三陰性乳腺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體-3的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及意義

黃少江

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 腫瘤科，重慶 400037）

三陰性乳腺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體-3的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及意義

黃少江

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 腫瘤科，重慶 400037）

目的 探討三陰性乳腺癌（TNBC）組織中表皮生長(zhǎng)因子受體-3（HER-3）的表達(dá)情況，以及與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性和臨床意義。方法 收集TNBC患者術(shù)后組織標(biāo)本及臨床資料，不同的表達(dá)水平的HER-3采用免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）法檢測(cè)，分析HER-3與臨床病理特征及肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，其預(yù)后采用生存分析法（Kaplan-Meier）分析。結(jié)果 TNBC組織中HER-3的檢測(cè)陽(yáng)性率為72.63%（69/95），陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNBC組織中HER-3陰性與HER-3陽(yáng)性組患者中位無(wú)病生存期（DFS）分別為18.4和14.5個(gè)月，中位總生存期（OS）分別為31.2和26.3個(gè)月，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 HER-3在TNBC組織中過(guò)度表達(dá)，與淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)，是不良預(yù)后的重要因素，可作為TNBC預(yù)后評(píng)估非常有潛力的生物學(xué)標(biāo)志物。

表皮生長(zhǎng)因子受體-3；三陰乳腺癌；肝轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中預(yù)后最差的類型。固體惡性腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展的先決條件是腫瘤相關(guān)血管的生成，表皮生長(zhǎng)因子受體是調(diào)節(jié)許多腫瘤血管生成的主要治療靶點(diǎn)[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為篩選特異性靶標(biāo)，開(kāi)拓治療新方案，實(shí)現(xiàn)早期診斷，是當(dāng)前胃癌研究的重點(diǎn)方向。血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，表皮生長(zhǎng)因子受體屬于酪氨酸激酶家族，在細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用。表皮生長(zhǎng)因子受體-3（epithelial growth factor receptor-3,HER-3/ErbB-3）近年來(lái)成為腫瘤的研究熱點(diǎn)[2]，但HER-3是否與TNBC肝轉(zhuǎn)移相關(guān)鮮見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析HER-3蛋白在TNBC組織中表達(dá)情況，分析與臨床病理特征及肝轉(zhuǎn)移性的相關(guān)性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年7月-2012年12月于在第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院確診的TNBC 95例女性乳腺癌術(shù)后患者。年齡39～69歲，平均56歲；病理分級(jí)Ⅰ期10例，Ⅱ期48例，Ⅲ期37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。乳腺癌經(jīng)2位病理學(xué)專家診斷確定，其診斷和分級(jí)參照2010年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。免疫組化標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定及石蠟包埋；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)新鮮組織置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。從術(shù)后第1天開(kāi)始進(jìn)行隨訪≥3年，主要采用電話、門診等方式。

1.2 主要試劑及方法

①由Abcam公司（英國(guó)）購(gòu)進(jìn)兔抗人ErbB-3單克隆抗體及免疫組織化學(xué)（streptavidin-perosidase，SP）法試劑盒。免疫組織化學(xué)技術(shù)采用三步法，標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，烘干脫蠟水化，3%過(guò)氧化氫H2O2室溫孵育15 min，高壓修復(fù)1.5 min，加入一抗（濃度1∶100）4℃過(guò)夜。加入二抗及鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法各室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、蘇木精染色、封片鏡檢。②Western blot法：裂解組織制作樣品，煮沸4 min后取每個(gè)樣品總量25 μl，行電泳轉(zhuǎn)膜，加ErbB-3和β-肌動(dòng)蛋白（β-action）抗體的封閉過(guò)夜。然后洗膜加二抗孵育洗膜顯影。

1.3 結(jié)果判斷

在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)染色程度和陽(yáng)性染色細(xì)胞所占百分取其平均數(shù)為最后得分。（-）與（±/+）定義為陰性，（++）與（+++）定義為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，生存分析用生存分析法（Kaplan-Meier）法及Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-3在TNBC組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HER-3陽(yáng)性率為72.63%（69/95），主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，極少部分表達(dá)于細(xì)胞核；HER-3（-）為11.58%（11/95），HER-3（±/+）為15.79%（15/95），HER-3（++）為33.68%（32/95），HER-3（+++）為38.95%（37/95）。見(jiàn)圖1。

2.2 HER-3與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HER-3的陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌患者年齡、核分級(jí)、P53及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），HER-3的陽(yáng)性表達(dá)與分期、淋巴結(jié)狀況存在相關(guān)性（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 HER-3與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HER-3蛋白在TNBC中的表達(dá)

應(yīng)用兔抗人HER-3單克隆抗體對(duì)TNBC癌旁組織和癌組織測(cè)及灰度測(cè)定和分析，特異性染色條帶出現(xiàn)在約185kD處，證實(shí)HER-3的表達(dá)量與病理分期相關(guān)（見(jiàn)圖2）。組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），在癌旁組織中HER-3蛋白表達(dá)量最低，分期越晚表達(dá)量越高，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見(jiàn)表2。

表2 HER-3蛋白在TNBC中的表達(dá)

圖2 HER-3蛋白在TNBC中的表達(dá)

2.4 HER-3表達(dá)與TNBC肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

隨訪期間38例患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，HER-3表達(dá)分為陰性（-和±/+）肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率低于陽(yáng)性（++、+++）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018），見(jiàn)表3。

表3 HER-3表達(dá)與肝臟轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

2.5 HER-3不同表達(dá)對(duì)TNBC預(yù)后的影響

TNBC組織中HER-3陰性與HER-3陽(yáng)性中位DFS分別為：18.4和14.5個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.000）。HER-3陰性與陽(yáng)性中位OS分別為31.2和26.3個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見(jiàn)圖3。

圖3 HER-3陰性及陽(yáng)性對(duì)乳腺癌DFS（左）和OS（右）的影響

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管隨著手術(shù)水平的提高，放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療的應(yīng)用，乳腺癌的生存期得到明顯的提高。但三陰乳腺癌由于其異質(zhì)性，預(yù)后仍非常差[3]。對(duì)乳腺癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚，可能包括自身基因的異常表達(dá)、腫瘤血管的異常增生、免疫功能低下及炎癥因子的持續(xù)存在等多種因素。早期乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素對(duì)預(yù)后起著至關(guān)重要的作用，不僅是臨床病理學(xué)改變，也包括分子生物學(xué)標(biāo)志物的異常改變。探索一種可靠的生物標(biāo)志物，將有助于乳腺癌早期診斷及改善治療方案，并預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。鑒于在乳腺癌細(xì)胞增殖發(fā)生至關(guān)重要的作用，細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物是潛在的評(píng)估TNBC風(fēng)險(xiǎn)的重要工具。

人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族蛋白過(guò)度表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，其家族主要成員為HER-1或EGFR、HER-2、HER-3和HER-4，這4個(gè)基因可與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）膜結(jié)合形成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。該受體有著相似的結(jié)構(gòu)，包括胞外配體結(jié)合域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)。受體功能的特征在于均相/異源響應(yīng)于配體結(jié)合，激酶結(jié)構(gòu)域活化，C末端酪氨酸殘基自磷酸化，并對(duì)接蛋白質(zhì)以引發(fā)下游信號(hào)的酪氨酸磷酸化。該受體存在多個(gè)特性，包括配體和受體表達(dá)的特定細(xì)胞型態(tài)，配體和受體的亞細(xì)胞分離，并且細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合蛋白，多樣性的放大或衰減HER家族信號(hào)傳導(dǎo)的控制。HER家族中研究最多的因子是VEGF和HER-2，但近來(lái)有學(xué)者提出HER-3可能成為癌癥生物學(xué)中研究的一個(gè)新目標(biāo)[4]。但不少研究者認(rèn)為，單靶點(diǎn)的治療可能導(dǎo)致耐藥，能多靶點(diǎn)作用于HER家族的是未來(lái)靶向治療的新目標(biāo)。與其他家庭成員一樣HER-3受體可以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能受體過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞活力和促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移形成[5]。由于其激酶活性缺失，HER-3不能在二聚體激活信號(hào)；然而HER-3配體的存在，可以促進(jìn)EGFR和HER-2激酶的活性，從而誘導(dǎo)C末端磷酸化，磷酸化酪氨酸殘基的結(jié)合，招募Src同源結(jié)構(gòu)域（Src homology domain，SH2）結(jié)構(gòu)域的蛋白以及多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）結(jié)合蛋白，最終導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活[6]，因此阻斷HER-3抗體，可以提高抗腫瘤作用。HER-3銜接蛋白SHCA，以及增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo) HER-2介導(dǎo)的磷脂酰肌醇 -3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）激活，并涉及與Rac1蛋白、Pak1的細(xì)胞表面整合和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架共定位在細(xì)胞膜突起的前緣導(dǎo)致細(xì)胞遷移。在許多腫瘤中看來(lái)，HER-3作為RTK和PI3K激活之間的主要環(huán)節(jié)，其最近為選擇性抑制PI3K信號(hào)途徑RTK驅(qū)動(dòng)腫瘤得到重視。由于HER-3配體的存在，可以促進(jìn)EGFR和HER-2激酶的活性，從而誘導(dǎo)的HER-3的C末端磷酸化。通過(guò)誘導(dǎo)EGFR和HER-2激酶抑制劑，阻斷HER-3抗體，可以提高抗腫瘤作用。但如何阻斷HER-3的活性以及EGFR和HER-2通路，成為目前的研究難題。

HER-3表達(dá)與胃癌進(jìn)展參數(shù)顯著相關(guān)，包括腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和疾病復(fù)發(fā)，其陽(yáng)性表達(dá)有著較差的生存，它可能成為一個(gè)新靶向治療的目標(biāo)[7]。KA DAMASCENO等[8]在動(dòng)物模型的胃癌中發(fā)現(xiàn)HER-3≤90%陽(yáng)性表達(dá)，如何利用這些高表達(dá)因子來(lái)為人類惡性腫瘤的治療奠定基礎(chǔ)是目前關(guān)注的熱點(diǎn)。H STYCZEN等[9]在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中發(fā)現(xiàn)HER-2的過(guò)表達(dá)僅8%，而HER-3 有75%出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，他們認(rèn)為HER-3的靶向治療可能在未來(lái)會(huì)超越HER-2和EGFR，但前期仍然需要大量的基礎(chǔ)研究和臨床數(shù)據(jù)[10]。SY BAE等[11]發(fā)現(xiàn)，HER-3過(guò)度表達(dá)是三陰乳腺癌患者不良預(yù)后的重要指標(biāo)，可能是HER-2和EGFR陰性的患者使用靶向藥另一個(gè)方向；然而一些研究者發(fā)現(xiàn)，HER-3的表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后沒(méi)有直接相關(guān)性[12]，因此HER-3在乳腺癌中的作用以及與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性還有待驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，HER-3在TNBC組織中過(guò)度表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)狀況以及肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率相關(guān)。無(wú)論中位DFS還是OS陽(yáng)性組均低于陰性組，這與一些學(xué)者的研究基本一致[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HER-3陽(yáng)性表達(dá)的TNBC患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。綜上所述，HER-3在TNBC組織中過(guò)度表達(dá)，與淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)，是不良預(yù)后的重要因素，可作為TNBC預(yù)后評(píng)估非常有潛力的生物學(xué)標(biāo)志物。

[1] KHELWATTY S A,ESSAPEN S,SEDDON A M,et al.Acquired resistance to anti-EGFR mAb ICR62 in cancer cells is accompanied by an increased EGFR expression,HER-2/HER-3 signalling and sensitivity to pan HER blockers[J].British Journal of Cancer,2015,113(7):1010-1019.

[2] WANG L,YUAN H,LI Y,et al.The role of HER3 in gastric cancer[J].Biomed Pharmacother,2014,68(6):809-812.

[3] DISIS M L,STANTON S E.Triple-negative breast cancer:immune modulation as the new treatment paradigm[J].American Society Clinical Oncology Educational Book,2015(35):e25-30.

[4] CUI X F,ZHOU W M,YANG Y,et al.Epidermal growth factor upregulates serotonin transporter and its association with visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(37):13521-13529.

[5] GALA K,CHANDARLAPATY S.Molecular pathways:HER3 targeted therapy[J].Clinical Cancer Research,2014,20(6):1410-1416.

[6] SHA H,LI R,BIAN X,et al.A tumor-penetrating recombinant protein anti-EGFR-iRGD enhance efficacy of paclitaxel in 3D multicellular spheroids and gastric cancer in vivo[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2015(77):60-72.

[7] CILIBERTO D,STAROPOLI N,CAGLIOTI F,et al.A systematic review and meta-analysis of randomized trials on the role of targeted therapy in the management of advanced gastric cancer: Evidence does not translate[J].Cancer Biology Therapy,2015,16(8): 1148-1159.

[8] DAMASCENO K A,FERREIRA E,ESTRELA-LIMA A,et al. Relationship between the expression ofversican and EGFR, HER-2,HER-3 and CD44 in matrix-producing tumours in thecanine mammary gland[J].Histology&Histopathology,2016,31(6): 675-688.

[9] STYCZEN H,NAGELMEIER I,BEISSBARTH T,et al.HER-2 and HER-3 expression in liver metastases of patients with colorectal cancer[J].Oncotarget,2015,6(17):15065-15076.

[10] ZHANG N,CHANG Y,RIOS A,et al.HER3/ErbB3,an emerging cancer therapeutic target[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2016,48(1):39-48.

[11] BAE S Y,LA CHOI Y,KIM S,et al.HER3 status by immunohistochemistry is correlated with poor prognosis in hormone receptor-negative breast cancer patients[J].Breast Cancer Research and Treatment,2013,139(3):741-750.

[12] KARAMOUZIS M V,DALAGIORGOU G,GEORGOPOULOU U, et al.HER-3 targeting alters the dimerization pattern of ErbB protein family members in breastcarcinomas[J].Oncotarget,2016, 7(5):5576-5597.

[13] KANG J C,POOVASSERY J S,BANSAL P,et al.Engineering multivalent antibodies to target heregulin-induced HER3 signaling in breast cancercells[J].MAbs,2014,6(2):340-353.

Significance of HER-3 in predicting liver metastasis in three negative breast cancer patient

Shao-jiang Huang
(Department of oncology,the Third Military Medical University Xinqiao Hospital, Chongqing 400037,China)

Objective To investigate the expression of HER-3 in TNBC tissues,and to explore the relationship and clinical value with liver metastasis.Methods TNBC tissue specimens and clinical data were collected,and the expression of HER-3 was detected by immunohistochemical and Western blot method.Clinicopathological features and correlation with liver metastasis were analyzed,and the prognosis was analyzed by Kaplan Meier survival analysis.Results The positive rate of HER-3 in TNBC was 72.63% (69/95),and had correlation with TNM stage and lymph node status but not related to nuclear grade,p53 or tumor size.The incidence of liver metastasis in HER-3 positive group was significantly higher than the negative group statistically.The median DFS of HER-3 negative and positive group were 18.4 and 14.5 months,and the median OS was 31.2 and 26.3 months with statistically significant.Conclusions The HER-3 expresses in TNBC,and promotes the invasion of cancer cells,and is closely related to liver metastasis,and can be used as a potential biomarker for assessing the prognosis of TNBC.

HER-3;triple-negative breast cancer;liver metastasis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.007

1005-8982（2017）05-0033-05

2016-08-08