水體中藍(lán)藻水華分解產(chǎn)甲烷動態(tài)過程研究

胡萬婷,唐 千,孫 偉,朱立峰,邢 鵬

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210046；2.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室,江蘇 南京 210008；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100039；4.南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院,江蘇 南京 210044)

水體中藍(lán)藻水華分解產(chǎn)甲烷動態(tài)過程研究

胡萬婷1,2,唐 千2,3,孫 偉2,4,朱立峰1,邢 鵬2*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210046；2.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室,江蘇 南京 210008；3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100039；4.南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院,江蘇 南京 210044)

在巢湖開展藍(lán)藻分解的原位圍隔實驗,實驗期間測定圍隔中層水體溶解性甲烷濃度和主要理化因子,通過定量PCR的方法測定產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)以及細(xì)菌和古菌16S rRNA基因拷貝數(shù)隨時間的變化情況.結(jié)果顯示:隨著藍(lán)藻有機質(zhì)分解,水體產(chǎn)甲烷菌數(shù)量逐漸增加,溶解性甲烷濃度最高達(dá)到2.94mg/L;產(chǎn)甲烷菌m crA基因拷貝數(shù)與甲烷濃度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系;同時還發(fā)現(xiàn)水體中的亞鐵離子(Fe2+)含量與產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系.上述結(jié)果支持藍(lán)藻水華爆發(fā)導(dǎo)致水體也成為甲烷生物合成熱點區(qū)域的觀點.本研究獲得的結(jié)果有助于進(jìn)一步分析不同產(chǎn)甲烷熱點區(qū)域(水體和沉積物)對湖泊甲烷總體釋放量的貢獻(xiàn)情況.

甲烷；產(chǎn)甲烷菌；藍(lán)藻水華；厭氧分解；巢湖

甲烷是大氣中輻射強度僅次于二氧化碳的溫室氣體,其單分子增溫效應(yīng)是二氧化碳的25倍[1].大氣中甲烷濃度的持續(xù)增長是由其源匯平衡的改變引起的.土壤、濕地和湖泊等生境中微生物分解有機質(zhì)的產(chǎn)甲烷過程對全球甲烷產(chǎn)量有著巨大的貢獻(xiàn).據(jù)估計淡水湖泊對于自然界甲烷釋放量貢獻(xiàn)率為6%～16%[2-4],尤其是藻源性有機質(zhì)豐富的富營養(yǎng)化湖泊,更有利于甲烷的生成[5],這些湖泊對局域乃至全球溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)亟待定量分析和評估.

巢湖是我國污染最重的三大淡水湖泊之一[6],水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻水華持續(xù)爆發(fā),8月水華爆發(fā)頻度達(dá)到最大[7].微囊藻(Microcystis spp.)是巢湖夏季藍(lán)藻的優(yōu)勢種[8],其柔軟的細(xì)胞壁由復(fù)雜的糖類和蛋白質(zhì)構(gòu)成[9],容易被破壞和消化.大量微囊藻生物質(zhì)的積累和分解會消耗水體中的溶解氧[10],造成局部湖區(qū)出現(xiàn)缺氧,甚至厭氧條件.溶氧條件是決定有機物分解途徑和生成產(chǎn)物的關(guān)鍵因素[11].局部區(qū)域的缺氧會提高厭氧微生物尤其是產(chǎn)甲烷菌的活性.目前在巢湖還尚未開展過有關(guān)微生物驅(qū)動的產(chǎn)甲烷過程和機制的相關(guān)研究.

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,富營養(yǎng)化湖泊沉積物才是甲烷產(chǎn)生的熱點區(qū)域[12-13],然而水體中是否有甲烷產(chǎn)生、其產(chǎn)生機制以及參與的微生物類群尚不清楚.此外,湖泊主要理化環(huán)境因子對水體產(chǎn)甲烷過程存在何種影響尚不明確.本研究采用氣相色譜結(jié)合熒光定量PCR(qPCR)技術(shù),通過比較不同藍(lán)藻添加水平下,無底和有底圍隔下層水柱的溶解性甲烷濃度,分析水體細(xì)菌、古菌以及產(chǎn)甲烷菌甲基輔酶M還原酶A(mcrA)基因拷貝數(shù)的動態(tài)變化,試圖揭示水體中甲烷濃度動態(tài)變化的影響機制,為深入認(rèn)識富營養(yǎng)化淺水湖泊碳循環(huán)和湖泊甲烷釋放提供野外數(shù)據(jù)支持.

1 方法

1.1 原位圍隔設(shè)置和樣品采集

2015年7月底在巢湖(北緯N31°31′49.01″東經(jīng)E117°32′56.12″)岸帶設(shè)置6個圍隔,圍隔尺寸為5.0m(長)×5.0m(寬)×3.5m(深).將圍隔平分成有底圍隔(底部密閉)和無底圍隔(底部與沉積物和周圍水體聯(lián)通)2組,目的是探索在沒有沉積物參與的情況下水柱中是否存在甲烷產(chǎn)生所需的環(huán)境條件.藍(lán)藻直接從巢湖水面打撈富集.每組3個圍隔分別設(shè)不添加藍(lán)藻(Low),添加50L新鮮藍(lán)藻(Middle)以及添加150L新鮮藍(lán)藻(High).初始藍(lán)藻生物量以葉綠素a (Chla)濃度表示,測定結(jié)果分別為15822.57,18131.60,22336.79μg/L.實驗開始于2015年8月6日(第0d),而后于第2,5, 7,9,11,12d采集圍隔中心水深2.0m處水樣.

1.1.1 溶解性甲烷樣品的采集 用5L量程的Niskin 采水器采集圍隔下層湖水,通過乳膠管將水樣從釆水器緩慢注入100mL的玻璃頂空瓶底,避免氣泡和渦旋產(chǎn)生,并使水樣溢出約瓶容積的一半時,慢慢抽出乳膠管.立刻用帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的丁基橡膠塞和鋁蓋將瓶口迅速密封,并用錫箔紙包住樣品瓶身,放到黑暗的保溫箱里,低溫避光保存,盡快運到實驗室,4℃冷藏室保存,用作溶解性甲烷的測定.

1.1.2 水體理化因子分析樣品采集 現(xiàn)場采用水質(zhì)分析儀(YSI6920,美國)測定下層水柱的溶解氧(DO)、水溫和pH.采水器里剩余的水樣用潔凈的棕色瓶子保存,用于下層水Chla、溶解性有機碳(DOC)和一些理化因子,包括總氮(TN)、總磷(TP)、硝酸根(NO3-N),亞硝酸根(NO2-N)、亞鐵離子(Fe2+)的測定.將下層水樣過濾到孔徑為0.22μm的聚碳酸酯濾膜(GTTP04700, Millipore,美國)上,用于后續(xù)對產(chǎn)甲烷菌、古菌和細(xì)菌DNA的qPCR定量分析.

1.2 樣品理化因子測定

TN、TP、NO3-N、NO2-N使用紫外分光光度計(UV-2450, Shimadzu公司,日本)測定. DOC分析運用總有機碳分析儀(TOC-V CPN, Shimad-Zu公司,日本).Chla采用丙酮提取法和紫外-可見光分光光度計(HP8452,Agilent Technologies公司,美國)測定.

1.3 甲烷測定

溶解性甲烷采用氣相色譜(GC7900,天美公司,上海)的FID檢測器測定,進(jìn)樣口溫度160℃;柱溫90℃;FID檢測器220℃.首先取固定的水樣50mL置于120mL的頂空瓶中,水浴50℃振蕩平衡40min.用氣密性針抽取頂空上方的氣體500μL,注入色譜進(jìn)樣口,點擊開始進(jìn)行測樣.根據(jù)甲烷分壓-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2＞0.999)計算樣品甲烷濃度,結(jié)果轉(zhuǎn)化為單位體積水樣含有甲烷的質(zhì)量.計算公式[14]如下:

式中:TC為溶解性甲烷濃度,mg/L;p為甲烷分壓, mol/mol;H為甲烷亨利定律常數(shù);M為甲烷相對分子質(zhì)量,g/mol;T為樣品溫度,°K;V1為頂空氣體體積,mL;V2為水樣體積,L.

1.4 水樣基因組DNA提取

將過濾水樣的濾膜剪碎,浸沒于TES lysis buffer(20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris, 0.8%SDS, pH 8.12),采用酚/氯仿/異戊醇方法提取DNA,將DNA溶解在30μL無菌水中備用.具體的DNA提取步驟參見文獻(xiàn)[15].

1.5 qPCR測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法 將提取的DNA分別進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA基因、古菌16SrRNA基因和mcrA基因的PCR擴增,引物序列和退火溫度見表1.PCR反應(yīng)體系為50μL,其中TAKARA Premix 25μL,前向和反向引物各2μL,模板DNA 1μL,無菌雙蒸水20μL.PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min,95℃變性45s,退火30s,72℃延伸1min,共進(jìn)行30個循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存.PCR產(chǎn)物分別用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,運用膠回收試劑盒(DNA Fragment Purification Kit, TaKaRa公司,日本)將目的基因片段割膠回收純化.標(biāo)準(zhǔn)品運用DNA濃度計(NanoDrop 2000c, Thermo Scientific公司,美國)進(jìn)行DNA濃度測定.結(jié)果A260nm/A280nm為1.8～2.0,表明標(biāo)準(zhǔn)品DNA純度可以用于qPCR.根據(jù)3種標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度分別計算它們的基因拷貝數(shù).換算公式如下:

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,ng/μL.將母液分別做梯度稀釋,制成108～104copies/μL一系列梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品分裝凍存?zhèn)溆?

表1 細(xì)菌16SrRNA,古菌16SrRNA和產(chǎn)甲烷菌mcrA基因qPCR引物Table 1 qPCR primers for bacterial 16SrRNA, archaeal16SrRNA and mcrA gene of methanogen

1.5.2 樣品qPCR檢測 將3種標(biāo)準(zhǔn)品分別運用到qPCR的樣品檢測中.以提取的微生物DNA作為模板.qPCR反應(yīng)體系20μL:SYBR? Premix Ex Taq?(Takara,日本)10μL,引物各0.5μL,模板DNA 1μL,無菌雙蒸水8μL.qPCR反應(yīng)在熒光定量儀(CFX96Touch, BIO-RAD, 美國)上完成.所有反應(yīng)都設(shè)置兩個平行,以及陰性對照(以無菌水為模板).3種目標(biāo)基因定量都采用3步法.細(xì)菌16SrRNA基因定量:95℃預(yù)變性2min,95℃變性15s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán)(熒光信號在該處采集);熔解曲線分析,溫度以1℃/30s的速度從60℃上升到95℃.古菌16SrRNA基因和mcrA基因都遵循:95℃預(yù)變性2min,95℃變性15s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán);熔解曲線分析,溫度以1℃/30s的速度從60℃上升到95℃.3種標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)R2＞0.999,擴增效率在92%～105%之間,說明qPCR達(dá)到了良好的擴增效果.根據(jù)樣品的Ct值計算樣品的基因拷貝數(shù),并將單位轉(zhuǎn)化成copies/mL.

1.6 統(tǒng)計分析

運用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.分析圍隔的有無底以及藍(lán)藻添加量的多少對各種環(huán)境因子和甲烷產(chǎn)量以及3種基因拷貝數(shù)的顯著性影響.對按無底圍隔和有底圍隔歸類、并且符合方差齊性的所有變量進(jìn)行配對T檢驗,對不合方差齊性的變量進(jìn)行2個相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗;運用Pearson相關(guān)方法分析溶解性甲烷濃度與環(huán)境因子,如營養(yǎng)鹽、金屬離子、底物(Chla,有機碳)以及微生物數(shù)量(產(chǎn)甲烷菌,細(xì)菌,古菌基因拷貝數(shù))的相關(guān)性.運用線性回歸模擬甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的函數(shù)關(guān)系.

2 結(jié)果

2.1 不同藍(lán)藻添加量對產(chǎn)甲烷濃度的影響

圖1 不同藍(lán)藻添加量圍隔中層水柱溶解性甲烷濃度動態(tài)變化趨勢Fig.1 Dissolved methane dynamics inmesocosms with different amount of Microcystis spp. biomass addition

實驗期間圍隔中水溫為19.9～21.5℃,pH值為6.69～7.51.湖泊環(huán)境中溶氧條件是決定有機物分解途徑和生成產(chǎn)物的關(guān)鍵因素.實驗開始后6個圍隔DO濃度始終均為0mg/L,指示圍隔體系中一直維持缺氧的狀態(tài).6個圍隔中水體Chla濃度均先增加,而從第7d都大幅度減少,至第12d各圍隔Chla平均濃度為479.15μg/L(最小濃度低于166.96μg/L),僅為初始濃度的0.75%.Chla濃度的變化一定程度上反映了圍隔中藻類的消亡過程,甲烷生成的底物可能大部分來自于藍(lán)藻分解產(chǎn)生的有機質(zhì).

如圖1所示,大部分圍隔下層水柱中的甲烷濃度在初期都很低,隨著時間推移增加,最高可達(dá)2.94mg/L.圍隔的有無底對甲烷的產(chǎn)量具有顯著影響(P＜0.05,圖2).有底圍隔的水柱中甲烷濃度高于無底圍隔,尤其是當(dāng)添加High水平的藍(lán)藻時,有底圍隔中的甲烷濃度一直處于最高.藍(lán)藻添加量對下層水柱甲烷產(chǎn)量的影響因圍隔有無底而存在差異.添加不同藍(lán)藻量的無底圍隔之間,甲烷產(chǎn)量差異并不顯著;而在有底圍隔中,藍(lán)藻不同添加量組間差異顯著(P＜0.05).在有底圍隔中,藍(lán)藻添加量越多,甲烷濃度越高,表明水柱中藍(lán)藻賦存量會影響甲烷產(chǎn)量.

圖2 不同藍(lán)藻添加量在無底和有底圍隔中溶解性甲烷濃度比較Fig.2 Comparison of dissolved methane concentration between mesocosms with and without bottoms

2.2 藍(lán)藻水華分解過程中細(xì)菌、古菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量變化

細(xì)菌和古菌16SrRNA基因拷貝數(shù)總體上具有一致的變化趨勢(圖3).在厭氧分解初期,6個圍隔的水柱中細(xì)菌和古菌16SrRNA基因拷貝數(shù)均隨時間推移而增多,幾乎都在第5d達(dá)到峰值.細(xì)菌16SrRNA基因拷貝數(shù)最高6.85×109copies /mL,古菌的16SrRNA基因拷貝數(shù)最高也有8.22× 108copies/mL.各個圍隔的產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)呈現(xiàn)逐步增多的趨勢,幾乎均在第11d達(dá)到峰值.其中添加High水平的有底圍隔下層水mcrA拷貝數(shù)最高可達(dá)2.15×108copies/mL,增加幅度約為初始濃度的93倍.

圖3 不同藍(lán)藻添加量圍隔細(xì)菌和古菌16SrRNA基因以及產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)動態(tài)變化趨勢Fig.3 Dynamic of bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogen mcrA gene copy numbers in mesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

藍(lán)藻添加量和圍隔有無襯底對于細(xì)菌、古菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量具有不同的影響.如圖4a所示,在無底圍隔中,細(xì)菌數(shù)量隨著藍(lán)藻添加量增多而增多,在無底圍隔中結(jié)果相反.統(tǒng)計分析顯示圍隔有無底對細(xì)菌16SrRNA基因拷貝數(shù)存在顯著影響(P＜0.05).圖4b顯示,藍(lán)藻添加量在無底圍隔中對于古菌數(shù)量的作用不明顯.但是在有底圍隔中,藍(lán)藻添加量越多,古菌數(shù)量越多.有底圍隔中古菌16SrRNA基因拷貝數(shù)顯著高于無底圍隔.圖4c表明,在有底圍隔中,產(chǎn)甲烷菌數(shù)量隨著藍(lán)藻添加量的增加而明顯增多.藍(lán)藻生物量對產(chǎn)甲烷菌具有重要影響(P＜0.05).當(dāng)藍(lán)藻添加量相同時,尤其是添加藍(lán)藻量都為High水平,有底圍隔中的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著高于無底圍隔.

圖4 不同藍(lán)藻添加量無底和有底圍隔細(xì)菌和古菌16SrRNA基因以及產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)比較Fig.4 Comparisonof bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogenmcrA gene copy numbers betweenmesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

圖5 水體溶解性甲烷濃度與產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)的相關(guān)關(guān)系Fig.5 The correlation between methane concentration and mcrA gene copy number

產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量與甲烷產(chǎn)量變化趨勢具有一致性,統(tǒng)計分析顯示產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)與甲烷產(chǎn)量顯著正相關(guān)(Pearson r=0.855, P＜0.0001,圖5).在分解后期,添加High水平藍(lán)藻的有底圍隔中,產(chǎn)甲烷菌mcrA基因高拷貝數(shù)可能是高濃度甲烷產(chǎn)生的原因.

2.3 與產(chǎn)甲烷過程相關(guān)的環(huán)境因子分析

甲烷生成過程可能受到水體理化因子和微生物自身對于底物利用能力的限制.環(huán)境因子間的相關(guān)分析結(jié)果顯示,圍隔中TN、TP濃度彼此密切相關(guān);NO3-N濃度與Chl a濃度呈負(fù)相關(guān)(r= -0.377,P＜0.01),即藍(lán)藻厭氧分解過程中隨著Chl a濃度逐漸下降,NO3-N濃度升高.相關(guān)性分析還顯示許多環(huán)境因子對產(chǎn)甲烷菌、細(xì)菌和古菌數(shù)量都存在潛在的影響.產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與Chl a濃度和溶解性有機碳DOC均顯著正相關(guān),藍(lán)藻生物質(zhì)(以Chl a表征)分解過程向周圍水體釋放DOC,可以為產(chǎn)甲烷菌生命活動提供所需底物.此外還發(fā)現(xiàn)不論產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)還是甲烷濃度都與Fe2+濃度顯著正相關(guān).產(chǎn)甲烷菌、細(xì)菌和古菌的基因拷貝數(shù)變化都與TN存在顯著的正相關(guān)關(guān)系.水體中溶解性甲烷濃度除了與產(chǎn)甲烷菌數(shù)量相關(guān),還與細(xì)菌、古菌數(shù)量存在正相關(guān)性.藻源性有機質(zhì)降解過程是各種功能微生物共同作用的結(jié)果,某些功能菌群將藍(lán)藻有機質(zhì)大分子分解成小分子量的中間產(chǎn)物才可被產(chǎn)甲烷菌利用生成甲烷.

3 討論

3.1 藍(lán)藻水華分解形成的環(huán)境條件有助于甲烷的生物合成

產(chǎn)甲烷過程涉及到一系列酶促反應(yīng),其代謝過程受到環(huán)境因子(如溫度、pH值和金屬離子等)的影響.大部分產(chǎn)甲烷菌最適生長溫度通常在4～20℃[20],實驗過程中圍隔中下層水溫平均為20.7±0.6℃,適宜產(chǎn)甲烷菌生長繁殖.產(chǎn)甲烷菌最適生長pH值為近中性環(huán)境[21],本實驗測得水體pH平均值為7.45±0.06,符合產(chǎn)甲烷菌對pH值的需求.

研究結(jié)果還顯示,有底圍隔水體Fe2+濃度為0.36～2.9mg/L,顯著高于無底圍隔(0.19～1.5mg/L).由于微囊藻對鐵(包括二價鐵和三價鐵[22])具有較強的吸收與儲存能力[23],分解過程導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)存貯的鐵元素釋放.而且,低氧化還原電位的缺氧水體也有利于Fe2+的穩(wěn)定存在[24].

相關(guān)分析顯示,圍隔水體中Fe2+與甲烷濃度具有極強的正相關(guān)性(r=0.764,P＜0.001).Fe2+對甲烷生成可能存在積極影響[25],一方面Fe2+是厭氧微生物不可缺少的微量元素,而且更是產(chǎn)甲烷菌生存必需元素[26],可以作為產(chǎn)甲烷菌的能量載體[27],另一方面Fe2+是許多酶的組成成分,還可以降低氧化還原電勢[28].我們推測Fe2+大量存在可能有助于產(chǎn)甲烷的生物合成.關(guān)于Fe2+促進(jìn)產(chǎn)甲烷過程的生物學(xué)機制有待進(jìn)一步研究.

3.2 湖泊厭氧水體中存在劇烈的產(chǎn)甲烷作用

有研究報道,產(chǎn)甲烷菌主要存在于湖泊沉積物和具有厭氧環(huán)境的顆粒物中[29].本研究設(shè)置有底和無底圍隔的處理,試圖明確在水柱中是否存在藻源性有機質(zhì)分解產(chǎn)甲烷所需的環(huán)境條件,換言之,通過原位模擬實驗分析在無沉積物參與的情況下是否能夠完成藍(lán)藻有機質(zhì)生產(chǎn)甲烷的微生物轉(zhuǎn)化過程.

關(guān)于我國富營養(yǎng)化淺水湖泊水體產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的報到并不多見.本實驗較為系統(tǒng)的研究了水體中甲烷產(chǎn)生的環(huán)境條件以及產(chǎn)甲烷過程的動態(tài)變化.有底圍隔中未添加藍(lán)藻時產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)就有4.64×104copies/mL,高于淡水湖泊Kivu水柱中mcrA基因拷貝數(shù)(4.15×102～3.35×103copies/mL)[18].添加High水平藍(lán)藻的有底圍隔在厭氧分解后期,mcrA基因數(shù)最高增加到初始濃度的近100倍,高達(dá)2.15×108copies /mL.這一數(shù)值超過了黑龍江、安徽、山東地區(qū)沼氣池的沼泥樣品發(fā)酵后期沼液中產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)的最高值7.91×105copies/mL (僅比發(fā)酵初期的沼液中的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量增加了2.1倍)[30],更遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Kivu湖夏末底層水柱中的產(chǎn)甲烷菌mcrA基因拷貝數(shù)(2.21×103copies /mL)[18].可見,藻源性有機質(zhì)厭氧分解會引起產(chǎn)甲烷菌的快速增殖.

表2 主要環(huán)境因子,細(xì)菌16SrRNA、古菌16SrRNA和產(chǎn)甲烷菌mcrA基因之間相關(guān)系數(shù)Table 2 The correlation coefficient among major environmental factors, bacterial 16SrRNA, archaeal 16SrRNA and mcrA of methanogen

圍隔水體中溶解性甲烷產(chǎn)量隨著藻源性有機質(zhì)厭氧分解而增多,平均峰值(1.08±0.44)mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于長江下游底層水體中甲烷的平均濃度[(0.88±0.49)×10-3]mg/L以及鄱陽湖入長江口的甲烷濃度(3.9×10-3)mg/L[31].而其他淡水湖泊,如芬蘭南部城市一個富營養(yǎng)化湖泊Vesij?rvi湖的下層缺氧水柱中甲烷平均濃度也只0.23mg/L[32].富營養(yǎng)化Kasumigaura湖水體溶解性甲烷濃度在夏末時期最高,但不超過0.056mg/L[33].藍(lán)藻水華形成后的太湖梅梁灣水柱中的甲烷含量僅有0.37～0.67mg/L[29],但水體產(chǎn)甲烷菌數(shù)量未見報道.不僅如此,藍(lán)藻水華分解后期水體中溶解性甲烷濃度最高達(dá)到2.94mg/L.而且當(dāng)添加的外源性藍(lán)藻有機質(zhì)的量越多時,產(chǎn)甲烷菌數(shù)量也越多,這表明藍(lán)藻生物量賦存為產(chǎn)甲烷菌提供厭氧環(huán)境和豐富的基質(zhì).外源有機質(zhì)的累積刺激甲烷的生成[34].本研究結(jié)果表明,藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)的局部湖區(qū),缺氧水體同樣可以成為產(chǎn)甲烷的熱點區(qū)域,因此,水華嚴(yán)重的湖泊中甲烷的生成絕不僅僅局限于沉積物中的反應(yīng)過程.

4 結(jié)論

4.1 水華爆發(fā)導(dǎo)致的藍(lán)藻生物質(zhì)堆積分解,造成水體缺氧或者完全厭氧,顯著促進(jìn)了產(chǎn)甲烷菌的增殖.藍(lán)藻水華不僅為產(chǎn)甲烷菌提供了厭氧環(huán)境,還為其提供了豐富的基質(zhì).

4.2 多種環(huán)境因子對產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量和溶解性甲烷濃度存在影響,水體中Fe2+的積累可能是促進(jìn)甲烷生成的誘因之一.

4.3 研究證實在缺氧水體中也能發(fā)生劇烈的產(chǎn)甲烷過程.藻源性有機碳在湖泊多位點的厭氧分解, 將加速富營養(yǎng)化淺水湖泊的碳循環(huán)過程,增加溫室氣體甲烷釋放的風(fēng)險.

[1] 陳 槐,周 舜,吳 寧,等.濕地甲烷的產(chǎn)生、氧化及排放通量研究進(jìn)展 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2006,12(5):726-733.

[2] Borrel G, Jézéquel D, Biderre-Petit C, et al. Production and consumption of methane in freshwater lake ecosystems [J]. Research in Microbiology, 2011,162(9):832-847.

[3] Bastviken D, Cole J, Pace M, et al. Methane emissions fromlakes: Dependence of lake characteristics, two regional assessments, and a global estimate [J]. G lobal Biogeochemical Cycles, 2004, 18(4):GB4009.

[4] Bastviken D, Cole J, Pace M, et al. Fates of methane fromdifferent lake habitats: Connecting whole-lake budgets and CH4emissions [J]. Journal of Geophysical Research Biogeosciences, 2008,113(G2).

[5] Liikanen A, Martikainen P J. Effect of ammoniumand oxygen on methane and nitrous oxide fluxes across sediment—water interface in a eutrophic lake[J]. Chemosphere, 2003,52(8):1287-1293.

[6] 刁曉君,李一葳,何彥芳,等.水華生消過程中巢湖水體和沉積物理化性質(zhì)變化特征 [J]. 湖泊科學(xué), 2015,27(6):1124-1132.

[7] 王雪蕾,王新新,朱 利,等.巢湖流域氮磷面源污染與水華空間分布遙感解析.中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(5):1511-1519.

[8] Chen Y, Qin B, Teubner K, et al. Long-termdynamics of phytoplankton assemblages: Microcystis-domination in Lake Taihu, a large shallowlake in China [J]. Plankton Research, 2003, 25:445-453.

[9] Qin B. Lake eutrophication: control countermeasures and recycling exploitation [J]. Ecological Engineering, 2009,35(11): 1569-1573.

[10] 代亮亮,郭亮亮,吳中奎,等.不同濃度藻類水華對兩種沉水植物的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(9):2765-2773.

[11] 吳慶龍,邢 鵬,李化炳,等.草藻型穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換對湖泊微生物結(jié)構(gòu)及其碳循環(huán)功能的影響 [J]. 微生物學(xué)通報, 2013,40(1):87-97.

[12] Falz K Z, Holliger C, Grosskopf R, et al. Vertical distribution of methanogens in the anoxic sediment of Rotsee (Switzerland) [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(6):2402-2408.

[13] Schwarz J I K, Eckert W, Conrad R. Community structure of Archaea and Bacteria in a profundal lake sediment Lake K inneret (Israel) [J]. Systematic and Applied Microbiology, 2007,30:239-254.

[14] Kampbell D H, Vandegrift S A. Analysis of dissolved methane, ethane, and ethylene inground water by a standard gas chromatographic technique [J]. Journal of Chromatographic Science, 1998,36(5):253-256.

[15] X ing P, Hahn MW, Wu Q L. Lowtaxon richness of bacterioplankton in high-altitude lakes of the eastern Tibetan Plateau, with a predominance of Bacteroidetes and Synechococcus spp. [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009,75(22):7017-7025.

[16] Whelan J A, Russell N B, Whelan MA. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR [J]. Journal of Immunological Methods, 2003,278(1):261-269.

[17] 李海紅,巴琦玥,閆志英,等.不同原料厭氧發(fā)酵及微生物種群的研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(5):1449-1457.

[18] ?nceo?lu ?, Llirós M, Crowee SA, et al. Vertical distribution of functional Potential and Active microbial communities in meromictic Lake Kivu [J]. Microbial Ecology, 2015,70(3):596-611.

[19] Luton P E, Wayne J M, Sharp R J, et al. The mcrA gene as an alternative to 16s rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in land fi ll [J]. Microbiology, 2002, 148(11):3521-3530.

[20] Cavicchioli R. Cold-adapted archaea [J]. Nature Reviews Micro-biology, 2006,4(5):331-343.

[21] Franzmann P D, Liu Y, Balkwill D L, et al.Methanogeniumfrigidumsp. nov., a psychrophilic, H2-using methanogen fromAce Lake, Antarctica [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1997,47(4):1068-1072.

[22] 余 璐.銅綠微囊藻毒株在獲取鐵的過程中對二價鐵和三價鐵的轉(zhuǎn)換動力機制 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2010,30(6):746-746.

[23] 劉永定,范 曉,胡征宇.中國藻類學(xué)研究:我國有毒藍(lán)藻水華和毒素研究 [M]. 武漢:武漢出版社, 2001:32-53.

[24] 邢 偉.鐵對水華藍(lán)藻的生態(tài)生理學(xué)效應(yīng)研究 [D]. 武漢:中國科學(xué)院水生生物研究所, 2007.

[25] Peng S C, Xue J, Wang J, et al. Iron-enhanced anaerobic digestion of cyanobacterial biomass fromLake Chaohu [J]. Fuel, 2014,117:1-4.

[26] Boyd E S, Anbar A D, Miller S, et al. A late methanogen origin for molybdenum-dependent nitrogenase [J]. Geobiology, 2011, 9(3):221-232.

[27] Lacy D, Negash B, Basvapatna S R, et al. Bacterial methanogenesis and growth from CO2with elemental iron as the sole source of electrons[J]. Science, 1987,237:509-11.

[28] Zhang J, Dong H, Liu D, et al. Microbial reduction of Fe(III) in illite—smectite minerals by methanogenMethanosarcina mazei[J]. Chemical Geology, 2012,292:35-44.

[29] 祝棟林.太湖及玄武湖甲烷氣體產(chǎn)生、釋放及影響機制研究[D]. 南京:南京大學(xué)環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 2012.

[30] 王彥偉,徐鳳花,阮志勇,等.用DGGE和Real-Time PCR對低溫沼氣池中產(chǎn)甲烷古菌群落的研究 [J]. 中國沼氣, 2012, 30(1):8-12.

[31] 趙 靜,張桂玲,吳 瑩,等.長江中溶存甲烷的分布與釋放 [J].環(huán)境科學(xué), 2011,32(1):18-25.

[32] Bellido J L, Peltomaa E, Ojala A. An urban boreal lake basin as a source of CO2and CH4[J]. Environmental Pollution, 2011, 159(1):1649-1659.

[33] Nakamura T, Nojiri Y, Utsumi M, et al. Methane emissionto the atmosphere and cycling ina shalloweutrophic lake [J]. A rchiv für Hydrobiologie, 1999,144(4):383-407.

[34] Parkes R J, Webster G, Cragg B A, et al. Deep sub-seafloor prokaryotes stimulated at interfaces over geological time [J]. Nature, 2005,436(7049):390-394.

致謝：感謝中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所段洪濤研究員,杜瑛珣副研究員和佴兆駿同學(xué)對樣品采集和部分環(huán)境數(shù)據(jù)測定的協(xié)助.

Dissolved methane dynamics during the degradation of organic matter derived fromcyanobacterial bloom.

HU Wan-ting1,2, TANG Qian2,3, SUN Wei2,4, ZHU Li-feng1, X ING Peng2*
(1.College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2.State Key Laboratory of Lake and Environment, Nanjing Institute of Geography Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China；4.Applied Meteorological Institute, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：702～710

In shalloweutrophic lakes, methane production during the decomposition of organic matter derived fromcyanobacterial blooms and associated factors for the whole process in the water column remain poorly understood. In this work, in situ mesocosms experiment in Lake Chaohu were carried out to stimulate the Cyanobacteria anaerobic decomposition. During the process, dissolved methane concentration and the main environmental factors were measured at the water bottom. Quantitative real-time PCR method was applied to analyze the abundance of mcrA gene as well as the bacterial and archaeal 16S rRNA genes in each sample. Results showed that with the biomass decomposition, the amount of methanogens increased gradually in accordance with the accumulation of dissolved methane in the water column (maximumconcentration 2.94mg/L). A significantly positive correlation was detected between mcrA gene abundance and the dissolved methane concentration. Furthermore, there was also a significantly positive correlation between ferrous ions (Fe2+) concentration and the methanogen mcrA abundance. Our results support for the notion that water column can be a hot spot for the biosynthesis of methane due to the outbreak of cyanobacterial bloom. This study helps to compare the relative contribution of methane production between water column and surface sediments during the cyanobacterial blooms degradation.

methane；methanogens；cyanobacterial bloom；anaerobic decomposition；Lake Chaohu

X524

A

1000-6923(2017)02-0702-09

胡萬婷(1991-)女,安徽安慶人,南京師范大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.發(fā)表論文1篇.

2016-06-16

國家“863”項目(2014AA06A509);國家自然科學(xué)基金資助目(31370508);中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(2014273);湖泊與環(huán)境國家重點實驗室開放研究基金(2012SKL005).

* 責(zé)任作者, 副研究員, pxing@nigalas.ac.cn