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    用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測雞肉中的四環(huán)素類抗生素

    2017-04-08 14:02:15趙敬翠
    農(nóng)家科技下旬刊 2017年1期
    關(guān)鍵詞:標(biāo)板工作液類抗生素

    趙敬翠

    四環(huán)素類抗生素能促進(jìn)幼畜禽的快速生長,具有促生長作用,有些養(yǎng)殖戶受利益驅(qū)動,在動物的飼料、飲水中過量添加,造成畜產(chǎn)品中抗生素殘留。如果長期食用該藥殘的畜產(chǎn)品,會使人肌肉酸痛、肝腎損壞、骨骼生長發(fā)育受阻及易患四環(huán)素牙。因此,國家規(guī)定通過酶聯(lián)免疫法檢測雞肉中四環(huán)素類抗生素為不得檢出。

    目前酶聯(lián)免疫吸附法是我們縣區(qū)最常用的檢測方法。本文用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測雞肉中四環(huán)素類抗生素的含量,其原理是待測樣品中的四環(huán)素類藥物與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體,當(dāng)樣品中四環(huán)素類藥物含量少時,更多的抗體就會與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合而被固定在酶標(biāo)板上,加入酶標(biāo)記物,催化底物顯色,顏色為深藍(lán)色;反之,含量多時,顏色為淺藍(lán)色。

    一、實(shí)驗(yàn)材料

    樣品前處理:隨機(jī)抽取代表性樣品(雞肉)40批次,每個樣品取雞腿部肌肉,精確秤取1±0.01g,均質(zhì)后的樣品于50mL離心管中,充分渦動1min,4000g以上離心10min,立即取50uL上清液進(jìn)行檢測。

    試劑盒:四環(huán)素類酶聯(lián)免疫試劑盒(96孔)。北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

    試劑盒回溫:試劑盒內(nèi)各組份放于室內(nèi)恢復(fù)至室溫23-27℃。

    添加陽性對照:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定陽性對照濃度為6ppb,取濃度12.15ppb標(biāo)準(zhǔn)品494.0μL添加到1g空白樣品中,成為濃度6ppb的陽性對照品,用于計算陽性對照回收率。前處理同前。

    二、檢測步驟

    取出酶標(biāo)板,做雙孔平行,記錄標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品和樣品的位置。

    在標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液(0、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15ppb)50μL,在樣品孔內(nèi)依次加入陽性對照品、陰性對照品和其它待測樣品均為50μL。添加不同樣品時需更換槍頭,防止交叉污染。

    每孔加入50μL酶標(biāo)記物工作液,再每孔加入50μL抗體工作液。

    用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板,輕輕振蕩酶標(biāo)板10s,充分混勻,室溫(23-27℃)下避光反應(yīng)30min。

    揭開蓋板膜,倒掉孔中的液體,在每孔中加入260μL洗滌工作液(1份濃縮洗滌液加19份去離子水),洗滌4次,每次浸泡15-30s。最后一次清洗后,倒掉孔中洗液,將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上,拍干。(在亮光處觀察孔底是否有氣泡,氣泡可用干凈的槍頭戳破,戳不同孔底的氣泡應(yīng)更換槍頭)

    立即在每孔中加入100μL底物A、B混合液(按1:1比例充分混合,必須在5min內(nèi)使用,不能使用金屬盛裝、攪拌試劑)。

    用蓋板膜蓋好酶標(biāo)板,輕輕振蕩酶標(biāo)板10s,充分混勻,室溫(23-27℃)下避光反應(yīng)15-20min。

    揭開蓋板膜,每孔中加入50μL終止液,輕輕振蕩酶標(biāo)板10s,充分混勻。

    終止后5min內(nèi),將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀的載板架上,用酶標(biāo)儀在雙波長450nm、630 nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值,并將數(shù)值打印出來。

    三、計算陽性對照回收率

    利用電腦上r-biopharm數(shù)據(jù)分析軟件,把測得的數(shù)值錄入,軟件自動對結(jié)果進(jìn)行分析,同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出所有檢測樣品中四環(huán)素類抗生素的含量?;厥章剩?)=(實(shí)測陽性對照濃度—實(shí)測陰性對照濃度)÷添加濃度(6ppb)×100%,本次檢測回收率為95%,在75-105%范圍內(nèi),說明此次檢測和結(jié)果準(zhǔn)確性高。

    四、結(jié)語

    試劑盒貯存于2-8℃環(huán)境中,抗體和酶標(biāo)Ⅱ抗在常溫下容易變性。

    加樣時移液槍應(yīng)垂直于板孔,防止將液體加在孔壁上部;加等量同種試劑時應(yīng)用多道移液槍,提高速度,節(jié)省操作時間,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

    實(shí)驗(yàn)中的保溫避光反應(yīng)步驟,是抗原抗體反應(yīng)的完成過程,需要有一定的時間和溫度。因?yàn)榭乖c抗體結(jié)合的機(jī)會不均等,只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,這是一個逐步平衡的過程。

    洗板是很關(guān)鍵的一步。主要靠洗滌使游離的與結(jié)合的酶標(biāo)記物的達(dá)到分離目的,通過洗滌清除殘留在板孔中沒結(jié)合的物質(zhì)。如果洗滌次數(shù)不夠、注入的洗滌液量不足或洗板間隔太久會直接影響檢測的結(jié)果,甚至使實(shí)驗(yàn)失敗。

    檢測藥物殘留的常用方法有:高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法和酶聯(lián)免疫吸附法。目前我們常用的是酶聯(lián)免疫法,具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn),適用于大批量樣品篩查。

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