反復(fù)早期自然流產(chǎn)的遺傳因素分析及咨詢指導(dǎo)*

楊嵐，錢芳波，王俏霞，楊燦鋒，楊月芬，石皓，肖建平

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院 1.產(chǎn)前診斷中心，2.計劃生育部，江蘇 無錫 214002）

反復(fù)早期自然流產(chǎn)的遺傳因素分析及咨詢指導(dǎo)*

楊嵐1，錢芳波2，王俏霞2，楊燦鋒1，楊月芬2，石皓1，肖建平1

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院 1.產(chǎn)前診斷中心，2.計劃生育部，江蘇 無錫 214002）

目的 探討反復(fù)早期自然流產(chǎn)（RSA）與染色體異常的相關(guān)性，提供遺傳咨詢意見。方法 對248對（496例）有RSA史的夫婦進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞的染色體核型分析，對其中58例RSA患者取無菌絨毛進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備及核型分析。結(jié)果 248對RSA夫婦中，共檢出染色體異常核型19例，總異常檢出率為3.83%，其中，男性11例，女性8例。平衡易位是最主要的異常類型，共5例，9號臂間倒位5例，羅氏易位4例，染色體多態(tài)性3例，短臂增加、長臂缺失各1例。58例流產(chǎn)絨毛培養(yǎng)成功44例，其中染色體異常25例（56.82%），異常核型以三體癥最多（20/25，80%），其次為三倍體（3/25，12%），單體（2/25，8%）。結(jié)論 染色體異常尤其是絨毛染色體數(shù)目異常、外周血染色體易位是RSA的常見遺傳學(xué)原因，對RSA夫婦和流產(chǎn)絨毛進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析對明確病因、提供遺傳咨詢指導(dǎo)再次成功妊娠有著重要的臨床意義。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；絨毛；三體；核型分析；遺傳咨詢

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠22周內(nèi)連續(xù)發(fā)生≥2次的自然流產(chǎn)，其發(fā)生率占育齡婦女的1%～5%[1]，且有逐年上升趨勢[2]，是婦產(chǎn)科中較難防治的疾病。自然流產(chǎn)的病因較復(fù)雜，包括遺傳因素、免疫因素、內(nèi)分泌異常、感染、解剖異常、環(huán)境及其他未知因素，＞50%的早期流產(chǎn)是由胚胎染色體異常引起，且大多數(shù)為染色體數(shù)目異常[3]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)RSA的病因和發(fā)病機制目前尚不十分明確，但發(fā)生反復(fù)流產(chǎn)的夫婦其染色體異常率較一般人群高[4]，對這些高危人群進(jìn)行必要的遺傳學(xué)檢查，明確有無導(dǎo)致RSA的遺傳學(xué)因素，對今后指導(dǎo)他們再次妊娠進(jìn)行遺傳咨詢、提高出生人口素質(zhì)有著重要意義。本文對RSA夫婦及部分RSA流產(chǎn)絨毛進(jìn)行染色體核型分析，探討染色體異常與RSA的相關(guān)性，為RSA的遺傳學(xué)查因提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月-2015年6月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院就診的不明原因的RSA夫婦248對（496例）。其中，女性年齡20～45歲（平均28.35歲），男性年齡21～45歲（平均29.48歲），流產(chǎn)次數(shù)2～6次，夫婦雙方均表型正常，身體健康。

1.2 檢測方法

1.2.1 夫婦染色體檢查 抽取夫婦雙方外周血肝素抗凝，進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，常規(guī)收獲細(xì)胞，低滲，固定，制片G顯帶；每例計數(shù)分散較好的30個中期分裂相細(xì)胞，核型分析3～5個細(xì)胞，G顯帶，顯微鏡下進(jìn)行染色體核型分析，異常者核型分析及計數(shù)加倍。

1.2.2 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛染色體培養(yǎng)及核型分析 選取2014～2015年RSA患者中經(jīng)超聲診斷胚胎停育或難免流產(chǎn)在本院行清宮手術(shù)的孕婦58例，年齡20～43歲，平均30.3歲，排除內(nèi)分泌，免疫、子宮畸形，感染等因素，孕齡52～98d。清宮手術(shù)時無菌采集絨毛組織約10 mg，用無菌生理鹽水洗滌后，于顯微鏡下挑取優(yōu)質(zhì)絨毛組織，切成細(xì)小碎片，接種于含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。靜置6～7 d后，倒置顯微鏡下觀察到梭形細(xì)胞克隆后給予換液；繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)出現(xiàn)較多圓形細(xì)胞時給予收獲、制片。75℃烤箱烤片2～3 h，G顯帶及姬姆薩染色，每張片子顯微鏡下計數(shù)30個中期分裂相，分析3～5個核型，發(fā)現(xiàn)有嵌合現(xiàn)象加倍分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率或百分比表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSA夫婦外周血染色體分析結(jié)果

共檢出異常核型19例，異常核型率3.83% （19/496）。其中，男性染色體異常11例，女性8例，但男性的染色體核型異常率（4.43%，11/248）與女性的核型異常率（3.23%，8/248）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.493，P=0.483）。結(jié)構(gòu)異常共9例，其中最常見為平衡易位（5例）、羅氏易位（4例），兩者共占異常核型的47.4%（9/19）；其次為9號染色體臂間倒位5例，占26.3%（5/19）；3例為染色體多態(tài)性，占15.8%（3/19），包括隨體增大2例，雙隨體1例；染色體部分缺失或增多各1例（共占10.5%，2/19）。見表1、2。

表1 248對RSA夫婦女性異常核型結(jié)果

表2 248對RSA夫婦女男性異常核型結(jié)果

2.2 絨毛染色體核型分析結(jié)果

絨毛培養(yǎng)成功的44例核型中，檢出異常核型25例，異常檢出率為56.82%（25/44），其中單體（Turner綜合癥）2例（8%），三倍體3例（12%），常染色體三體共計20例（80%），其中1例為三體嵌合型。絨毛染色體異常患者中，年齡≥35歲患者6例（24%，6/25）。見表3。

表3 25例絨毛染色體核型異常結(jié)果

3 討論

3.1 反復(fù)早期自然流產(chǎn)夫婦與外周血染色體異常的相關(guān)性分析及遺傳咨詢

我國一般人群中染色體異常率為0.47%[5]，＞2次自然流產(chǎn)史的夫婦中，染色體異常的患者可達(dá)3%～10%[6-7]。本資料顯示，早期RSA染色體異常核型18例，異常率為3.83%，高于一般人群，且男性多于女性，與文獻(xiàn)報道相符[6-7]。

本組資料中，發(fā)現(xiàn)5例平衡易位攜帶者，占比最高（26.3%，5/19）。染色體平衡易位攜帶者通常無表型改變，但在配子形成過程中可產(chǎn)生18種配子，僅1種是正常配子，1種是與親代相同的平衡易位攜帶者配子，其余均為不平衡配子，當(dāng)異常精子或卵子與正常卵子或精子結(jié)合后，由于遺傳物質(zhì)的不平衡可致流產(chǎn)、死胎、或者部分單體和部分三體的患者[8]。平衡易位是染色體結(jié)構(gòu)重組，基本不涉及遺傳物質(zhì)的丟失，絕大部分染色體斷裂點位于DNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，所以盡管染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但基因在總體上保持?jǐn)?shù)量的平衡并能行使正常功能，故患者表型和智力一般都正常。該類患者在遇到妊娠失敗或生育畸形患兒等情況下才得以發(fā)現(xiàn)，故常得不到及早發(fā)現(xiàn)及相應(yīng)的處置[9]。該類患者由于自然生育過程中形成正常配子或與親代相同的易位攜帶者配子的概率各僅1/18，故對其遺傳咨詢意見建議可先通過輔助生殖方式行胚胎植入前診斷再受孕，以避免反復(fù)流產(chǎn)造成的生理和精神損害。

此外，筆者還發(fā)現(xiàn)4例羅氏易位（21.1%），非同源羅氏易位在形成生殖細(xì)胞時，經(jīng)減數(shù)分裂可產(chǎn)生6種類型的配子，1種正常，1種為平衡型配子，其余4種為不平衡型配子，不平衡配子由于遺傳物質(zhì)不平衡可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎；如為同源羅氏易位攜帶者，則一般子代只有形成易位型三體或單體可能，故100%發(fā)生流產(chǎn)或畸胎，該類攜帶者雖多數(shù)表型正常，但與正常人婚配后，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或生育染色體病患兒的遺傳概率較高。本資料還檢出5例9號染色體臂間倒位（異常占比26.3%），Inv（9）（p12q13）為最常見的9號染色體倒位形式。倒位與易位一樣一般無遺傳物質(zhì)的丟失，其表型正常。但根據(jù)遺傳規(guī)律，倒位染色體在減數(shù)分裂時形成倒位環(huán)，分離后形成4種配子，1種正常，1種倒位，另外2種為部分重復(fù)和缺失的無著絲粒或雙著絲粒的不平衡配子，遺傳性狀不穩(wěn)定，因此倒位攜帶者夫婦也易多發(fā)自然流產(chǎn)[10]。鑒于倒位攜帶者其遺產(chǎn)機制易導(dǎo)致的不平衡結(jié)構(gòu)，多種研究顯示會引發(fā)生殖異常。本資料報道的倒位與羅氏易位一樣在異常核型中占比也較高，故在RSA夫婦中應(yīng)引起重視，宜先行雙方染色體檢查，根據(jù)染色體異常情況再提供遺傳咨詢指導(dǎo)。對于該類臂間倒位和非同源羅氏易位患者，咨詢時根據(jù)其后代正常配子產(chǎn)生的概率（分別為1/4和1/6）給予指導(dǎo)，該類夫婦可選擇自然受孕或胚胎植入前診斷的輔助受孕方式，后者可預(yù)防染色體異常所致的反復(fù)流產(chǎn)，以提高出生人口素質(zhì)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)3例多態(tài)性染色體（占比15.8%），染色體多態(tài)性是指廣泛存在于正常人群中染色體的各種微小變異，主要表現(xiàn)為異染色質(zhì)變異，特別是含有高度重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，分別位于人類染色體1、9、16和Y染色體異染色質(zhì)區(qū)和每條染色體著絲粒區(qū)。染色體多態(tài)性變異是否有臨床效應(yīng)，一直頗受爭議和關(guān)注[11]。近來有報道顯示，隨體變異易導(dǎo)致不良孕產(chǎn)史[12]，并提出該機制可能與其阻礙紡錘絲與著絲粒復(fù)合體的聯(lián)系而導(dǎo)致染色體的正確分離有關(guān)[13]。本資料顯示，隨體變異發(fā)生率為1.2%（3/248）與王晶等[14]報道的接近，但該類變異與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性還有待更多的研究加以佐證。近年有報道D組/G組染色體隨體變異與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)[15]，但該類多態(tài)性對生殖的影響及作用機制還有待于分子水平的進(jìn)一步研究。

3.2 反復(fù)自然流產(chǎn)與流產(chǎn)物染色體異常等遺傳因素的關(guān)系

本資料顯示，44例培養(yǎng)成功的流產(chǎn)絨毛中，染色體異常檢出率為56.82%，其中染色體數(shù)目異常＞90%，與TAVOKINA[16]報道的相符。異常結(jié)果中，常染色三體占比最高（80%），其次為三倍體，單體癥。除外2例三體征[47，XY，+7，inv（9）和47，XY，+13，inv （9）]的夫婦有9號臂間倒位的結(jié)構(gòu)異常外，其余23例絨毛染色體異常的雙親均無染色體異常（23/25，占異常受檢樣本的92%）；三體癥中高齡孕婦比例為30%（6/20），可見在染色體正常的人群生育過程中因高齡等原因發(fā)生配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時發(fā)生染色體不分離的概率也較高。此外，三體癥中雖僅有1例為嵌合體（占5%）低于文獻(xiàn)報道流產(chǎn)絨毛胎盤組織特異性嵌合型的發(fā)生率10%～25%[17-18]，可能與本資料培養(yǎng)的絨毛例數(shù)較少有關(guān)。綜上，RSA與絨毛染色體異常尤其是數(shù)目異常密切相關(guān)，對流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常的遺傳咨詢：多數(shù)研究報道，為受精卵配子形成過程中染色體不分離所致，多為散發(fā)，如雙親染色體正常，在排除內(nèi)分泌、免疫、感染、解剖因素后，復(fù)發(fā)風(fēng)險低，對個體影響小，可在優(yōu)生指導(dǎo)下自然受孕；對于胚胎染色體數(shù)目正常但結(jié)構(gòu)異常者，可進(jìn)一步檢測雙親有無該結(jié)構(gòu)異常，從而明確胚胎染色體異常的遺傳來源，再根據(jù)雙親染色體結(jié)果對下次受孕咨詢指導(dǎo)，如為家族性染色體異常，復(fù)發(fā)風(fēng)險高，對個體影響大，可采取胚胎植入前診斷來篩選正常胚胎；對于絨毛染色體、夫婦外周血核型結(jié)果均正常的RSA患者，雖然無染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，但如排除免疫、內(nèi)分泌、生物感染等因素外，亦可能與該類患者的基因表達(dá)異?；騂LA-G 14 bp等基因的多態(tài)性有關(guān)[19-20]，這有待今后進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，推薦適齡生育，建議對RSA患者首選流產(chǎn)絨毛染色體檢查，再結(jié)合夫婦雙方的細(xì)胞遺傳學(xué)分析，對明確有無RSA的遺傳因素、提供合理的優(yōu)生遺傳咨詢、指導(dǎo)再次成功妊娠有積極重要的作用。

[1] 林其德,邱麗華.免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機制及診斷和治療[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2009,29(11):1275-1278.

[2] LEE R M,SILVER R M.Recurrent pregnancy loss:summary and clinical recommendations[J].Semin Reprod Med,2000,18(4):433.

[3] SUCIU N,PLAIASU V.A time stamp comparative analysis of frequent chromosomal abnormalities in romanian patients[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2014,27(1):1-6.

[4] 李亞麗,高健,余小平,等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與染色體相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健,2013,28(22):3615-3618.

[5] 周煥康.人類染色體[M].北京:科學(xué)出版社,1987:268-337.

[6] MACHTINGER R,GODIEB W H.Placental site trophoblastic tumor:outcome of five cases including fertility preserving management[J].J Gynecol Oncol,2005,96(1):56-61.

[7] 黃肖利,梅端客,黃毅.218對反復(fù)自然流產(chǎn)或胚胎停育史夫婦細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(22):3021-3023.

[8] 夏家輝,李麓蕓.染色體病[M].北京:科學(xué)出版社,1989.

[9] 袁宏濤,李偉.染色體檢測在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的臨床意義的研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(4):37.

[10] 趙靜,鄭梅玲,張桂林.1 558對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)復(fù)發(fā)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J].中國優(yōu)生與遺傳,2011,19(2):50.

[11] 黃國娟,龐麗紅.染色體多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)關(guān)系的探討[J].微創(chuàng)醫(yī)學(xué),2011,6(4):311.

[12] 王敏,劉江.染色體隨體增大與不良孕產(chǎn)史關(guān)系探討[J].中國男科學(xué)雜志,2006,20(11):39-41.

[13] 焦海燕,墻克信,陳銀濤,等.不良孕產(chǎn)史夫婦著絲粒-動粒復(fù)合體的細(xì)胞遺傳學(xué)研究[J].遺傳,2001,23(1):344-346.

[14] 王晶,吳曉妍,虞斌,等.染色體多態(tài)性在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的意義[J].常州實用醫(yī)學(xué),2011,27(2):84-86.

[15] 劉念,閻炯,宋婕萍,等.染色體多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2015,31(1):75-77.

[16] TAVOKINA L V,BROVKO A A,SOPKO I A,et al.Karyotyping results of spontaneous abortions and miscarriages specimens obtained after using assisted reproductive technologies[J].Tsitol Genet,2013,47(1):74-79.

[17] HAOUD K,MELLALI S,GOUAS L,et al.Prevalence of aneuploidies in products of spontaneous abortion:interest of FISH and MLPA[J].Morphologie,2014,98(320):40-46.

[18] LEBEDEV L.Mosaic aneuploidy in early fetal losses[J].Cytogenet Genome Res,2011,133(2/3/4):169-183.

[19] AMIRCHAGHMAGHI E,REZAEI A,MOINI A.Gene expression analysis of VEGF and its receptors and assessment of its serum level in unexplained recurrent spontaneous abortion[J]. Cell J,2015,16(4):538-545.

[20] AFKHAMI F,SHEKARI KHANIANI M,FARZADI L,et al. The HLA-G 14bp insertion/deletion polymorphism in women with recurrent spontaneous abortion[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2014,13(5):364-369.

Exploration on genetic etiology in recurrent spontaneous abortion and gentetic counseling*

Lan Yang1,Fang-bo Qian2,Qiao-xia Wang2,Can-feng Yang1, Yue-fen Yang2,Hao Shi1,Jian-ping Xiao1
(1.The Center of Prenatal Diagnosis;2.Department of Family Planning,Wuxi Maternal and Child Health Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214002,China)

ObjectiveTo explore the relationship between early recurrent spontaneous abortion and chromosome abnormality,and to provide proper genetic counseling.Methods Lymphocytes in peripheral blood of 248 couples (496 cases)with early recurrent spontaneous abortion were collected,then chromosomal karyotyping was performed.Fetal chorionic villus samples were collected from 58 cases of women diagnosed with recurrent spontaneous abortion before 14 weeks gestation.All villi specimens were cell cultured and karyotyped to confirm the fetal chromosomal status.Results Among 248 couples of recurrent spontaneous abortion,19 cases with abnormal karyotypes were detected,the total abnormal rate was 3.83% (19/496). Among those samples,11 men and 8 women with abnormal karyotypes,including 5 cases of balanced translocation,5 cases of inversion in chromosome 9,4 cases of Roche translocation,3 cases of chromosomal polymorphism,and 2 cases of chromosomal deletion or addition.Among 44 successfully cultured and karyotyped samples,the chromosomal abnormality rate was 56.82%.The results of karyotyping yielded 18 autosomal trisomies(20/25,80%),3 cases of triploidy(3/25,12%),and 2 cases of monosomy X(2/25,8%).Conclusions Embryo chromosomal abnormality and translocation karyotype are two of the main important contributors to early recurrent spontaneous abortion.Chromosome examination among the couples of recurrent spontaneous abortion and chorionic villous samples has important influence on identification of etiology and genetic counselingin routine prepotent work.

recurrent spontaneous abortion;chorionic villus;trisomy;karyotyping;genetic counseling

R714.21

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.023

1005-8982（2017）05-0108-04

2016-04-11

江蘇省婦幼保健重點資助項目（No：F201315）；江蘇省無錫市科技局項目（No：CSE31N1511）；江蘇省無錫市醫(yī)管中心面上項目（No：YGZXM1510）

肖建平，E-mail：jianpingx999@126.com；Tel：0510-82725161