低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

刁 碩,王紅旗,許 潔,趙一村

(北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875)

低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

刁 碩,王紅旗*,許 潔,趙一村

(北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875)

低溫條件(10℃)下,采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高PAHs濃度的方法,從天津?yàn)I海濕地石油污染土壤中獲得能以多環(huán)芳烴芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌群H和純化菌株DYC-1,經(jīng)生理生化和16S rDNA基因序列BLAST對(duì)比結(jié)果分析,菌株DYC-1屬于紅球菌屬(Rhodococcus).降解特性分析結(jié)果表明,10℃低溫條件下,紅球菌DYC-1與菌群H降解能力相似,對(duì)20mg/L芘的15d降解率達(dá)到35%以上;紅球菌DYC-1具有較好的耐鹽能力和較廣的降解底物譜,菌株DYC-1的最優(yōu)降解條件為:低溫10 ℃,鹽度2%的條件下,在pH8,搖床轉(zhuǎn)速為110r/min,接菌量為5%時(shí),對(duì)于初始濃度為20mg/L的芘能達(dá)到35%以上的降解率.

低溫；耐鹽；芘；降解；紅球菌DYC-1

多環(huán)芳烴(PAHs)作為典型的持久性有機(jī)污染物[1],不僅存在大氣中,由于其自身的穩(wěn)定性,進(jìn)入土壤后便長(zhǎng)期殘留其中,在土壤中的半衰期為2～24個(gè)月[2],隨著地表水及降水的沖刷,不斷向地下水釋放,對(duì)地下水環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染和破壞[3].有研究表明,在PAHs污染土壤中,土著微生物對(duì)PAHs的轉(zhuǎn)化能力顯著高于外源微生物,轉(zhuǎn)化率相差3000倍以上.同時(shí),土著菌及混合菌對(duì)污染物具有更好的降解能力,對(duì)外界環(huán)境的變化(如溫度、pH等)也有更好的適應(yīng)性,易于在環(huán)境中保持競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[4].因此,從長(zhǎng)期受PAHs污染的土壤中分離篩選出高效PAHs降解菌,是生物修復(fù)PAHs污染土壤的第一步,也是關(guān)鍵的一步.

天津?yàn)I海濕地處于我國北方濱海地區(qū),年平均溫度多在15℃或以下.近年來濱海濕地由于油田開發(fā)等生產(chǎn)活動(dòng)的進(jìn)行,在經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)的同時(shí)也造成了石油污染.PAHs是濱海濕地石油污染土壤中的主要污染物,其中含四個(gè)苯環(huán)的芘(Pyrene)是主要污染物之一.石油的生產(chǎn)多伴隨著高鹽環(huán)境的產(chǎn)生,降解芘的微生物在低溫高鹽條件下的生長(zhǎng)和代謝都要受到一定程度的限制.Whyte等[5]指出,耐冷型假單胞菌在低溫下(5～10℃)可降解萘,Deppe等[6]發(fā)現(xiàn),北極的細(xì)菌共生體也可以在4℃降解萘.宋立超等[7]分離出一組菌群,在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～2%,15d后對(duì)菲、芘的降解率可達(dá)到92.1%和65.8%.張巧巧[8]研究發(fā)現(xiàn),菌株SE12在液體培養(yǎng)條件下對(duì)芘的降解效果十分顯著,在芘初始濃度為50,100,200mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d,降解率分別達(dá)到86.4%, 96.4%與79.6%.SE12能將初始濃度100mg/L的芘在15d幾乎完全降解,但是當(dāng)初始濃度低于或者高于100mg/L時(shí)降解率都有所降低.但目前針對(duì)低溫高鹽復(fù)合環(huán)境下PAHs芘降解菌的研究較少,其在低溫高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)特性及對(duì)PAHs芘的降解特性尚不明確.本文可科學(xué)指導(dǎo)濱海濕地PAHs污染土壤的生物修復(fù)工作,也可為PAHs污染治理提供適宜菌株及理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品來源

本研究所用土壤樣品均采自天津?yàn)I海濕地石油污染地區(qū)(采樣坐標(biāo)N38°44′57.1″E117°29′51.1″)土壤表層10～15cm處,采取占地面積最大的鹽漬化污染區(qū)域土壤樣品后放于塑料自封袋中,封口,帶回實(shí)驗(yàn)室后過2mm篩,放在4℃冰箱進(jìn)行保存.理化性質(zhì)如表1所示.

1.2 藥品與試劑

本文所使用的主要藥品及來源:芘、菲、苯并b熒蒽、苯并a蒽(分析純,日本TCL公司);熒蒽、芴(分析純,美國Sigma公司);Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、NaCl、NaNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等、水楊酸、葡萄糖、牛肉膏、瓊脂粉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司);蛋白胨(分析純,北京鼎國生物試劑公司);酵母粉(分析純,OXOID公司);瓊脂糖(分析純,Spain公司);正己烷、乙腈、丙酮(分析純,美國J.T.Baker公司).

試劑及來源:磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4),醋酸鉛濾膜,安捷倫小瓶.

1.3 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM):K2HPO41.0g, NH4H2PO41.0g,(NH4)2SO41.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,KNO33.0g,微量元素1.0mL(MnSO439.9mg,ZnSO4·H2O 42.8mg, (NH4)2MoO4·4H2O 34.7mg,蒸餾水1000mL),NaCl 20.0g(鹽度為2%),瓊脂15.0g(固體培養(yǎng)基)去離子水定容到1000mL,pH調(diào)為8.0,121℃高壓蒸汽滅菌20min;

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,NaCl 20.0g(鹽度為2%),瓊脂15.0g(固體培養(yǎng)基),去離子水定容到1000mL,pH值調(diào)為8.0, 121℃高壓蒸汽滅菌20min;

選擇性無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基:無菌條件下,在已滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入一定量芘的丙酮溶液,使其達(dá)到預(yù)定濃度,置于恒溫振蕩器上以120r/min的振蕩頻率振蕩24h,待丙酮完全揮發(fā)后使用;

選擇性無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基:無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基121℃下高壓滅菌20min,倒入平板,在其表面涂布芘的丙酮溶液,于超凈臺(tái)上待丙酮完全揮發(fā)后使用.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 篩選方法 在低于正常室溫的10℃低溫條件下,采用土壤菌懸液制備——初篩——保存混合菌及分離純化——復(fù)篩——保藏菌株的方法獲得芘降解菌群H和單菌DYC-1.

1.4.2 菌株鑒定 表型特征鑒定:參照伯杰氏手冊(cè)第八版[9]細(xì)菌分類學(xué)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn).

分子生物學(xué)鑒定:利用16S rDNA 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定.采用北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成的引物,以該菌株基因組DNA為模板,擴(kuò)增出該菌株16S rDNA序列.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5μL (0.1U Taq Polymerase/μL;500μmol/L dNTP;20mmol/L Tris-H Cl (pH8.3);100mmol/L KCl;3mmol/L MgCl2),引物27F (10μmol/L)1μL,引物1492R (10μmol/ L)1μL,菌液模板1μL,ddH2O 9.5μL,總體積25μL. PCR擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,55℃復(fù)性430s, 72℃延伸1.5min,進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min,在4℃下保存.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行純化測(cè)序,測(cè)序結(jié)束后,將所測(cè)基因序列輸入到NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中,用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具與已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì),從而確定微生物的種屬.使用軟件MEGA6.0進(jìn)行序列同源性分析,構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 菌懸液的制備:從-20℃冰箱取出保存單菌及菌群的甘油管,分別移出200μL至2瓶滅菌的100mL LB培養(yǎng)基中,在10℃、110r/min的搖床振蕩培養(yǎng)48h, 8000r/ min離心10min,棄去LB培養(yǎng)基,用無機(jī)鹽培養(yǎng)基液洗滌3次,制成OD600=0.8的菌懸液,備用.

本研究采用光密度法測(cè)定菌群及單菌的生長(zhǎng)曲線.在裝有已滅菌的50mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中加入芘的丙酮溶液,使培養(yǎng)基中芘濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,準(zhǔn)確加入制備好的單菌及菌群的菌懸液2.5mL(接菌量5%),調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率振蕩培養(yǎng).每隔24h取發(fā)酵液進(jìn)行分析,以無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值來表征菌體的生長(zhǎng)情況.以發(fā)酵液的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),繪制菌群及單菌的生長(zhǎng)曲線.

1.4.4 芘降解能力的測(cè)定 在裝有已滅菌的50mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入一定量芘的丙酮溶液,使培養(yǎng)基中芘濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,準(zhǔn)確加入制備好的單菌及菌群的菌懸液2.5mL,設(shè)置不加菌作為對(duì)照組,調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率振蕩培養(yǎng),以考察菌株對(duì)芘的耐受性及降解能力.培養(yǎng)一段時(shí)間后,用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定芘的降解率,考察菌株降解能力.

1.4.5 高效液相(HPLC)分析水相中殘留的芘 樣品的前處理:采用高效液相法來分析水相中殘留的芘.首先對(duì)錐形瓶中的樣品進(jìn)行殘留芘的提取(總量50mL,整瓶萃取),加入等體積(50mL)的正己烷,在40Hz下超聲萃取30min,靜置20min后對(duì)有機(jī)相進(jìn)行分離,重復(fù)萃取兩次,合并有機(jī)相.用針管取2mL合并后的有機(jī)相,過0.2μm的醋酸鉛濾膜后置于安捷倫小瓶中,待HPLC分析.

HPLC測(cè)定條件:采用高效液相對(duì)安捷倫小瓶中萃取液進(jìn)行分析,分析儀器為配有自動(dòng)進(jìn)樣器的德國戴安公司U3000液相色譜儀,色譜柱為PAHs專用高效液相分析柱(安捷倫, 250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈/水(65:35),流速為1.2mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,柱溫25℃,進(jìn)樣體積為20μL.

1.4.6 菌株對(duì)不同底物的利用能力 準(zhǔn)備裝有無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶,分別加入濃度為100mg/L的碳源物質(zhì):鄰苯二甲酸、菲、芴、苯酚、熒蒽、鄰苯二酚、苯并[b]熒蒽、苯并[a]蒽、水楊酸,再分別加入5%菌懸液,在10℃,110r/min的搖床中振蕩培養(yǎng).依據(jù)相關(guān)研究選擇的9種碳源物質(zhì)(見3.5),每種做3個(gè)平行,共27瓶培養(yǎng)基.培養(yǎng)10d,考察紅球菌DYC-1對(duì)不同底物的利用情況.

1.4.7 降解菌的耐鹽特性研究 本研究立足濱海濕地現(xiàn)狀,選擇2%鹽度為篩選菌株條件,并探索篩選出的單菌DYC-1的耐鹽特性.

不同NaCl濃度對(duì)降解菌生長(zhǎng)狀況的影響:將DYC-1接種到LB液體培養(yǎng)基中,調(diào)整NaCl濃度分別為0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、15%、20%,檢測(cè)菌株是否生長(zhǎng).

降解菌分別在5%、10%、15%鹽度條件下的降解效果:將篩選出的單菌DYC-1接種在NaCl濃度分別為5%、10%、15%,芘濃度為20mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,觀察菌株的生長(zhǎng)特性,測(cè)定菌株對(duì)四環(huán)PAHs芘的降解率,考察其對(duì)鹽的耐受性及對(duì)高分子量PAHs的降解能力.

1.4.8 搖瓶降解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 不同初始濃度對(duì)芘降解效能的影響:準(zhǔn)備150mL的三角瓶,滅菌后在無菌操作臺(tái)上每瓶加入已滅菌的50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基,分別加入不同量芘的丙酮溶液,使芘的濃度分別為20,50,80,100,150,200,300,500mg/L,待丙酮揮發(fā)后,各加入制備好的菌液2.5mL(接種量為5%),調(diào)節(jié)pH值為8.0,在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率培養(yǎng),定期取樣,測(cè)定芘降解率.

pH值變化對(duì)降解效果的影響:準(zhǔn)備150mL的三角瓶,滅菌后在無菌操作臺(tái)上每瓶加入已滅菌的50mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基,加入芘的丙酮溶液,使芘的初始濃度為20mg/L,待丙酮揮發(fā)后,加入制備好的菌液2.5mL(接種量為5%),調(diào)節(jié)pH值分別為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0.在溫度設(shè)置為10℃的恒溫振蕩器上以110r/min的振蕩頻率培養(yǎng),考察菌株DYC-1對(duì)芘的降解率.

轉(zhuǎn)速變化對(duì)降解效果的影響:由于搖床轉(zhuǎn)速直接反應(yīng)水中溶解氧的含量,因此在其他條件不變的情況下,以搖床轉(zhuǎn)速來控制溶解氧的含量,設(shè)搖床轉(zhuǎn)速分別為80,110,140,170,200r/min,考察紅球菌DYC-1對(duì)芘的降解能力.

不同接種量對(duì)降解效果的影響:在其他條件不變的情況下,將菌懸液按照0.5%、1%、3%、5%、8%、10%、15%的接種量接入到含芘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,考察紅球菌DYC-1對(duì)芘的降解能力.

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選馴化菌株過程中反應(yīng)體系變化情況

錐形瓶中加入PAHs芘作為唯一碳源和能源進(jìn)行富集培養(yǎng),15d內(nèi)培養(yǎng)液顏色出現(xiàn)如下變化:乳白色(透明無色的無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入一定濃度芘后變?yōu)槿榘咨?,出現(xiàn)白色混濁,變成淡黃色-最后穩(wěn)定不變.可能是因?yàn)檐诺纳锝到膺^程中會(huì)產(chǎn)生某種中間產(chǎn)物,而在隨后各階段的富集培養(yǎng)中,變化過程會(huì)再次出現(xiàn)且所需時(shí)間逐漸縮短,表明微生物的酶體系適應(yīng)了芘存在的環(huán)境,可將其作為生長(zhǎng)基質(zhì).

2.2 菌株DYC-1的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株DYC-1的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌株DYC-1的菌落呈淡黃色,圓形,直徑約3mm,表面濕潤(rùn),不透光,邊緣光滑,未向四周擴(kuò)散.相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 紅球菌DYC-1生理生化特性Table 2 Physical and biochemical characteristics of Rhodococcus sp. DYC-1

由表2的細(xì)菌生理生化反應(yīng)總特征,相關(guān)的文獻(xiàn)以及伯杰氏手冊(cè)[9],初步鑒定篩選出的芘降解單菌為紅球菌屬.

2.2.2 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用較易操作的16S rDNA分析方法對(duì)菌株進(jìn)行同源性序列分析.BLAST工具的對(duì)比結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)所用菌種為紅球菌(Rhodococcussp.),在GenBank中挑選與DYC-1同源性達(dá)99%的菌種,利用MEGA6.0做紅球菌DYC-1的基因發(fā)育進(jìn)化樹(圖1),結(jié)果表明DYC-1與紅球菌最為接近,說明實(shí)驗(yàn)所用的菌種的確為紅球菌,課題組將其命名為紅球菌DYC-1(Rhodococcussp. DYC-1, GenBank Entry:KR029576;保藏編號(hào):CGMCC 10289).

紅球菌屬目前被認(rèn)為是可參與共代謝降解,且能降解芘效果較好的菌屬.

2.3 菌株DYC-1及菌群的生長(zhǎng)曲線

在10℃,2%鹽度條件下篩選出的菌群記為H,菌株DYC-1及菌群H的生長(zhǎng)曲線如圖2所示.

單菌DYC-1與菌群H的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)大致相同,0～2d為停滯期.單菌DYC-1在3～8d期間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而菌群H在3～11d期間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.菌群相對(duì)于單菌對(duì)數(shù)期較長(zhǎng),進(jìn)入穩(wěn)定期較慢,可能由于不同菌株之間競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)元素,拮抗作用所致.也可能由于不同菌株之間的促進(jìn)作用減緩了衰亡進(jìn)程,菌群在15d之后進(jìn)入衰亡期,而單菌DYC-1則衰亡得比較快,在12d之后已經(jīng)進(jìn)入衰亡期.

圖1 菌株DYC-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Rhodococcus sp. DYC-1

圖2 菌株DYC-1及菌群H的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Rhodococcus sp. DYC-1and mixed culture H

綜上所述,如果把菌株用于以后的降解試驗(yàn)時(shí),菌液的發(fā)酵時(shí)間定為8～11d之間比較合適.

2.4 單菌及菌群對(duì)芘的降解能力分析

菌群H由于含多種菌株理論上降解能力會(huì)高于單菌,但從圖3可以看出,菌群的降解能力與單菌DYC-1的降解能力相當(dāng),只是略高于單菌.這可能是由于不同菌株之間拮抗作用所致.因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中只考察單菌DYC-1對(duì)芘的降解情況.

圖3 菌株DYC-1及菌群H的降解曲線Fig.3 Degradation curve of Rhodococcus sp. DYC-1and mixed culture H

2.5 菌株對(duì)不同底物的利用

考查菌株DYC-1對(duì)不同底物利用情況時(shí),因其對(duì)四環(huán)芳烴芘具有一定降解能力,故分別選定低環(huán)芳烴菲、芴,高環(huán)芳烴熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[a]蒽,苯系物苯酚作為底物,而鄰苯二甲酸、鄰苯二酚、水楊酸均為芘的中間代謝產(chǎn)物[10-12],因而也選定為底物.菌株對(duì)不同底物的利用情況見表3.可知,菌株DYC-1對(duì)鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚都可以降解,可能是由于它們是PAHs代謝中間產(chǎn)物,對(duì)菲、芴低環(huán)PAHs可以降解,對(duì)五環(huán)熒蒽也可以降解,但卻難以降解苯并[b]熒蒽和苯并[a]蒽.

表3 菌株DYC-1對(duì)不同底物的利用情況Table 3 The utilization of different substrates

2.6 不同NaCl濃度對(duì)降解菌生長(zhǎng)效果的影響

本研究實(shí)驗(yàn)樣品采自天津?yàn)I海濕地石油污染區(qū)土壤,濱海鹽土的特點(diǎn)是鹽分組成單一,以氯化物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì);土壤表層含鹽量多為0.6%～1.0% 部分區(qū)域高達(dá)2%～3%,除南方濱海地區(qū)“咸酸田”呈強(qiáng)酸性反應(yīng)外,一般pH值為8.0-8.5.天津?yàn)I海新區(qū)濱海鹽土(0～30cm)土壤含鹽量大于0.6%的土壤面積占總面積的43.9%[13].因此改變LB培養(yǎng)基的鹽度,測(cè)試所篩選出的降解菌DYC-1耐鹽特性.結(jié)果表明,芘降解菌DYC-1在0%～10%的鹽度范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng),鹽度升高至15%時(shí),因OD600數(shù)值低于0.02,認(rèn)定為不能生長(zhǎng),鹽度耐受范圍相對(duì)較寬.

紅球菌DYC-1具有較強(qiáng)的耐鹽特性,證明它在高鹽條件下能夠保持酶活,可為其在高鹽條件下去除環(huán)境中PAHs提供基礎(chǔ)生境條件.

表4 菌株DYC-1耐鹽特性Table 4 The salt resistance of Rhodococcus sp. DYC-1

2.7 不同鹽度條件下菌株DYC-1對(duì)芘的降解效果

圖4 不同鹽度條件下菌株對(duì)芘的降解Fig.4 The degradation of pyrene in the condition of different salinity

研究表明,菌株對(duì)鹽分有一定的適應(yīng)范圍,尤其是生長(zhǎng)在鹽堿土壤中的土著菌[14]. Kushner[15]認(rèn)為中度嗜鹽菌其生長(zhǎng)最適NaCl濃度約為3%～15%,韓言柱等[16]分離出一株降解菲的中度嗜鹽菌,其在pH中性條件下對(duì)菲的降解耐鹽性達(dá)到15%.有學(xué)者發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度超過3%時(shí),非嗜鹽微生物因其代謝受到一定程度的抑制,使得生物修復(fù)效率明顯降低,甚至喪失修復(fù)能力[17].而菌株DYC-1在5%鹽度條件下仍表現(xiàn)出不錯(cuò)的降解能力,從而證明菌株DYC-1是一株能高效降解芘的耐鹽菌.而當(dāng)鹽度達(dá)到15%時(shí),菌株雖能降解芘,但降解能力非常微弱.總體來說,菌株DYC-1具有較好的耐鹽性,這可能與其土壤來源有關(guān),土壤取自天津?yàn)I海濕地,屬于鹽漬化土地,對(duì)天津?yàn)I海鹽堿土壤14個(gè)樣點(diǎn)的土壤鹽分測(cè)定結(jié)果顯示,土壤含鹽量分布在0.049% ～1.85%之間.

2.8 不同初始濃度對(duì)芘降解效果的影響

圖5 不同初始濃度菌株芘的降解Fig.5 The degradation of pyrene in the condition of different initial concentration

如果菌株能夠降解高濃度的污染物,則說明該菌株具有很強(qiáng)的生物降解能力[18].本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5,10,20,50,80,100,150mg/L共7種濃度的液相好氧降解體系,如圖5所示,芘的初始濃度在5,10, 20mg/L時(shí),30d后總降解率雖相差不多,但降解速率卻在明顯增加,芘濃度為20mg/L時(shí)降解率可達(dá)到最高38.42%,說明在5～20mg/L的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),并未出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象,即芘作為唯一碳源和能源還不能完全滿足微生物新陳代謝的需要.而當(dāng)芘的初始濃度達(dá)到50mg/L時(shí),降解率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大,但并沒有隨著芘濃度的增大而升高,這可能是由于菌株DYC-1是在10℃、鹽度為2%、芘的濃度為20mg/L的條件下篩選出來的,低溫高鹽的條件本就不適于微生物的生長(zhǎng),當(dāng)芘的濃度升高至50mg/L,微生物降解PAHs的能力受到一定程度的限制.如果繼續(xù)增大芘的初始濃度,降解率則幾乎不增長(zhǎng),隨著芘濃度的升高,降解率增更慢,這時(shí)的降解率與空白對(duì)照(不加微生物的芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基)相差不大,因此降解率多是由于芘的自然揮發(fā)所致,則芘的初始濃度高于100mg/L時(shí),微生物無法對(duì)芘的降解發(fā)揮作用,可能是由于過高濃度的芘對(duì)菌株DYC-1產(chǎn)生毒害作用.由于低溫耐鹽等嚴(yán)苛的篩選條件及實(shí)驗(yàn)條件,本研究選定的芘濃度低于馬姍姍[18]選定的80mg/L,定為20mg/L.

2.9 不同pH值對(duì)降解效果的影響

研究表明,細(xì)菌對(duì)PAHs降解的最適pH值為中性[14,19]. pH值變化對(duì)微生物降解PAHs的影響非常復(fù)雜,可以通過影響降解酶的活性還可通過影響氧化還原電位來影響降解率.另外微生物的新陳代謝活動(dòng)與環(huán)境介質(zhì)的pH值密切相關(guān),在不同的pH值條件下,微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用及吸附作用、胞外酶的產(chǎn)生及分泌等均不相同.在其他條件相同的情況下,將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的初始pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,分別接入紅球菌DYC-1,10℃,110r/min振蕩培養(yǎng)15d后測(cè)定剩余PAHs含量,計(jì)算降解率,結(jié)果如圖6所示.

圖6 不同pH值條件下菌株對(duì)芘的降解Fig.6 The degradation of pyrene in the condition of different pH

從圖6可以看出,菌株DYC-1在pH值為7～9的范圍內(nèi)降解PAHs的能力較強(qiáng),當(dāng)pH值小于7或者大于9降解能力都明顯減弱,這可能是由于每種微生物都有其生長(zhǎng)的最適pH值,pH值過高或過低都會(huì)影響微生物酶的分泌及活性,從而抑制微生物對(duì)PAHs的降解.因此中性或弱堿性條件下最有利于菌株DYC-1發(fā)揮對(duì)芘的降解作用,本研究中選取pH值為8.

2.10 不同轉(zhuǎn)速對(duì)降解效果的影響

由圖7所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高,15d后菌株DYC-1對(duì)PAHs的降解率逐漸增高.但從80r/min升高至110r/min時(shí),降解率顯著增加,而從110r/min升高至200r/min的過程中降解率變化不大,這可能是由于溶解氧對(duì)于微生物降解污染物的促進(jìn)作用是有一定范圍的,當(dāng)超過了這個(gè)范圍,即使供氧量繼續(xù)增加,對(duì)降解率的促進(jìn)作用也是有限的,因此本研究將搖床轉(zhuǎn)速控制為110r/min,既能促進(jìn)菌株對(duì)PAHs的降解,又節(jié)省了能源.

圖7 轉(zhuǎn)速不同對(duì)菌株降解芘的影響Fig.7 The degradation of pyrene in the condition of different oxygen gas content

2.11 不同接種量對(duì)降解效果的影響

接種量的大小對(duì)縮短菌株在新環(huán)境中延滯期有一定作用,降解菌的生物量是影響污染物生物降解效率的重要因素之一[17,20].將菌懸液以不用的接種量接入到含芘的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,15d后測(cè)定芘的降解速率(10℃,110r/min),考察初始不同接種量對(duì)菌株DYC-1降解芘的影響,結(jié)果見圖8.總的來說,接種量與芘的降解率呈正相關(guān):接種量在0.5%～5%之間,芘的降解率隨著接種量的增加而增大,但隨著接種量的進(jìn)一步增加,降解率維持在32%左右,變化相差不大.由此可見,生物量的增加與降解率的提高并非呈線性關(guān)系,超出一定范圍后,接種量的增加反而不利于菌體的新陳代謝及分泌表面活性劑[21].因此本研究選取5%的接種量.

芘作為一種穩(wěn)定的四環(huán)高分子量PAHs,在室溫低鹽條件下仍然不易降解.段燕青等[22]通過實(shí)驗(yàn)證明了米曲霉以芘為單基質(zhì)代謝時(shí),降解率為33%;一些學(xué)者對(duì)菌株的選擇更地域化,Patel等[23]驗(yàn)證了海洋微藻集胞藻對(duì)芘的降解率可達(dá)36%,陸泗進(jìn)等[24]在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定芽孢桿菌B6和假單孢菌B17對(duì)芘的降解效果,發(fā)現(xiàn)降解率為24.45%和18.77%.而本研究中,在相對(duì)低溫高鹽的環(huán)境下,紅球菌DYC-1降解高濃度芘仍可達(dá)35%以上的降解率.

圖8 不同接種量對(duì)菌株降解芘的影響Fig.8 The degradation of pyrene in the condition of different capacity of bacteria

后續(xù)將在改變降解溫度或提供并改善共代謝降解環(huán)境方面進(jìn)一步探索,還可對(duì)芘的降解途徑、產(chǎn)物及芘污染土壤的實(shí)際修復(fù)效果方面深入開展研究,以期為石油烴污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)提供優(yōu)勢(shì)菌株和理論支持.

3 結(jié)論

3.1 采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高PAHs濃度的方法,從天津?yàn)I海濕地石油污染土壤中獲得能以PAHs芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株DYC-1,經(jīng)生理生化和16S rDNA分析鑒定為紅球菌(Rhodococcus sp. DYC-1).

3.2 紅球菌DYC-1與菌群H降解能力相似,可能是各菌株之間的拮抗作用導(dǎo)致或者紅球菌DYC-1是該菌群中的優(yōu)勢(shì)菌株.

3.3 紅球菌DYC-1具有較好的耐鹽能力,在10%鹽度條件下仍可以生長(zhǎng),同時(shí)在5%鹽度條件下仍可到達(dá)20%的芘降解率.

3.4 紅球菌DYC-1具有較廣的降解底物譜,可以降解低環(huán)PAHs菲、芴,可以降解代謝中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚,還可降解五環(huán)PAHs熒蒽,具有廣泛的降解潛力.

3.5 通過單因素?fù)u瓶實(shí)驗(yàn),得到了菌株DYC-1的最優(yōu)降解條件:菌株在低溫10℃,鹽度為2%的條件下,在pH值為8,初始濃度為20mg/L,搖床轉(zhuǎn)速為110r/min,接菌量為5%時(shí),能達(dá)到35%以上的降解率.

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Isolation, identification and analysis of degradation ability of a cold-resistant haloduric pyrene-degrading strains.

DIAO Shuo, WANG Hong-qi*, XU Jie, ZHAO Yi-cun
(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：667～685

The community H and single-strain DYC-1 was isolated by timing quantitative culture and domestication method of adding the concentration of PAHs gradatimfromTianjin coastal wetland petroleumcontaminated soil under the lowtemperature condition. The community H and single-strain DYC-1used pyrene as solo carbon source for growth. The bacteria were identified as Rhodococcus sp. based on the BLAST sequence analysis of 16s rDNA and its morphological and physio-biochemcial characteristics. Analysis results showed that the degrading ability of single-strain DYC-1 was similar to community H under the lowtemperature condition. The degradation rate of themwas above 35% at high concentrations of pyrene. The single-strain DYC-1 had more salt-resisting ability and wide substrate degradation ability. The optimal degradation conditions of single-strain DYC-1 was 2% salinity, pH8, 10℃, 110r/min rotate speed and 5% capacity of bacteria. The degradation rate of pyrene was high with 20mg/L initial concentration in the optimal degradation conditions.

cold-resistant；haloduric；pyrene；degradation；bioremediation

X172

A

1000-6923(2016)02-0677-09

刁 碩(1992-),女,山東荷澤人,北京師范大學(xué)碩士研究生,從事污染土壤修復(fù)與治理研究.

2016-04-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41372232);國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)重大課題(2013AA 06A205);中國博士后科學(xué)基金第54批面上資助項(xiàng)目

* 責(zé)任作者, 教授, whongqi310@sohu.com