。在玉米大喇叭口期，將菌株DZSY21引入玉米葉鞘，并于接種玉米紋枯病菌后的第4、6、8、10、12天調(diào)查各組紋枯病的發(fā)病率，根據(jù)玉米紋枯病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，計(jì)算病情指數(shù)。

5個(gè)處理分別為：空白對(duì)照處理(CK)，將5 mL無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基直接噴灑于玉米植株貼近地面的第1個(gè)葉鞘(下同)，12 h后，在玉米植株相同部位接種滅菌的玉米莖稈(將不接種玉米紋枯病菌的玉米莖稈放入玉米分蘗的葉鞘與莖之間)，保濕培養(yǎng)12 h。玉米紋枯病菌處理(B)，將5 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基直接噴灑于玉米葉鞘表面12 h后，在相同部位接種玉米紋枯病菌(取1.6.1節(jié)培養(yǎng)好的帶有玉米紋枯病菌的玉米莖稈放入玉米分蘗的葉鞘與莖之間。下同)，保濕培養(yǎng)12 h。DZSY21菌懸液處理(S)，將5 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基直接噴灑于玉米葉鞘表面12 h后，在相同部位直接噴灑5 mL DZSY21菌懸液，保濕培養(yǎng)12 h。菌株DZSY21+玉米紋枯病菌的混合處理組(SB)：將5 mL DZSY21菌懸液直接噴灑于玉米葉鞘表面，保濕培養(yǎng)12 h后，接種玉米紋枯病菌于相同部位，保濕培養(yǎng)12 h。井岡霉素+玉米紋枯病菌的混合處理組(Y)：5 mL井岡霉素溶液噴在玉米葉鞘表面，保濕培養(yǎng)12 h后，接種玉米紋枯病菌于相同部位，保濕培養(yǎng)12 h。

1.7 酶活性及基因表達(dá)測(cè)定

共4個(gè)處理：空白對(duì)照(CK)，玉米紋枯病菌處理(B)，DZSY21菌懸液處理組(S)，DZSY21菌株+玉米紋枯病菌混合處理(SB)。處理方法及采樣時(shí)間同1.6.2節(jié)。

1.7.1 酶活性測(cè)定

稱(chēng)取500 mg玉米葉鞘組織混合樣品在液氮中研磨后，加入5 mL 0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，4 ℃ 5 000g離心15 min。上清液即為粗酶液，測(cè)定PPO、POD和PAL的活性。酶活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[10-13]，并進(jìn)行相關(guān)誘導(dǎo)效應(yīng)計(jì)算[14]。

誘導(dǎo)效應(yīng)計(jì)算公式如下：

DZSY21在單菌體系中對(duì)玉米葉鞘3種酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)(分別用APPO、APOD、APAL表示)：A=(S處理組酶活性-CK處理組酶活性)/ CK處理組酶活性×100%；

DZSY21在雙菌體系中對(duì)玉米葉鞘3種酶活性的誘導(dǎo)效應(yīng)(分別用BPPO、BPOD、BPAL表示)：B=(SB處理組酶活性-B處理組酶活性)/ B處理組酶活性×100%。

1.7.2 RT-PCR

以actin為內(nèi)參基因，檢測(cè)玉米直接防御蛋白調(diào)控基因PR-1、PR-2a的表達(dá)水平[15]。不同處理組不同生長(zhǎng)期玉米樣品的RNA提取和cDNA合成參照牛吉山等[16]的方法。引物信息見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物信息

Table 1 The information of primers for RT-PCR

基因Gene登錄號(hào)GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')長(zhǎng)度Length/bpPR-1U82200.1TCCTGGGTGTCCGAGAAGC76AGCCGATGGCGGTGGAGTPR-2aM95407.1GGCGTGAACGGCGACAA119ATGAGCCCGATGCTGGTGactinAM501546.1CGACTGCTGAGCGAGAA195TGAAGGATGGCTGGAATA

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DZSY21在玉米葉鞘組織中的定殖

2.1.1 定性檢測(cè)

與空白對(duì)照組(圖1-B)相比，接種DZSY21菌懸液24 h后，DZSY21菌懸液處理組中，DZSY21菌體能侵入玉米葉鞘組織內(nèi)部，菌體形態(tài)如圖1-C-7、圖1-D-9所示，而空白對(duì)照組的葉鞘組織中未發(fā)現(xiàn)該菌存在(圖1-B)。此外，菌株DZSY21在葉鞘中的生長(zhǎng)對(duì)玉米組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，葉綠體、淀粉粒均正常，說(shuō)明菌株DZSY21可與玉米葉鞘組織形成和諧的共生關(guān)系。

2.1.2 定量檢測(cè)

如圖2所示，S處理組和SB處理組DZSY21抗性突變株數(shù)量均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，且不同生長(zhǎng)時(shí)期S處理組分離的DZSY21抗性突變株均多于SB處理組，可能是由于將外源DZSY21抗性突變株引入玉米葉鞘，DZSY21抗性突變株需要通過(guò)與玉米葉鞘組織的內(nèi)生微生物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)以及空間生態(tài)位等方面的競(jìng)爭(zhēng)，維持自身生長(zhǎng)繁殖，反映在數(shù)據(jù)上則是生長(zhǎng)前期，抗性突變株數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，抗性突變株適應(yīng)玉米葉鞘組織環(huán)境、占據(jù)了生態(tài)位定殖以后，抗性突變株在玉米葉鞘中的數(shù)量則呈上升趨勢(shì)；SB處理組的DZSY21抗性突變株引入玉米葉鞘后，在定殖過(guò)程中，不僅要和內(nèi)生微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，還要與玉米紋枯病菌進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，因此，數(shù)量上要少于單獨(dú)接種DZSY21抗性突變株的S處理組。

A，DZSY21菌體在透射電鏡下的形態(tài)；B，空白對(duì)照處理(CK)；C和D，DZSY21菌懸液處理組。其中，A-1、A-2、A-3、C-7、D-9為菌株DZSY21；B-5、C-6、D-8為葉綠體；B-4、D-10為淀粉粒；C-7為DZSY21菌體完整形態(tài)；D-9為DZSY21菌體的橫切形態(tài)A， the shape of DZSY21 under the transmission electron microscopy; B， blank control (CK); C and D， maize leaf sheath inoculated by DZSY21 after 24 h. A-1， A-2， A-3， C-7， D-9 were DZSY21; B-5， C-6， D-8 were chloroplast; B-4， D-10 were starch granule; C-7 showed the complete form of DZSY21; D-9 showed the crosscutting form of DZSY21圖1 菌株DZSY21與玉米葉鞘共生情況Fig.1 The symbiosis between DZSY21 and maize leaf sheath

數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。S，DZSY21菌懸液處理；SB，DZSY21+玉米紋枯病菌混合處理Data was detected based on fresh weight. S， treatment of strain DZSY21; SB， treatment of strain DZSY21+R. solani圖2 DZSY21抗性突變株在玉米體內(nèi)的定殖量Fig.2 Colonization of DZSY21 resistant mutant strains in corn

2.2 菌株DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)玉米紋枯病的防治效果

DZSY21菌懸液噴灑玉米葉鞘表面，保濕培養(yǎng)12 h后，接種玉米紋枯病菌，于接種紋枯病菌后的第4、6、8、10、12天對(duì)不同處理組進(jìn)行玉米紋枯病病害調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)。結(jié)果如表2所示，隨生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，B、SB及Y處理組玉米紋枯病的病情指數(shù)均呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)；截至第12天，B處理組(單獨(dú)接種玉米紋枯病菌)病情指數(shù)達(dá)到75.41%，而同一生長(zhǎng)期的SB

處理組(菌株DZSY21+玉米紋枯病菌)玉米患病較輕，其病情指數(shù)僅為33.26%，與Y處理組(井崗霉素+玉米紋枯病菌)玉米病情指數(shù)(31.65%)無(wú)顯著差異。接種紋枯病菌后第12天，不同處理組玉米紋枯病的發(fā)病情況如圖2所示。上述結(jié)果說(shuō)明，在玉米葉鞘引入菌株DZSY21能夠提高玉米植株對(duì)紋枯病的抗性，降低玉米紋枯病的病情指數(shù)，減輕紋枯病對(duì)玉米的危害。此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DZSY21菌懸液處理(S)的玉米植株，其生長(zhǎng)發(fā)育和空白對(duì)照處理(CK)相同，均正常生長(zhǎng)，沒(méi)有病害發(fā)生，從一定程度上反映了DZSY21菌株在玉米葉鞘的介入對(duì)玉米沒(méi)有致病作用(圖2)。

2.3 菌株DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)其防御酶活性的影響

2.3.1 PAL活性

接種DZSY21后不同時(shí)間玉米葉鞘的PAL活性如表3所示，S處理及SB處理均可誘導(dǎo)玉米葉鞘的PAL活性。其中，接種玉米紋枯病菌后第4、6、8天，S處理組的PAL活性增長(zhǎng)率APAL小于SB處理組的PAL活性增長(zhǎng)率BPAL；接種后第10、12天，S處理組PAL活性增長(zhǎng)率APAL大于SB處理BPAL，說(shuō)明此時(shí)B處理組對(duì)玉米葉鞘PAL活性的誘導(dǎo)效應(yīng)好于SB處理組。

2.3.2 POD活性

表4為不同處理組的玉米植株在接種DZSY21后不同時(shí)間葉鞘的POD活性變化情況。S處理及SB處理均對(duì)玉米葉鞘POD活性有一定的誘導(dǎo)作用，且SB處理對(duì)POD的誘導(dǎo)效應(yīng)大于S處理；接種玉米紋枯病菌后4、6、8、10、12 d，SB處理POD活性增長(zhǎng)值BPOD分別是S處理酶活增長(zhǎng)值A(chǔ)POD的1.5、2.1、2.8、3.8、2.7倍。此外，4種處理的玉米葉鞘POD活性在5個(gè)測(cè)定時(shí)間的變化趨勢(shì)均為先上升后下降，均在接種玉米紋枯病后10 d達(dá)到最高值，隨后逐漸下降。

表2 接種紋枯病菌后不同時(shí)間玉米紋枯病的病情指數(shù)

表中所列數(shù)據(jù)是3組重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。表3-5同。

The data were averaged from three independent replicates. Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as tables 3-5.

CK，空白對(duì)照；B，玉米紋枯病菌處理；S，DZSY21菌懸液處理；SB，DZSY21+玉米紋枯病菌處理；Y，井岡霉素+玉米紋枯病菌處理CK， treatment of blank control; B， treatment with R. solani; S， treatment with strain DZSY21; SB， treatment with strain DZSY21+R. solani; Y， treatment with Validamycin+R. solani圖3 接種紋枯病菌12 d后不同處理組玉米紋枯病發(fā)病情況Fig.3 The effects of different treatments on morbidity of maize sheath blight

表3 不同處理組的玉米葉鞘PAL活性

APAL，S處理組的PAL活性增長(zhǎng)率；BPAL，SB處理組的PAL活性增長(zhǎng)率。

APAL， the growth rate of PAL activity of S treatment; BPAL， the growth rate of PAL activity of SB treatment.

表4 不同處理組的玉米葉鞘POD活性

APOD，S處理組的POD活性增長(zhǎng)率；BPOD，SB處理組的POD活性增長(zhǎng)率。

APOD， the growth rate of POD activity of S treatment; BPAL， the growth rate of POD activity of SB treatment.

2.3.3 PPO活性

表5為不同處理組的玉米植株在接種DZSY21后不同時(shí)間葉鞘的PPO活性的變化情況。S處理及SB處理均可顯著提高玉米植株葉鞘PPO活性，且SB處理對(duì)PPO的誘導(dǎo)效應(yīng)大于S處理；接種玉米紋枯病菌后4、6、8、10、12 d，SB處理PPO活性增長(zhǎng)值BPPO分別是S處理PPO活性增長(zhǎng)值A(chǔ)PPO的5.3、2.2、1.3、1.3、1.6倍。此外，SB處理組的玉米植株葉鞘PPO活性在接種玉米紋枯病后10 d達(dá)到最大，而S處理組葉鞘PPO活性則在接種玉米紋枯病后8 d達(dá)到最大。

2.4 菌株DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)其PR-1、PR-2a基因表達(dá)的影響

如圖4所示，S處理組和SB處理組中，PR-1、PR-2a基因的表達(dá)水平均隨著玉米植株的生長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，其中，S處理組中PR-1、PR-2a基因的表達(dá)水平分別在第6和8天達(dá)到峰值；而SB處理組中PR-1、PR-2a基因的表達(dá)水平均在第8天達(dá)到峰值，其峰值增強(qiáng)幅度分別約是B處理組的1.8倍和1.1倍。此后，隨著玉米植株的生長(zhǎng)，S處理組和SB處理組的PR-1、PR-2a基因的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。截至第12天，不同處理組的PR-1基因表達(dá)量為SB處理>CK處理>B處理>S處理，PR-2a基因表達(dá)量則為SB處理>B處理>S處理>CK處理。

表5 不同試驗(yàn)處理組的玉米葉部PPO活性

APPO，S處理組的PPO活性增長(zhǎng)率；BPPO，SB處理組的PPO活性增長(zhǎng)率。

APOD， the growth rate of PPO activity of S treatment; BPAL， the growth rate of PPO activity of SB treatment.

圖4 DZSY21對(duì)玉米葉鞘PR-1(A)和PR-2a(B)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of DZSY21 on the expression of PR-1 (A) and PR-2a (B) genes in maize leaf sheath

3 討論

目前報(bào)道的生物防治玉米紋枯病所用菌株多為玉米根際或內(nèi)生微生物。如邱小燕等[17]發(fā)現(xiàn)，玉米根際土壤分離得到的根際細(xì)菌515-126對(duì)田間玉米紋枯病有一定防治效果，相對(duì)防效達(dá)到49.37%；毛騰霄[18]將從玉米莖基部葉鞘分離得到的芽孢桿菌BS-8D接入玉米植株莖基部，能延緩病菌對(duì)植株的侵染。本研究中，將從杜仲體內(nèi)獲得的1株離體條件下對(duì)玉米紋枯病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌DZSY21引入玉米植株，能在較大程度上降低玉米紋枯病的病情指數(shù)，可誘導(dǎo)玉米植株對(duì)紋枯病產(chǎn)生抗性。生防微生物能否侵入植物并在植株內(nèi)生存和定殖是其與植物互作并發(fā)揮生防作用的先決條件[19-20]。利用透射電鏡以及抗生素標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)，噴灑于玉米葉鞘表面的DZSY21菌體，能夠侵入葉鞘內(nèi)部，且對(duì)玉米組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，可與玉米葉鞘組織形成和諧的共生關(guān)系，在其體內(nèi)穩(wěn)定定殖，該試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上為菌株DZSY21增強(qiáng)玉米對(duì)紋枯病的抗性機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。此外，在對(duì)玉米植株抗紋枯病防效試驗(yàn)中，本文只針對(duì)選用的玉米自交系昌7-2展開(kāi)了調(diào)查，由于不同品種間的抗、耐病性存在著明顯差異，后期該課題組又選用了玉米品種C8605-2進(jìn)行紋枯病抗病試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果和玉米自交系昌7-2一致，表明菌株DZSY21引入不同品種玉米葉鞘，均能明顯降低玉米紋枯病的病情指數(shù)。

經(jīng)菌株DZSY21處理后的玉米葉鞘，再接種玉米紋枯病菌，接種后不同時(shí)間玉米葉鞘PPO、POD、PAL活性以及PR-1、PR-2a基因表達(dá)水平較單獨(dú)接種玉米紋枯病原菌、單獨(dú)引入DZSY21菌懸液等處理均明顯增強(qiáng)。外部癥狀上，經(jīng)菌株DZSY21處理的玉米葉鞘，再接種玉米紋枯病菌后，紋枯病的病情指數(shù)隨著玉米生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，增加緩慢，截至第12天，SB處理組(菌株DZSY21+玉米紋枯病菌)的病情指數(shù)為33.26%，而相同生長(zhǎng)時(shí)期的B處理組(玉米紋枯病菌)的病情指數(shù)則為75.61%。由此可知，菌株DZSY21引入玉米葉鞘后，隨著玉米體內(nèi)防御酶活性的升高以及PR基因表達(dá)的增強(qiáng)，玉米植株的抗病水平也隨之提高。

植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)是指植物在誘導(dǎo)子的激活作用下，自身防御基因被激活，植物體內(nèi)發(fā)生生理生化變化，產(chǎn)生抗性的過(guò)程，是內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害的重要作用機(jī)制[21-22]。在誘導(dǎo)子的激活作用下，不僅植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而且植物體內(nèi)一些生理生化反應(yīng)也產(chǎn)生了變化，如POD、PPO、SOD和PAL等多種植物防御相關(guān)酶基因的表達(dá)[23]。因而，PAL、POD和PPO通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要酶活性指標(biāo)[24-25]。本研究中，分別于接種后第4、6、8、10、12天進(jìn)行PPO、POD和PAL活性的測(cè)定。結(jié)果表明，經(jīng)拮抗菌株DZSY21處理的玉米葉鞘，再接種玉米紋枯病菌后，5個(gè)測(cè)定時(shí)間的3種酶活性基本上均高于空白對(duì)照組以及玉米紋枯病菌處理組、單獨(dú)引入DZSY21菌懸液處理組。由此可初步推測(cè)，拮抗菌株DZSY21引入玉米植株能夠提高玉米葉鞘組織的PPO、POD和PAL活性，從而間接提高玉米植株對(duì)紋枯病的抗病性。而DZSY21引入玉米植株會(huì)不會(huì)對(duì)玉米的其他各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)(如根系、株高、鮮質(zhì)量)產(chǎn)生影響，則有待進(jìn)一步研究。

與僅接種DZSY21相比較，菌株DZSY21+玉米紋枯病菌處理組的玉米植株P(guān)R-1、PR-2a基因表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，在一定程度上提高了玉米植株對(duì)紋枯病的抗病水平。究其原因，可能是生防菌引入植物體內(nèi)，可作為植物防衛(wèi)基因表達(dá)的激發(fā)子[26-27]，當(dāng)玉米植株先接種DZSY21菌株，再接種玉米紋枯病菌后，植株體內(nèi)防衛(wèi)基因PR-1、PR-2a的表達(dá)量也隨之增強(qiáng)。此外，本研究?jī)H分析了菌株DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)PR-1、PR-2a表達(dá)的影響，而玉米體內(nèi)的主要防御基因除了直接防御蛋白調(diào)控基因之外，還包括丁布合成調(diào)控基因(Bx1、Bx6和Bx9)、PAL基因以及間接防御物質(zhì)揮發(fā)物調(diào)控基因(FPS和TPS)等，這些防御基因的表達(dá)在一定程度上均可提高玉米對(duì)病蟲(chóng)害的抵抗能力[27-28]。后續(xù)試驗(yàn)將從基因表達(dá)水平，驗(yàn)證菌株DZSY21引入玉米葉鞘對(duì)間接防御物質(zhì)、直接防御物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)以及玉米抗紋枯病的影響。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

Resistance mechanism of bio-control strain DZSY21 against maize sheath blight

SU Bo1， JIANG Hubiao2， QIAO Jianli3， PAN Jie2， XU Wei2， WU Anning2， DING Ting2，*

(1.AnhuiProvincialKeyLaboratoryofCropBiology，Hefei230036，China; 2.SchoolofPlantProtection，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China; 3.InstituteofPlantProtectionandAgriculturalChemistry，NanyangAcademyofAgriculturalSciences，Nanyang473083，China)

This study was carried out to explicit the resistance mechanism of endophytic bacteria DZSY21 against maize sheath blight. The colonization property of biocontrol strain DZSY21 in maize leaf sheath was analysed by antibiotic label method， and resistance of maize treated with DZSY21 at different growth stages to sheath blight were assessed through field experiments， then the related enzymes activity and expression ofPR-1 andPR-2agene in maize leaf sheath treated with DZSY21 at different growth stages were detected by spectrophotometry and quantitative real-time PCR. The results indicated that DZSY21 could successfully colonize maize leaf sheath， it had a symbiotic relationship with maize leaf sheath， and colonization of DZSY21 in maize leaf sheath could significantly enhance maize resistance to maize sheath blight. Activities of polyphenol oxidase (PPO)， peroxidase (POD)， phenylalnine ammonialyase (PAL) and expression of defense response genes (PR-1，PR-2a) in maize leaf sheath treated with DZSY21 were significantly higher than those of normal control groups at different growth stages. The results afforded scientific basis for the further research on bio-controlling mechanism and DZSY21 application.

maize sheath blight; polyphenol oxidase， peroxidase; phenylalnine ammonialyase; defense response gene; colonization

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.15

2016-09-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371980)；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目

蘇博(1990—)，女，安徽淮北人，碩士，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。E-mail: 1585376210@qq.com

*通信作者，丁婷，E-mail: dingting98@126.com

S435.13；S476

A

1004-1524(2017)03-0450-10

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 450-459

http://www.zjnyxb.cn

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