葛根素通過p38MAPK通路抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡*

于冬冬，趙丹陽

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨一科，遼寧 沈陽110032；2.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110041）

葛根素通過p38MAPK通路抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡*

于冬冬1，趙丹陽2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨一科，遼寧 沈陽110032；2.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110041）

目的 探索葛根素（PUE）抑制地塞米松（DEX）誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法 MC3TEE1細(xì)胞培養(yǎng)傳代，MTS法檢測不同濃度的PUE及DEX對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響，免疫熒光檢測PUE對細(xì)胞凋亡的抑制作用，Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表達(dá)情況。Real time PCR檢測Caspase-3的基因表達(dá)情況。ELISA檢測加入p38MAPK通路抑制SB203580后對凋亡的影響。結(jié)果 MTS顯示10-7、10-8mol/L濃度的PUE作用24 h后明顯增加細(xì)胞的增殖活性，10-6、10-7mol/L濃度的DEX作用48 h后抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，免疫熒光顯示加入10-8mol/L的PUE后細(xì)胞凋亡受到抑制。Western blot結(jié)果顯示，加入DEX后，p-p38MAPK的表達(dá)上調(diào)，DEX和PUE共同處理后，DEX誘導(dǎo)的p-p38MAPK的磷酸化受到抑制。Real time PCR顯示，DEX處理后Caspase-3 mRNA基因表達(dá)明上調(diào)，而DEX和PUE共同作用后，Caspase3 mRNA基因表達(dá)下調(diào)。ELISA顯示DEX處理后，細(xì)胞的凋亡明顯增加。加入PUE+DEX處理后，細(xì)胞的凋亡受到抑制，基本恢復(fù)到正常的水平。SB203580+DEX共同處理后，細(xì)胞凋部分被抑制。結(jié)論 葛根素抑制地塞米松誘導(dǎo)的MC3TE-E1細(xì)胞凋亡通過p38MAPK通路。

葛根素；地塞米松；凋亡；p38MAPK

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）被廣泛應(yīng)用于臨床，其長期應(yīng)用存在較高的骨丟失及骨折的風(fēng)險，臨床上稱之為GCs誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP），GIOP最主要的原因是骨的形成受到抑制[1]。大量或長期應(yīng)用GCs抑制成骨細(xì)胞的成熟和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡。葛根素（puerarin，PUE），是傳統(tǒng)中藥葛根的主要異黃酮，在治療各種疾病中已得到廣泛應(yīng)用[2-6]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有抗細(xì)胞凋亡的作用，如肝細(xì)胞、腎細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞[7-9]。葛根素能否抑制地塞米松（dexamethasone，DEX）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡及其抗凋亡機(jī)制是本研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

葛根素（溶于無水乙醇，儲存濃度10-5mol/L，置入-20℃冰箱冷凍保存，南京狄爾格公司），地塞米松（Dexamethasone，溶于無水乙醇，儲存濃度10-5mol/L，置入-20℃冰箱冷凍保存，Sigma公司），a-MEM培養(yǎng)基（Hyclone），細(xì)胞增殖與毒性檢測（MTS）試劑盒（Promega，美國），細(xì)胞凋亡酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒（羅氏公司，德國），p38MAPK、p-p38MAPK抗體（Cell signaling公司，美國），Real time PCR試劑盒（TaKaRa，大連），細(xì)胞免疫固定液、細(xì)胞免疫洗滌液、抗熒光淬滅封片液、DAPI染液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自碧云天有限公司。

1.2 主要儀器

倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀器（Mx 3000P real time PCR system，Applied Biosystems，美國），培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），免疫熒光顯微鏡（Nikon，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1，購自美國American Type Culture Collection（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)方法[10]，a-MEM培養(yǎng)基：含10%胎牛血清，用20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES），100 u/ml青霉素，鏈霉素100 μg/ml，50 μg/ml的抗壞血酸，在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。2次/周換液，細(xì)胞傳代培養(yǎng)用0.05%胰蛋白酶和0.01%的乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）。

1.3.2 MTS測定PUE及DEX對細(xì)胞增殖活性的影響 細(xì)胞分組：空白組、培養(yǎng)基組、對照組、10-6～10-10mol/L的PUE組及DEX組。細(xì)胞平鋪（5× 103個細(xì)胞/孔）96孔平板中，每孔總體積應(yīng)為100μl，培養(yǎng)24 h后，按分組加入不同濃度的PUE 及DEX，細(xì)胞經(jīng)處理（PUE 24 h、DEX 48 h）后，每孔加20μl CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent。在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。490 nm讀取吸光度值。OD值=（PUE處理后細(xì)胞OD值或?qū)φ战M細(xì)胞OD值-培養(yǎng)基組OD-空白組OD值），n＞3。

1.3.3 免疫熒光檢測DEX誘導(dǎo)hFOB1.19細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞分組：①對照組；②DEX（10-6mol/L）；③DEX（10-6mol/L）+PUE（10-8mol/L）。MC3T3-E1細(xì)胞（3×104細(xì)胞/孔）鋪于6孔板中，細(xì)胞達(dá)到70%融合后。①加入培養(yǎng)基；②加入DEX處理48 h；③PUE預(yù)處理24 h后加入DEX處理48 h，吸除培養(yǎng)基。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）清洗細(xì)胞3 min×2，每孔加入細(xì)胞免疫固定液1 ml，固定60 min，PBS清洗細(xì)胞3 min×2，加入細(xì)胞免疫洗滌液1 ml（含Trixon 100），冰浴2 min。PBS清洗細(xì)胞3 min×2，每孔加入1 ml DAPI染液，避光孵育5 min后，加入抗熒光淬滅封片液封片后，免疫熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡率=每視野凋亡細(xì)胞/每視野細(xì)胞總數(shù)，n＞3。

1.3.4 Western blot檢測 p38MAPK、p-p38MAPK抗體蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組：DEX（10-6mol/L）對蛋白表達(dá)影響（對照組，DEX處理后5、30及60 min），PUE（10-8mol/L）對DEX處理后蛋白的表達(dá)影響（對照組，DEX組，DEX+PUE組控，細(xì)胞處理方法同1.3）。細(xì)胞加入裂解液提取蛋白，冰上放置40 min，4℃ 12 000 r/min離心40 min，取上清液，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束后100 V電轉(zhuǎn)印至聚偏(二)氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。將PVDF膜放入封閉液中37℃封閉1h，稀釋一抗4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的稀釋二抗孵育，37℃震搖1 h，洗膜。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）曝光成像，掃描入電腦。

1.3.5 Real time Quantitative PCR測定Capsase-3 mRNA表達(dá) 在Genebank搜索到目的基因，用Premier 5設(shè)計(jì)引物并合成。MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa）提取總RNA，按照Prime Scrip RT master Mix kit（TaKaRa）cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系20 μl，其中cDNA 1 μl，上下游引物各0.5μl，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μl，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至20 μl，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min，95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；4℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后采用Mx 3000P real-time PCR system進(jìn)行定量分析。結(jié)果重復(fù)3次，與管家基因β-action進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并與對照組比較后的倍數(shù)值。

1.3.6 ELISA檢測細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞分組：對照組、DEX（10-6mol/L）處理組、PUE（10-8mol/L）處理組、DEX（10-6mol/L）+PUE（10-8mol/L）處理組、SB203580（10-5mol/L）組、SB203580（10-5mol/L）+DEX （10-6mol/L）組，將細(xì)胞以每孔1 ml細(xì)胞懸浮液（1× 104細(xì)胞）接種于24孔板內(nèi)，按住分組的要求，預(yù)處理PUE 24 h、SB203580 3 h后再加入DEX 48 h后，去上清液，加入細(xì)胞0.5ml lysis buffer（室溫30 min），15 000 r/min（室溫10 min），轉(zhuǎn)移上清液20 μl和80 μl immunoreagent（containing anti-histone and anti-DNA）加入streptavidin-coated微孔板（室溫2 h）應(yīng)用incubation buffer洗滌微孔板3次，加入100 μl 的ABTS solution入孔孵育（approx.，室溫15 min），待溶液顯色后測量405 nm的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PUE促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性

MC3T3-E1細(xì)胞在不同濃度的葛根素作用下24 h，MTS法檢測細(xì)胞的吸光度值，MTS結(jié)果顯示葛根素處理后，葛根素增加細(xì)胞的增殖活性（F=26.743，10-7mol/L組的t=2.611，10-8mol/L組的t=2.843，與對照組相比較，P=0.001）。其中10-8mol/L葛根素具有最大的促細(xì)胞增殖作用。見圖1。

2.2 DEX抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性

MC3T3-E1細(xì)胞在不同濃度的DEX作用下48 h，MTS法檢測細(xì)胞的吸光度值，MTS結(jié)果顯示葛根素處理后，DEX能夠抑制細(xì)胞的增殖活性（F= 12.663，10-6mol/L組的t=3.134，10-8mol/L組的t= 2.714，與對照組相比較，P=0.041）。其10-6mol/L的DEX具有最大的抑制細(xì)胞增殖的作用。見圖2。

圖1PUE增加MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性

圖2DEX抑制MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性

2.3PUE抑制MC3T3-E1細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡率：對照組2%，DEX 10-6mol/L 13.1%，DEX 10-6mol/L+PUE 10-8mol/L組5.2%。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入DEX處理48 h后，DAPI染色細(xì)胞核，熒光顯微鏡下可見對照組細(xì)胞的胞核形態(tài)大小較為一致，均勻藍(lán)染，加入地塞米松后細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞核的形態(tài)發(fā)生變化，核膜的皺縮，細(xì)胞核的濃聚，細(xì)胞的核的碎裂，凋亡小體的形成。加入PUE后細(xì)胞凋亡的數(shù)量減少，凋亡受到抑制（見圖3）。

圖3PUE抑制DEX誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡

2.4 PUE抑制DEX誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，加入DEX（10-6M）后，p-p38MAPK的表達(dá)逐漸上調(diào)，60 min時蛋白的表達(dá)最多（t=3.451），與對照組較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.038），PUE處理后，DEX誘導(dǎo)的p-p38MAPK的磷酸化受到抑制（t=2.142），與DEX單獨(dú)處理比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.062），見圖4、5。

圖4DEX誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表

圖5PUE抑制DEX誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表

2.5 PUE抑制DEX處理后的Caspase3的mRNA基因表達(dá)

葛根素（10-7mol/L，10-8mol/L）預(yù)處理24 h后，再加入DEX（10-5mol/L）作用72 h后，Real time quantitivePCR檢測Caspase-3的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，DEX處理后Caspase-3的mRNA基因表達(dá)上調(diào)，而PUE作用后，Caspase-3的mRNA基因表達(dá)較DEX單獨(dú)處理下調(diào)，但略高于對照組的水平（F=0.961，10-7mol/L組的t=7.612，10-8mol/L組的t=6.425），與對照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

Caspase-3，正向引物：5'-TGTGAGGCGGTTGTA GAAGTT-3'，反向引物：5'-GCTGCATCGACATCTGT ACC-3'。β-actin，正向引物：5'-ATCATGTTTGAGA CCTTCAACA-3'，反向引物：5'-CATCTCTTGCTCGAA GTCCA-3'。見圖6。

2.6 p38MAPK通路參與PUE抑制DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的凋亡

圖6 葛根素抑制Caspase-3 mRNA表達(dá)

圖7PUE抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡通過p38MAPK通路

為確定葛根素的作用機(jī)制，ELISA測定加和不加入SB203580（p38MAPK通路的抑制）后對細(xì)胞凋亡情況的影響。結(jié)果顯示，DEX處理后，細(xì)胞的凋亡增加（F=83.970，t=10.001），與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。加入PUE后，細(xì)胞的凋亡受到抑制，基本恢復(fù)到正常的水平（F=83.970，t=3.114），與DEX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），加入SB203580處理后，細(xì)胞凋亡凋亡水平下降（F=83.970，t=2.012），與DEX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.046）。結(jié)果說明加入SB203580后，PUE抑制DEX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用部分被廢除，除p38MAPK通路外還可能存在其他的通路參與PUE調(diào)節(jié)的成骨細(xì)胞凋亡（見圖7）。

3 討論

應(yīng)用自然的植物化學(xué)成分治療骨質(zhì)疏松，越來越多的受到人們的重視。中藥成分具有取材方便、療效穩(wěn)定、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床治療各類疾病。葛根素，是中藥葛根的主要異黃酮，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，抑制成骨細(xì)胞的凋亡[11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制葛根素能夠抑制地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡，通過抑制p38MAPK通路，并能夠抑制Caspase-3的激活。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，包括p38，JNK和ERK1/2（p44/p42）。將外部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，引起細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)，在維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定、增殖、分化和凋亡過程中起著重要的作用。研究顯示，p38MAPK通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、凋亡及應(yīng)對應(yīng)激和細(xì)胞因子的反應(yīng)，參與成骨細(xì)胞的分化、增殖及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13-16]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DEX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，激活p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以此同時，葛根素發(fā)揮其抗成骨細(xì)胞凋亡作用通過抑制該通路發(fā)揮做作用。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化后啟動凋亡信號傳導(dǎo)通路，細(xì)胞外的促凋亡信號通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制能夠引起內(nèi)在的凋亡級聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)源性及外源性的凋亡通路最終都會聚集在Caspase-3，凋亡執(zhí)行的蛋白酶，Caspase-3的激活最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-18]。作為凋亡程序中最后的執(zhí)行者，Caspase-3發(fā)揮重要的樞紐作用，磷酸化的p38MAPK能夠激活Caspase-3的活性，啟動了凋亡通路[19-23]，活化的Caspase-3又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞走向凋亡[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，DEX誘導(dǎo)Caspase-3的激活。加入葛根素后，能夠抑制Caspase-3的激活，說明葛根素發(fā)揮其抗凋亡作用，與抑制Caspase-3的激活有關(guān)。

細(xì)胞凋亡發(fā)生時，由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA，產(chǎn)生180～200 bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。應(yīng)用ELISA法可以特異性的檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。實(shí)驗(yàn)中，為了評價p38MAPK通路在PUE抑制DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的藥理作用，筆者應(yīng)用ELISA法進(jìn)行檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，DEX處理后，細(xì)胞的凋亡增加。加入PUE后細(xì)胞的凋亡受到抑制，基本恢復(fù)到了正常的水平，能夠廢除DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。細(xì)胞預(yù)處理 p38MAPK的特異性抑制劑SB203580后，DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡部分被抑制。說明加入SB203580后能夠降低但不能夠廢除DEX誘導(dǎo)的促成骨細(xì)胞凋亡，也說明p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PUE抑制DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡通路之一，PUE發(fā)揮其抑制凋亡作用，還存在其他的藥理學(xué)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，PUE能夠抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡，通過抑制p38MAPK通路完成。為PUE臨床治療GIOP提供理論基礎(chǔ)。

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Puerarin inhibited MC3T3-E1 human osteoblast clees apoptosis through P38MAPK pathway*

Dong-dong Yu1,Dan-yang Zhao2
(1.Department of Orthopedics,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang,Liaoning 110032,China;2.Department of Neurology,Shenyang First People's Hospital,Shenyang,Liaoning 110041,China)

Objective To detect the mechanism of Puerarin inhibited Dexamethasone-induced MC3TE-E1 cells apoptosis.Methods The MC3TE-E1 cells were cultured and passaged,and MTS and immune fluo rescence were used to detect proliferation effect of different concentration of Puerarin and Dexamethasone in MC3TE-E1 cells and the the protect effect of Puerarin in MC3TE-E1 cells respectively.Western blot was used to detect the p38MAPK,p-p38MAPK protein expression.Realtime PCR were used to detect Caspase-3 gene expression.ELISA detection was used to clarified the anti-apoptotic effect of p38MAPK inhibitior, SB203580,on cells apoptosis.Results MTS results showed that 10-7,10-8mol/L puerarin increased the cell proliferation significantly,and the concentration of DEX at 10-6,10-7mol/L after treatment of 48 h inhibited the cell proliferation.Immunofluorescence results showed that 10-8mol/L puerarin could inhibited DEX-induced cells apoptosis.Western blot results showed after DEX treatment,the expression of p-p38MAPK increased,and after DEX and PUE cotreatment,DEX induced p-p38MAPK phosphorylation was inhibited.Realtime PCRshowed gene expression of Caspase-3 mRNA was up-regulated after DEX treatment,while gene expression of Caspase-3 mRNA down-regulated after cultured with DEX and PUE.ELISA showed that cells apoptosis increased after DEX treatment alone,when combined wit PUE,cells apoptosis was reduced to the normal levels, and when combined SB203580 with DEX,cells apoptosis induced by DEX were abolished partially.Conclusions Puerarin inhibits dexamethasone-induced MC3TE-E1 cells apoptosis through p38MAPK pathway.

Puerarin;Dexamethasone;Apoptosis;P38MAPK

R34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.002

1005-8982（2017）05-0007-06

2015-12-29

遼寧省教育廳（No：L201621）